Methodenartikel

Verwendung von induzierbaren osteoblastischen Abstammungs-spezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Untersuchung des Alveolarknochenumbaus während kieferorthopädischer Zahnbewegung

DOI:

10.3791/65613

⸱

21. Juli 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie stellt ein Protokoll für die Verwendung von induzierbaren Osteoblasten-spezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Untersuchung des Knochenumbaus unter kieferorthopädischer Kraft zur Verfügung und beschreibt Methoden zur Analyse des alveolären Knochenumbaus während kieferorthopädischer Zahnbewegungen, wodurch ein Licht auf die mechanische Biologie des Skeletts geworfen wird.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Alveolarknochen ist mit einer hohen Umsatzrate der am aktivsten umbauende Knochen im Körper. Die kieferorthopädische Zahnbewegung (OTM) ist ein gängiger künstlicher Prozess des Umbaus des Alveolarknochens als Reaktion auf mechanische Krafteinwirkung, aber der zugrunde liegende Mechanismus bleibt schwer fassbar. Bisherige Studien waren aufgrund von Einschränkungen im Tiermodell nicht in der Lage, den genauen Mechanismus des Knochenumbaus zu jeder Zeit und in jedem Raum aufzudecken. Der Signalwandler und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) ist wichtig für den Knochenstoffwechsel, aber seine Rolle in Osteoblasten während der OTM ist unklar. Um in vivo den Nachweis zu erbringen, dass STAT3 zu bestimmten Zeitpunkten und in bestimmten Zellen während der OTM an der OTM beteiligt ist, haben wir ein Tamoxifen-induzierbares Osteoblastenlinien-spezifisches Stat3-Knockout-Mausmodell generiert, kieferorthopädische Kraft angewendet und den alveolären Knochenphänotyp analysiert.

Mikro-Computertomographie (Micro-CT) und Stereomikroskopie wurden verwendet, um die OTM-Distanz zu erfassen. Die histologische Analyse wählte den Bereich, der sich innerhalb von drei Wurzeln des ersten Molaren (M1) im Querschnitt des Oberkieferknochens befindet, als Region of Interest (ROI) aus, um die metabolische Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten zu bewerten, was auf die Wirkung der kieferorthopädischen Kraft auf den Alveolarknochen hinweist. Kurz gesagt, wir stellen ein Protokoll für die Verwendung von induzierbaren osteoblastenspezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Verfügung, um den Knochenumbau unter kieferorthopädischer Kraft zu untersuchen und Methoden zur Analyse des alveolären Knochenumbaus während der OTM zu beschreiben und so ein neues Licht auf die mechanische Biologie des Skeletts zu werfen.

Einleitung

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Es ist allgemein bekannt, dass Knochen während des gesamten Lebens als Reaktion auf mechanische Kräfte nach dem Wolffschen Gesetz 1,2 ständig rekonstruiert werden. Geeignete mechanische Stimulation, wie Schwerkraft und tägliche Bewegung, erhalten Knochenmasse und -stärke und beugen Knochenschwund vor, indem sowohl Osteoblasten als auch Osteoklasten stimuliert werden. Osteoklasten, die für den Knochenabbau verantwortlich sind 3,4,5,6,7, und Osteoblasten, die für die Knochenbildung verantwortlich sind 8,9,10, halten die Knochenhomöostase aufrecht und fungieren gemeinsam im biologischen Prozess des Knochenumbaus. Im Gegensatz dazu erleiden die Knochen in Abwesenheit von Belastungsreizen, wie bei Astronauten in der Langzeit-Schwerelosigkeit, einen Verlust der Knochenmineraldichte um 10 %, was das Risiko für Osteoporose erhöht11,12. Darüber hinaus haben sich nicht-invasive und bequeme mechanische Therapien, einschließlich Kieferorthopädie und Distraktionsosteogenese, als Behandlung von Knochenerkrankungen herauskristallisiert13,14. All dies hat gezeigt, dass mechanische Kraft eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Knochenqualität und -quantität spielt. Neuere Studien analysierten im Allgemeinen den Knochenumbau als Reaktion auf mechanische Belastung mit zeitaufwändigen Modellen wie Laufrad- und Heckaufhängungstests, die in der Regel 4 Wochen oder länger dauerten, um die Kraftbelastung oder -entlastung zu simulieren15,16. Daher besteht Bedarf an einem bequemen und effizienten Tiermodell für die Untersuchung des Knochenumbaus, der durch Kraftbelastung angetrieben wird.

Der Alveolarknochen ist mit einer hohen Turnover-Rate am aktivsten in Bezug auf den Knochenumbau17. Die kieferorthopädische Zahnbewegung (OTM), eine gängige Behandlung von Zahnfehlstellungen, ist ein künstlicher Prozess des Umbaus des Alveolarknochens als Reaktion auf mechanische Krafteinwirkung. OTM, das einen schnellen Knochenumbau induziert18, ist jedoch auch eine zeitsparende Methode, um die Auswirkungen mechanischer Kraft auf den Knochenumbau im Vergleich zu anderen Modellen mit einer langen Versuchszeit zu untersuchen. Daher ist OTM ein ideales Modell, um den Knochenumbau unter mechanischen Stimuli zu untersuchen. Es ist erwähnenswert, dass der Mechanismus des alveolären Knochenumbaus oft zeitkritisch ist und es notwendig ist, die Veränderungen des alveolären Knochenumbaus zu bestimmten Zeitpunkten nach der Modellierung zu beobachten. Mit den doppelten Vorteilen der zeitlichen und räumlichen Kontrolle der DNA-Rekombination und der Gewebespezifität ist ein induzierbares bedingtes Gen-Knockout-Mausmodell eine geeignete Wahl für OTM-Studien.

Konventionell wurde der OTM-vermittelte alveoläre Knochenumbau in Spannungszonen mit Knochenbildung und Druckzonen mit Knochenresorption unterteilt 19,20,21, was detaillierter, aber schwer zu regulieren ist. Darüber hinaus berichteten Yuri et al., dass sich der Zeitpunkt der Knochenbildung bei OTM auf der Zug- und Kompressionsseite unterschied22. Darüber hinaus hatte eine frühere Studie gezeigt, dass der erste Molar unter kieferorthopädischer Kraft, die nicht auf die Spannungs- und Druckzonen beschränkt war, einen breiten Umbau des Oberkieferalveolarknochens einleiten konnte23. Daher wählten wir den Bereich, der sich innerhalb von drei Wurzeln von M1 im Querschnitt des Oberkieferknochens befindet, als Region of Interest (ROI) und beschrieben Methoden zur Bewertung der Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten im selben Bereich, um den alveolären Knochenumbau unter OTM zu bewerten.

Als nukleärer Transkriptionsfaktor hat sich der Signalwandler und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) als entscheidend für die Knochenhomöostase erwiesen24,25. Frühere Studien berichteten über eine geringe Knochenmineraldichte und rezidivierende pathologische Frakturen bei Stat3-mutierten Mäusen26,27. Unsere frühere Studie zeigte, dass die Deletion von Stat3 in Osx+-Osteoblasten zu kraniofazialen Fehlbildungen und Osteoporose sowie zu spontanen Knochenbrüchen führte28. Kürzlich haben wir in vivo Beweise mit einem induzierbaren Osteoblasten-spezifischen Stat3-Deletions-Mausmodell (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, im Folgenden Stat3Col1α2ERT2) genannt), dass STAT3 entscheidend für die Vermittlung der Effekte der kieferorthopädischen Kraft ist, die den Umbau des Alveolarknochens antreibt29. In dieser Studie stellen wir Methoden und Protokolle für die Verwendung von induzierbaren osteoblastenlinienspezifischen Stat3-Knockout-Mäusen zur Verfügung, um den Knochenumbau unter kieferorthopädischer Kraft zu untersuchen und Methoden zur Analyse des alveolären Knochenumbaus während der OTM zu beschreiben und so die mechanische Biologie des Skeletts zu beleuchten.

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Protokoll

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Alle hier beschriebenen Methoden mit Tieren wurden von der Ethikkommission des Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (Nr. 82101048) genehmigt.

1. Etablierung induzierbarer Osteoblasten-spezifischer Stat3-Knockout-Mäuse

ANMERKUNG: Stat3 fl/fl Mäuse wurden kommerziell gewonnen; der Col1α2CreERT2-Stammwar ein Geschenk (siehe Materialtabelle für alle Details). Für alle Tiere wurden standardisiertes Laborpelletfutter und -wasser sowie Standard-Laborumgebungsbedingungen (Raumtemperatur bei 22 °C bis 26 °C und Luftfeuchtigkeit bei 50 % bis 55 %) bereitgestellt.

  1. Setze eine geschlechtsreife männliche Maus mit zwei weiblichen Mäusen in denselben Käfig. Nach 18 Tagen sollten Sie jeden Tag nach Neugeborenen suchen. Bringen Sie trächtige weibliche Mäuse in einen leeren Käfig und halten Sie sie bei Bedarf alleine. Setzen Sie männliche Mäuse in andere Zuchtkäfige, wenn die weiblichen Mäuse nicht innerhalb von 30 Tagen trächtig sind.
  2. Stat3fl/+ generieren; Col1α2 CreERT2 Mäuse durch Hybridisierung von Stat3 fl/ fl Mäusen mit Col1α2CreERT2 Mäusen; alle diese Mäuse auf dem C57BL/6-Hintergrund zu belassen. Sammeln Sie 2-5 mm Schwanzspitzen für die Genotypisierung und behalten Sie das Männchen Stat3fl/+; Col1α2CreERT2 Mäuse bis zur Geschlechtsreife (F1).
  3. Hybridisieren Sie 6 Wochen alte Rüden Stat3fl/ +; Col1α2CreERT2 Mäuse mit weiblichen Stat3 fl/fl Mäusen. Sammeln Sie 2-5 mm Schwanzspitzen, wenn die Mäuse 2 Wochen alt sind, für die Genotypisierung, und behalten Sie das Männchen Stat3 fl/ fl; Col1α2 CreERT2(Stat3,Col1α2ERT2) Mäuse bis zur Geschlechtsreife (F2).
  4. Hybridisierung des 6 Wochen alten Rüden Stat3 fl/ fl; Col1α2CreERT2 Mäuse mit weiblichen Stat3 fl/fl Mäusen (F3). Sammeln Sie 2-5 mm Schwanzspitzen, wenn die Mäuse 2 Wochen alt sind, um die Genotypisierung durchzuführen, und verwenden Sie die jüngeren Mäuse desselben Genotyps, um ältere Zuchtmäuse zu ersetzen, wenn dies angemessen ist (F3+N).
    HINWEIS: Die Fortpflanzungsfähigkeit von Mäusen nimmt nach dem Alter von 8 Monaten ab, daher müssen die Mäuse in den Zuchtkäfigen sorgfältig überwacht und bei Bedarf ersetzt werden. Darüber hinaus sollte entsprechend den experimentellen Anforderungen die Anzahl der Zuchtkäfige entsprechend erhöht werden, um das Aussterben der Zielgenmäuse zu vermeiden.

2. Induzierbare Deletion von Stat3 in Col1α2-exprimierenden Osteoblasten durch Tamoxifen

  1. Tamoxifen in Maisöl auf 20 mg/ml in einem Zentrifugenröhrchen auflösen und durch Einwickeln in Folie vor Licht schützen. Das mit Folie überzogene Zentrifugenröhrchen auf einen Rotationsmischer stellen und bei Raumtemperatur mischen, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
    HINWEIS: Tamoxifen wurde kommerziell gewonnen und im Dunkeln bei 4 °C gelagert.
  2. Wählen Sie zehn 6 Wochen alte männliche Mäuse aus und teilen Sie sie in Stat3fl/fl - und Stat3Col1α2ERT2-Gruppen mit fünf Mäusen in jeder Gruppe ein. Tamoxifen (100 mg·kg-1·KG) alle 2 Tage für 1 Woche durch intraperitoneale Injektion verabreichen.

3. Modell der kieferorthopädischen Zahnbewegung (OTM)

  1. Bereiten Sie eine sterilisierte Kunststoff-Maus-Dissektionsplattform als Operationstisch vor, um die Mäuse zu immobilisieren.
    HINWEIS: Der Maus-Seziertisch wurde kommerziell erworben und bestand aus vier verstellbaren Gummipfosten und einem Metallstab zur Immobilisierung der Mäuse. Verwenden Sie während des gesamten Eingriffs sterile Instrumente und Werkzeuge.
  2. Befestigen Sie an jedem Gummipfosten ein Gummiband zur Fixierung der Gliedmaßen.
  3. Binden Sie ein Gummiband zwischen die beiden oberen Gummipfosten; Binden Sie einen Faden an das Gummiband, um die unteren Schneidezähne zu halten. und binden Sie einen weiteren Faden an die Metallstange, um die oberen Schneidezähne zu halten.
  4. 7 Wochen alte männliche Mäuse werden vor der Operation mit 0,1 ml Lösung von Dexmedetomidinhydrochlorid (0,1 mg·kg-1·bw) und Zoletil (Tiletaminhydrochlorid für 20 mg·kg-1·bw und Zolazepamhydrochlorid für 20 mg·kg-1·bw) anästhesiert, die durch intraperitoneale Injektion in Kochsalzlösung gelöst wurden. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse während der gesamten Operation unter ordnungsgemäßer Narkose stehen.
    HINWEIS: Achten Sie auf das Datum der effektiven Verwendung von Medikamenten und verwenden Sie keine abgelaufenen Medikamente.
  5. Vergewissern Sie sich, dass die Mäuse unter ordnungsgemäßer Narkose stehen, indem Sie die Zehen der Hinterbeine mit den Fingern zusammendrücken.
    HINWEIS: Wenn die Mäuse nicht auf den Test ansprechen, bedeutet dies, dass sie bewusstlos sind und die Anästhesie die gewünschte Tiefe erreicht hat. Zu diesem Zeitpunkt befinden sich die Mäuse in einem Zustand der Entspannung der Gliedmaßenmuskulatur mit gleichmäßiger Atmung und Herzfrequenz, und die Operation kann begonnen werden.
  6. Verwenden Sie Tiersalbe auf den Augen der Mäuse, um Trockenheit zu verhindern, und legen Sie die betäubte Maus in Rückenlage auf den Operationstisch. Verwenden Sie vier elastische Bänder an den Gummipfosten, um die Gliedmaßen zu fixieren, einen Faden, der an der Metallstange befestigt ist, um die oberen Schneidezähne zu halten, und einen weiteren, der an einem Gummiband zwischen den beiden oberen Gummipfosten befestigt ist, um die unteren Schneidezähne einzuhaken, um den Unterkiefer offen zu halten.
  7. Bereiten Sie geschlossene Schraubenfedern (0,25 mm Drahtstärke, 0,76 mm Durchmesser, 1 mm Länge) für die kieferorthopädische Kraftapparatur vor.
    HINWEIS: Schneiden Sie für jede Maus acht Federfäden ab. Vier Fäden von 1 mm Länge in der Mitte für die Kraftaufrüstung und zwei Fäden an jedem Ende für die Ligaturierung mit Stahlligaturdraht.
  8. Ligatieren Sie ein Ende der Feder, das auf den linken ersten Backenzahn des Oberkiefers vorbereitet ist. Das andere Ende des mittleren Schneidezahns wird mit einem 0,1 mm dicken Stahlligaturdraht ligiert, der mit lichthärtendem Restaurationsharz verstärkt ist, nachdem die Schneidezähne mit dem Wattenstäbchen mit Klebstoff versehen wurden, um eine stabile Kraft von 10 g zu erzeugen, die mit einem Dynamometer gemessen wird.
  9. Nach Beendigung der Operation setzen Sie die Mäuse in einen Käfig mit anderen Mäusen desselben Stammes, um sich zu erholen, oder setzen Sie jede Maus allein in einen leeren Käfig. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis sie 2-4 Stunden nach der Operation wieder zu Bewusstsein gekommen sind, um das Brustbeinliegen aufrechtzuerhalten. Füttern Sie die Mäuse in den nächsten Tagen mit einer weichen Diät und beobachten Sie sie regelmäßig, um sicherzustellen, dass keine Komplikationen auftreten und um den Grad der postoperativen Schmerzen festzustellen. Verabreichen Sie bei Bedarf Analgetika.
    HINWEIS: Mäuse, die sich einer Operation unterzogen haben, sollten nicht in die Gesellschaft anderer Mäuse zurückgebracht werden, bis sie sich vollständig erholt haben. Setzen Sie postoperative Mäuse nicht mit Mäusen zusammen, die nicht betäubt sind. Mäuse müssen während der Genesung warm gehalten werden.
  10. Kontrollieren Sie die kieferorthopädische Apparatur täglich und schließen Sie Versuchsmäuse mit Dislokation aus.

4. Probenentnahme

  1. Euthanasieren Sie die Mäuse zu drei verschiedenen Zeitpunkten durch Zervixluxation: 4 Tage (d4), 7 Tage (d7) und 10 Tage (d10) nach Beginn der OTM.
  2. Schneiden Sie mit einer Augenschere die Haut senkrecht von der Halswirbelsäule ab und trennen Sie dann den Kopf vom Körper, wobei die gesamte Haut des Kopfes präpariert wird.
  3. Schneiden Sie die Haut und die Buccinator-Muskeln vom bilateralen Angulus oris bis zum hinteren Bereich des Unterkiefers ab. Trennen Sie die bukkalen Muskeln und die Sehnen, die an den Coracoiden befestigt sind, vollständig, um den Unterkiefer zu entfernen und zusätzliche Knochen zu trimmen, um einen vollständigen Oberkiefer zu erhalten. Entfernen Sie dann den Knochen hinter den beidseitigen dritten Backenzähnen und reißen Sie die Gaumenschleimhaut ab. Zum Schluss trennen Sie die kieferorthopädische Apparatur und schneiden den Knochen zwischen den Schneidezähnen entlang der mittleren Gaumennaht ab, um den Alveolarknochen der rechten und linken Seite zu erhalten.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Bereich von den Schneidezähnen bis zum dritten Backenzahn auf beiden Seiten intakt bleibt.

5. Vorbereitung für den Paraffinschnitt

  1. Fixierung: Tauchen Sie den entnommenen Alveolarknochen für 48 Stunden in 4%iges Paraformaldehyd und schneiden Sie ihn mit einer Augenschere in den Abzug für die Abschnitte 6 und 7.
  2. Entkalkung: Proben 3 x 10 min schonend mit 1x PBS waschen. Entkalken Sie die Proben 5 Wochen lang in einem universellen Gewebefixiermittel (pH 8,0), das alle 2 Tage durch eine frische Lösung ersetzt wird, bis die Knochen leicht mit einer Nadelspitze durchdrungen werden können.
  3. Dehydrierung: Waschen Sie die Proben 3 x 10 Minuten lang in 1x PBS und tauchen Sie sie dann nacheinander für jeweils 2 x 1 h in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und Xylol.
  4. Die Proben werden 30 min lang in eine 1:1-Mischung aus Xylol und Paraffin und dann über Nacht in Paraffin bei 65 °C getaucht.
  5. Einbettung: Wählen Sie geeignete Einbettbehälter aus. Platzieren Sie den Alveolarknochen gleichmäßig mit den Zähnen auf gleicher Höhe. Nehmen Sie die Proben aus dem Einbettbehälter und geben Sie sie in einen Gefrierschrank bei -20 °C, und nummerieren Sie sie, wenn das Paraffin vollständig abgekühlt und fest ist.
  6. Mit einem Mikrotom zwanzig bis vierzig 4 μm dicke Abschnitte kontinuierlich in die Querebene schneiden und auf 37 °C heißem Wasser schwimmen. Die Schnitte auf Objektträger kleben und bei 42 °C über Nacht backen.

6. OTM-Entfernungsmessung

  1. Fotografieren Sie Proben von drei Zeitpunkten vertikal von der Okklusionsebene aus mit Stereomikroskopie.
  2. Scannen Sie den Alveolarknochen mit einem Mikro-CT-Scanner. Rekonstruieren Sie 3D-Bilder der maximalen Sagittalebene des Oberkieferknochens, in der drei Molaren vollständig sichtbar sind, mit der unterstützenden Software des Scanners gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  3. Messen Sie den OTM-Abstand mit der ImageJ-Software:
    1. Öffnen Sie die ImageJ-Software und verwenden Sie das Werkzeug Gerade Linie , um ein Liniensegment mit bekanntem Abstand zu erstellen.
    2. Klicken Sie auf "Analysieren" und wählen Sie "Maßstab festlegen", um den Wert des gezeichneten Linienabstands in "Bekannte Entfernung" und Einheiten in "Längeneinheit" einzugeben.
    3. Ziehen Sie eine Linie zwischen den Mittelpunkten des mesialen Marginalkamms von M2 und dem distalen Marginalkamm von M1, und klicken Sie auf Messung. Die in der Spalte Länge angezeigten Ergebnisse stellen die OTM-Entfernung dar.

7. Histologische Analyse

  1. Auswahl der Region of Interest (ROI): Definieren Sie den Alveolarknochen des ersten Molaren (M1) als ROI, der sich genau innerhalb von drei Wurzeln von M1 im Querschnitt am Oberkieferknochen befindet. Diese Region erreicht nicht nur den kortikalen Knochen des ersten Molaren in bukkal-lingualer Richtung, sondern erstreckt sich auch bis zur Mitte der Längsachse der mesiobukkalen Wurzel, einschließlich des halben Bereichs zwischen der distobukkalen Wurzel und der palatinalen Wurzel.
  2. Analyse der Osteogenese
    1. Doppelte Kennzeichnung und Analyse von Calcein und Alizarinrot
      1. Calcein- und Alizarinrot-Zubereitung: Calcein in 2%igerNaHCO-3-Lösung auf 1 mg/ml und Alizarinrot S inH2Oauf 2 mg/ml auflösen.
        HINWEIS: In dieser Studie wurden Calcein und Alizarinrot kommerziell gewonnen.
      2. Verabreichen Sie Calcein (20 mg·kg-1·bw) an Tag 1 und Alizarinrot S (40 mg·kg-1·bw) an Tag 8 durch intraperitoneale Injektion nach Beginn der OTM. Euthanasieren Sie die Mäuse an Tag 10 und entnehmen Sie den Alveolarknochen.
      3. Bereiten Sie die Proben vor und betten Sie sie gemäß den Schritten 5.1 und 5.3-5.5 ein. Weitere Informationen finden Sie bei Yang et al.30.
      4. Schneiden Sie mit einem Rotationsmikrotom kontinuierlich 5 μm dicke Abschnitte in der Querebene. Kleben Sie die Schnitte auf Objektträger und befestigen Sie sie mit Deckgläsern aus neutralem Balsam.
        HINWEIS: Der Rest der Proben muss mit Trockenmittel bei Raumtemperatur gelagert werden.
      5. Die Schnitte werden unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht und fotografiert und die Mineralappositionsrate (MAR) und die Knochenbildungsrate (BFR/BS) nach der zuvor beschriebenen Methode berechnet30.
    2. Immunfluoreszenz
      1. Geeignete Paraffinabschnitte auswählen und bei 65 °C 30 min backen.
      2. Entwachsung: Tauchen Sie die Partien 5 Minuten lang in Xylol und wiederholen Sie den Vorgang zweimal mit frischem Xylol.
      3. Rehydrierung: Tauchen Sie die Abschnitte nacheinander für jeweils 5 Minuten in 95 % Ethanol, 75 % Ethanol, 50 % Ethanol und ddH2O.
      4. Waschen Sie die Partien vorsichtig mit 1 x PBS für 2 x 5 Minuten.
      5. Antigengewinnung: Die Schnitte werden in eine Mischung aus Tris-HCl (0,05 m, pH 8,0), EDTA (0,01 m, pH 8,0) und Protease K (10 μg/ml) inddH2Ogetaucht und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
      6. Waschen Sie die Partien vorsichtig mit 1 x PBS für 3 x 5 min.
      7. Block: Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Abschnitten und ziehen Sie mit einem hydrophoben Marker einen Kreis um den Zielbereich. Um die unspezifische Bindung zu blockieren, mit einem Blockierungspuffer mit 10 % Rinderserumalbumin abdecken und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
        HINWEIS: Achten Sie darauf, die Abschnitte nicht zu lange zu trocknen, um das Ergebnis nicht zu beeinträchtigen.
      8. Primäre Antikörperinkubation: Verdünnen Sie den Anti-Osteopontin-Antikörper (OPN) mit dem Antikörperverdünnungsmittel auf die empfohlene Konzentration und fügen Sie jeder Probe 30-50 μl hinzu. bei 4 °C über Nacht in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
        HINWEIS: Achten Sie darauf, etwas Wasser in der Kammer zu lassen und sie abzudecken, um zu verhindern, dass die Antikörperflüssigkeit verdunstet.
      9. Waschen Sie die Partien vorsichtig mit 1 x PBS für 3 x 10 min.
        HINWEIS: Die Schritte 7.2.2.10-7.2.2.12 sollten im Dunkeln ausgeführt werden.
      10. Inkubation fluoreszierender Sekundärantikörper: Wählen Sie einen geeigneten fluoreszierenden Sekundärantikörper aus, der dem Primärantikörper entspricht, und verdünnen Sie ihn auf die empfohlene Konzentration. Zu jeder Probe 30-50 μl geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
      11. Waschen Sie die Partien vorsichtig mit 1 x PBS für 2 x 10 min.
      12. Verwenden Sie ein Antifade-Eindeckmedium mit 4'6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), um die Proben zu montieren. Bewahren Sie die Abschnitte im Dunkeln auf und fotografieren Sie sie so schnell wie möglich.
      13. Führen Sie eine Fluoreszenzmikroskopie mit einer Digitalkamera durch, um die Abschnitte zu untersuchen und zu fotografieren und positive Zellen in den interessierenden Regionen (ROIs) zu zählen.
  3. Analyse der Osteoklastogenese
    1. Färbung der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP)
      1. Wählen Sie geeignete Paraffinabschnitte aus. Wachs und rehydrieren Sie die Schritte 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. Frische Färbelösung mit dem TRAP-Färbekit nach Herstellerangaben zubereiten und auf 37 °C vorheizen.
      3. Zu jeder Probe 30-50 μl Färbelösung geben und bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer 20-30 Minuten inkubieren. Kontrollieren Sie alle 5 Minuten, bis unter dem Lichtmikroskop rote mehrkernige Osteoklasten zu sehen sind. Stoppen Sie die Reaktion mit ddH2O.
      4. 30 s lang in Hämatoxylinlösung einfärben und 1 Minute lang in 1%ige Ammoniaklösung eintauchen, um eine stabile blaue Farbe zu erzielen. Unter langsam fließendem Leitungswasser abspülen.
      5. Montieren Sie die Abschnitte mit Deckgläsern aus neutralem Balsam und trocknen Sie sie über Nacht.
      6. Nehmen Sie Fotos unter einem Mikroskop auf und zählen Sie die Anzahl der TRAP-positiven Zellen mit mehr als drei Kernen, gemäß unserem vorherigen Protokoll30.
    2. Immunfluoreszenz: Verwenden Sie Cathepsin K (CTSK)-Antikörper in der empfohlenen Konzentration für die Immunfluoreszenz und befolgen Sie das in Abschnitt 7 beschriebene Protokoll.

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Ergebnisse

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Unter Verwendung dieses Protokolls haben wir ein induzierbares osteoblastenspezifisches Stat3-Knockout-Mausmodell (Stat3Col1α2ERT2) etabliert, um die Auswirkungen der STAT3-Deletion auf den kieferorthopädischen, kraftgetriebenen alveolären Knochenumbau zu untersuchen (Abbildung 1A,B). Die STAT3-Deletion in Osteoblasten wurde durch Immunfluoreszenzfärbung des Alveolarknochens bestätigt (Abbildung 1C).

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Da Zahnfehlstellungen zu den häufigsten oralen Erkrankungen gehören, die die Atmung, das Kauen, das Sprechen und sogar das Aussehen beeinträchtigen, steigt die Nachfrage nach Kieferorthopädie von Tag zu Tag, wobei die Inzidenz laut einer früheren epidemiologischen Umfrage von 70 % auf 93 % steigt31,32. Wie der alveoläre Knochenumbau beschleunigt werden kann, um die Effizienz der kieferorthopädischen Behandlung sicher zu steigern, ist zu einem heißen Thema in dies...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949) unterstützt. die Natural Science Foundation of Shanghai (21ZR1436900, 22ZR1436700); das Programm des Shanghai Academic/Technology Research Leader (20XD1422300); Klinischer Forschungsplan des SHDC (SHDC2020CR4084); der interdisziplinäre Forschungsfonds des Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYJC201902, JYJC202116); das Innovationsforschungsteam der High-Level Local Universities in Shanghai (SSMUZLCX20180501); Der Forschungsdisziplinfonds Nr. KQYJXK2020 vom Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine und College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University; Ursprüngliches Explorationsprojekt des Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYYC003); Zweihundert-Talente-Projekt der Medizinischen Fakultät der Shanghai Jiao Tong Universität; das kooperative Forschungsprojekt des Instituts für Biomaterialien und regenerative Medizin Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (2022LHB02); das Projekt der Biobank des Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (YBKB201909, YBKB202216).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1x PBSBeijing Solarbio Wissenschaft & Technology Co., Ltd. P1020
4% ParaformaldehydWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101
Alizarin rotSigma-AldrichA5533
Anti-CTSK AntikörperSanta Cruzsc-48353
Anti-OPN AntikörperR& D Systems, Minneapolis, MN, USAAF808
CalceinSigma-AldrichC0875
Geschlossene SchraubenfedernInnovatives Material und Geräte, Shanghai, ChinaCS1006B
Col1α 2CreERT2 MäuseEin Geschenk von Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinesische Akademie der Wissenschaften.
DexmedetomidinhydrochloridOrionintie Corporation, Orion Pharma Espoo Standort
EDTABeyotime BiotechanologyST069
EinbetttanksCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd80106-1100-16
EthanolSinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd.
ImageJ SoftwareNIH, Bethesda, MD, USA
Einbettmedium mit DAPIBeyotime BiotechanologyP0131
Maus-DissektionsplattformShanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd.HK105
ParaffinSangon Biotech Co., Ltd.
Primer für die GenotypisierungStat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease KSigma-Aldrich539480
Selbsthärtendes Restaurationsharz3M ESPE, St. Paul, MN, USA712-035<
em>Stat3fl/fl miceGemPharmatech Co., LtdD000527
TamoxifenSigma-AldrichT5648
TRAP FärbekitSigma-Aldrich387A
Tris-HClBeyotime BiotechanologyST780
Universelles GewebefixiermittelWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1105
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Referenzen

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