Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Isolierung und Identifizierung von Limbus-Nischenzellen

1.9K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/65618

⸱

27. Oktober 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Identifizierung der menschlichen Limbus-Nischenzellen vor.

Zusammenfassung

Hier berichten wir über ein Standardverfahren zur Isolierung und Identifizierung von limbalen Nischenzellen (LNCs). Limbusgewebe aus einer Augenbank wurde für die Isolierung von LNCs verwendet. Das Gewebe wurde unter aseptischen Bedingungen in 12 Stücke geteilt und 18 h bei 37 °C im Zellkultur-Inkubator unter Verwendung von Kollagenase A aufgeschlossen, um Zellcluster mit LNCs und limbalen Epithel-Vorläuferzellen zu erhalten. Die Zellcluster wurden 15 Minuten lang bei 37 °C unter Verwendung von 0,25 % Trypsin-EDTA verdaut, um Einzelzellen zu erhalten, und dann in modifiziertem embryonalem Stammzellmedium (MESCM) auf einer mit 5 % Matrigel beschichteten Kunststoffoberfläche kultiviert. Die Zellen wurden bei 70%iger Konfluenz durchgelassen und LNCs wurden mittels Immunfluoreszenz, quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) und Durchflusszytometrie identifiziert. Primäre LNCs wurden isoliert und mehr als 12 Mal durchquert. Die Proliferationsaktivität von LNCs von P4 bis P6 war am höchsten. LNCs exprimierten höhere Stammzellmarker als BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR und PDGFRβ). Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass P4-LNCs einheitlich VIM, CD90, CD105 und PDGFRβ exprimierten, jedoch nicht Pan-CK, was als Marker für die Identifizierung von LNCs verwendet werden könnte. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass etwa 95 %, 97 %, 92 % und 11 % der LNCs CD73, CD90, CD105 bzw. SCF exprimierten, während sie bei BMMSCs 68 %, 99 %, 20 % und 3 % exprimierten. Das Standardverfahren zur LNC-Isolierung und -Identifizierung könnte eine zuverlässige Laborgrundlage für den weit verbreiteten Einsatz von LNCs bieten.

Einleitung

Die Inzidenz von Hornhautepithelzellmangel (CESD), auch Limbusstammzellmangel (LSCD)1 genannt, und Hornhautepithelregeneration (CES) wird aufgrund von Hornhautinfektionen und -verletzungen immer dringlicher. Wenn CESD nicht richtig behandelt wird, kann sie zur Erblindung führen, die eine Hornhauttransplantation erfordert. Dadurch gewinnt die CES-Regeneration an Bedeutung. Es gibt eine Gruppe von unterstützenden Zellen, die als limbale Nischenzellen (LNCs) bezeichnet werden und eine wesentliche Unterstützung für die CES-Funktion bieten. Limba-Stroma-Stammzellen wurden zuerst von Polisetty et al.2 isoliert und von Xie et al.3 als LNCs identifiziert, die im Limbusepithel und Stroma des Limbus lokalisiert sind. LNCs sind die wichtigsten unterstützenden Stammzellen des Hornhautrandes und könnten mit der Funktion von MSC aus dem Knochenmark (BMMSCs) dazu gebracht werden, sich zu Hornhautepithelzellen und Hornhautstromazellen usw. zu entwickeln.3,4,5,6,7. Frühere Studien zeigten, dass die Stammzellqualitäten von LNCs primitiver sind als die von BMMSCs8, die in der Klinik bereits weit verbreitet sind. LNCs könnten sogar die nächste praktikable Option nach MSC werden, insbesondere für die Behandlung von CESD. Als wichtige Stützzellen für CES sind LNCs auch Stammzellen, die aus der "Nischen"-Struktur des Limbus stammen. LNCs könnten eine Schlüsselrolle bei der Dedifferenzierung reifer Hornhautepithelzellen (MCEC) zu CES9 spielen. Die Studien zu LNCs sind jedoch noch relativ unzureichend, und es gibt keinen Konsens über die Terminologie, die Isolierung, die Reinigung, die Identifizierung und die Eigenschaften von LNCs. Einige Forscher haben LNCs aus der Limbusbiopsie gewonnene stromale Stammzellen10, limbale mesenchymale Stammzellen 11, limbale Fibroblasten-Stammzellen 12 und limbale mesenchymale Stromazellen13 genannt. Da die Wachstumseigenschaften von LNCs noch nicht im Detail beschrieben wurden und aufgrund ihrer vielversprechenden wissenschaftlichen und klinischen Anwendungen in Zukunft eines der wichtigsten klinischen Werkzeuge sein könnten, ist es notwendig, die Isolierung, Aufreinigung, Identifizierung und Eigenschaften von LNCs zusammenzufassen.

Laut einer früheren Studie14 sind LNCs hauptsächlich am Limbusepithel und Stroma des Limbus vorhanden. Dieses Protokoll umfasst die Behandlung von Limbusgewebe mit Kollagenase A, die Gewinnung eines Clusters aus LEPC und LNCs und die Verdauung in einzelne Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA (TE). LNCs wurden dann selektiv in einem modifizierten embryonalen Stammzellmedium (MESCM) kultiviert, um gereinigt zu werden. Das Protokoll, über das in diesem Artikel berichtet wird, ist einfach und hat eine hohe Effizienz bei der Gewinnung menschlicher LNCs in großen Mengen.

Das detaillierte Verfahren der LNC-Isolierung, -Kultur und -Identifizierung wurde in dem Video für Wissenschaftler aufgezeichnet, die an einer LNC-Studie interessiert sind, und kann bei Bedarf bequem wiederholt werden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Limbusgewebe von Spendern im Alter zwischen 50 und 60 Jahren wurde von der Augenbank des Roten Kreuzes im Tongji-Krankenhaus (Wuhan, China) gewonnen. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der Tongji genehmigt und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

1. Isolierung

  1. Gewinnen Sie Limbusgewebe aus einem mittelfristigen Hornhautspeichermedium und arbeiten Sie unter aseptischen Bedingungen auf einer ultrareinen Werkbank.
  2. Kratzen Sie die Iris und das Endothel um die Hornhaut herum mit einer sterilen chirurgischen Rundklinge ab und entfernen Sie sie.
  3. Schneiden Sie Limbusgewebe in zwölf gleich große Stücke mit einer chirurgischen Klinge, die auf beiden Seiten der Hornhaut und der Sklera noch 1 mm beträgt.
  4. Limbusgewebe auf eine 3,5 cm große Kulturplatte übertragen, 1 ml Kollagenase A (2 mg/ml, in DF-12-Medium) hinzufügen, um das gesamte Gewebe für die Verdauung einzutauchen.
  5. Die Platte in den 37 °C warmen Zellinkubator geben, das Limbusgewebe 18 h lang verdauen.
    HINWEIS: Nachsorgeuntersuchungen werden in der Regel am zweiten Tag durchgeführt.
  6. Bereiten Sie eine 5%ige Basalmembranmatrix (Matrigel) beschichtete 6-Well-Kulturplatte vor.
    1. Schicht 5% Basalmembranmatrix (gelöst in MESCM [Tabelle 1]) am Boden der Bohrung.
    2. Bereiten Sie 200-μl- und 1-ml-Spitzen, ein 15-ml-Zentrifugalröhrchen und eine 6-Well-Platte in einem sterilisierten Beutel vor.
    3. Stellen Sie den sterilisierten Beutel (einschließlich Spitzen und Zentrifugalröhrchen) und eine neue 6-Well-Platte für 20 Minuten in eine Umgebung von -20 °C oder -80 °C. Die Kellermembranmatrix im Kühlschrank bei 4 °C auftauen.
    4. Nehmen Sie die vorgekühlten Spitzen, das Zentrifugalröhrchen und die 6-Well-Platte aus der Umgebung von -20 °C oder -80 °C heraus und führen Sie dann die folgenden Vorgänge auf der ultrareinen Werkbank durch.
    5. 50 μl 5%ige Basalmembranmatrix mit einer 200-μl-Spitze auf 1 mL MESCM übertragen und vorsichtig und gleichmäßig mischen.
    6. 5%ige Basalmembranmatrix (gelöst in MESCM) mit der vorgekühlten 1-ml-Spitze in eine Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte übertragen.
    7. Schütteln Sie die 6-Well-Platte vorsichtig und horizontal, legen Sie die 6-Well-Kulturplatte für ca. 1 h in den 37 °C-Zellinkubator und führen Sie dann den nächsten Schritt durch.
  7. Nach 18-stündiger Verdauung Kollagenase A-verdautes Limbusgewebe entfernen, es bleiben nur einige sichtbare kleine Cluster und unverdautes Skleralgewebe zurück.
    HINWEIS: Die Mikroskopie mit hoher Vergrößerung zeigt einen Cluster, der aus vielen dicht gepackten Zellen (einschließlich LNCs) besteht.
  8. Verwenden Sie eine 200-μl-Pipettenspitze, um die Cluster unter dem Stereomikroskop von unverdautem Skleralgewebe zu lösen.
  9. Übertragen Sie die Cluster auf die 3,5-cm-Kulturplatte und tauchen Sie sie in 0,25 % TE, und legen Sie die Platte dann für 15 Minuten in den Zellinkubator.
  10. Fügen Sie 1 ml MESCM mit 10 % Knockout-Serum hinzu, um die Zellverdauung zu stoppen, und pipettieren Sie vorsichtig nach oben und unten, um die Cluster mit einer 1-ml-Pipettenspitze in einzelne Zellen zu resuspendieren.
  11. Die Zellsuspension wird in ein 15-ml-Zentrifugalröhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert.
  12. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne die Zellausfällung zu stören, und fügen Sie dann 1 ml MESCM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren.
  13. Pipettieren Sie 2-3 Mal auf und ab, bis der Niederschlag der unteren Zelle gleichmäßig im MESCM mit einer 1-ml-Pipettenspitze suspendiert ist, und nehmen Sie 20 μl Zellsuspension zur Zellzählung.
  14. Übertragen Sie die Zellsuspension mit einer 1-ml-Pipettenspitze auf die mit einer Basalmembranmatrix beschichtete 6-Well-Platte und erhöhen Sie das MESCM-Volumen auf 2,5 ml.
  15. Schütteln Sie die 6-Well-Platte vorsichtig horizontal, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
  16. Übertragen Sie die Zellen in den Kulturinkubator, nachdem sie abgebildet und aufgezeichnet wurden. Beobachten und fotografieren Sie die Zellen täglich und wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage.

2. Identifizierung von LNC

  1. Immunfluoreszenz-Färbung
    1. Die LNCs vom Boden der Platte werden mit 1 ml 0,25 % TE für 5 Minuten im 37 °C C-Zellinkubator aufgeschlossen.
    2. Beenden Sie den Aufschluss durch Zugabe von 1 ml MESCM (enthält Knockout-Serum), zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 200 x g und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab.
    3. Fügen Sie 1 mL MESCM hinzu, um die Zellen in Suspension zu resuspendieren. Bereiten Sie 80 μl Zellsuspension (4 × 103 Zellen pro Objektträger) für 4 Objektträger (20 μl/Objektträger) vor und verwenden Sie ein Zentrifugensystem, um Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers auf Objektträger abzuscheiden.
    4. Fixieren Sie die Zellen (die in Schritt 3 auf Objektträgern geklebt wurden) mit 4 % Paraformaldehyd für etwa 10 Minuten und permeabilisieren Sie dann die Zellen auf den Objektträgern mit 0,2 % Triton X-100 in PBS für 15 Minuten.
    5. Blockieren Sie die Zellen für 1 h mit 2% Rinderserumalbumin (BSA), bevor Sie sie mit primären Antikörpern (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) über Nacht bei 4 °C in einem Shaker inkubieren. Nach der Inkubation werden die ungebundenen Primärantikörper durch Waschen (5 min/Waschen, 3x) der Objektträger mit PBST (PBS + 0,1 % Tween 20) entfernt.
    6. Die entsprechenden Sekundärantikörper (Esels-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper TRITC [1:1000], Esel-Anti-Kaninchen-IgG-FITC [1:500], Esel-Anti-Maus-IgG 488 [1:300], Esel-Anti-Kaninchen-IgG 594 [1:400]) für 1 h mit geeigneten unspezifischen IgG-Antikörpern inkubieren. Entfernen Sie den ungebundenen Sekundärantikörper mit PBST (5 min/Waschen, 3x).
    7. Die Zellkerne werden mit 5 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol) gegengefärbt und die Objektträger versiegelt.
    8. Fluoreszenzbildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop durchführen (Vergrößerung: 400x; Belichtungszeit: 50 ms).
  2. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
    1. Nehmen Sie das RNA-Isolations-Kit ein, um die Gesamt-RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren.
    2. Verwenden Sie ein cDNA-Transkriptionskit mit hoher Kapazität, um 1-2 μg Gesamt-RNA in cDNA umzuschreiben.
    3. Die reverse Transkription (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) und qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 Zyklen) wird in einer 20-μl-Lösung durchgeführt, die cDNA (100 ng), TaqMan Genexpression Assay Mix (1 μl), universellen PCR Master Mix (10 μl) und ddH2O (bis 20 μl) enthält.
    4. Verwenden Sie die vergleichende CT-Technik (ΔΔCT)4,9, um die relative Genexpression zu untersuchen.

3. Charakterisierung von LNC

  1. Zellzählung (Hämozytometer)
    1. Die LNCs werden vom Boden der Platte mit 0,25 % TE für 5 Minuten im 37 °C heißen Zellinkubator aufgeschlossen.
    2. Beenden Sie den Aufschluss durch Zugabe von 1 ml MESCM (enthält Knockout-Serum), zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 200 x g und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab.
    3. Fügen Sie 1 ml MESCM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und nehmen Sie dann 10 μl Zellsuspension in ein 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,4 % Trypanblau-Färbelösung hinzu.
    4. Geben Sie 10 μl gefärbte Zellsuspension auf den Zählbereich des Hämozytometers und decken Sie ihn zum Zählen mit einem Deckglas ab.
      HINWEIS: Die Anzahl der Zellen in den fünf mittleren quadratischen Bereichen ist als "A" definiert. Die Zellzahl in 1 ml wird als 5A × 104 × 2 berechnet.
  2. Untersuchung von LNC- und BMMSC-Markern mit Durchflusszytometrie15
    1. Nachweis der Expression von SCF, CD73, CD90 und CD105 in den LNCs und BMMSCs mit Durchflusszytometrie 15 (2-4 ×10 6 Ereignisse/Probe, 2.000 Zellen wurden aus jeder der Proben gewonnen, insgesamt 550.000 Zellen, die gleichzeitig angesteuert wurden).
    2. Die Zellen werden bei 20-30 °C für 15 Minuten in einem Blockierungspuffer (3 % BSA und 0,05 % Tween-20 in PBS) mit vormarkierten Antikörpern (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] und CD105 [1:50]) gemäß den Anweisungen des Kits gesammelt und gefärbt.
    3. Führen Sie eine Analyse der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) mit einem Durchflusszytometer durch. In dieser Studie wurden die Software FACS Diva und die Software FlowJo verwendet. Zeichnen Sie für jede Probe 10.000 Ereignisse auf und analysieren Sie lebende Zellen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Wachstum von LNC
Die LNCs wurden erfolgreich gemäß der Methode des Verdaus von Kollagenase A (2 mg/ml) des korneoskleralen Randgewebes, wie oben beschrieben (Abbildung 1), isoliert. In Übereinstimmung mit einer zuvor berichteten Studie3 wurden nach dem Verdau von Kollagenase A raupenartige Cluster unter dem Mikroskop sichtbar gemacht (Abbildung 2). Der Anteil der Spindelzellen nahm mit der Zellpassage allmählich zu. Sp...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die Transparenz der Hornhaut wird in der Regel durch die regelmäßige Anordnung und Verteilung kleiner Fasern (25-30 nm Durchmesser) im Hornhautstroma aufrechterhalten, was für die normale Sehschärfe entscheidend ist16. Weltweit gibt es 253 Millionen sehbehinderte Menschen, von denen 36 Millionen blind sind17. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) betrachtet Hornhautblindheit als eine der schwerwiegendsten Gefahren für das menschliche Sehvermögen und macht 5,1 % aller Erblin...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Keiner der Autoren verfügt über relevante finanzielle Angaben.

Danksagungen

Vielen Dank an Wei Wang, Lingjuan Xu und Rong Liu für die Anleitung zu dieser Arbeit, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You und Li Guigang für die Bereitstellung eines Teils des Materials, Guanyu Su für das Schreiben des Manuskripts, Xiao Zhou, Yihong Xiong und Huatao Xie für die Korrektur des Manuskripts und Guigang Li für seine vollständige Anleitung. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82070936, 81470606, 81570819), dem wissenschaftlichen Forschungsprojekt für Gesundheit und Familienplanung der Provinz Hubei (Nr. WJ2017M073), Top Ten translationale medizinische Forschungsprojekte des Tongji-Krankenhauses (Nr. 2016ZHYX20), Ausbildungsprojekt junger medizinischer Pioniere in der Stadt Wuhan (Nr. 2015whzqnyxggrc10), Global Talents Recruitment Program (G2022154028L), Projekt der Nationalen Gesundheitskommission der Provinz Hubei im Jahr 2022 (WJ2021ZH0005) und Subject Construction Foundation of Finance Department of Hubei im Jahr 2022 (4200002815T000000102)

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4',6-Diamidino-2-phenylindolThermoFisherD13065μ g/mL
Amphotericin BSigmaV9009191,25 μ g/mL
Anti-CD73Abcamab2021221:50
RinderserumalbuminMERCKA1933-CD105
Proteintech67075-1-Ig1:200
CD105Abcamab1140521:50
CD90Proteintech66766-1-Ig1:100
CD90Abcamab3077361:50
Zell-InkubatorShanghai LishenK1119K4644HF90(HT)
ZentrifugensystemStatSpin StatSpin CytoFuge12-Kollagenase
ARoche101035780012 mg/ml
KonfokalmikroskopZeiss LSM700-Kulturplatte
virya350035635 mm
DME/F-12 1:1 (1x) cytivaSH30023.0190%
Esel Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärer AntikörperThermoFisherA160161:1000
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärer AntikörperThermoFisher315681:1000
FACS Diva SoftwareBD BiosciencesTreeStar-Flow
ZytometerBD BiosciencesBecton Dickinson LSRII-
FluoreszenzmikroskopOLYMPUSCX31 
GentamicinSigmaG191450 μ g/mL
HämozytometerMERCKZ359629Bright-Line
cDNA-Transkriptionskit mit hoher KapazitätThermoFisher4374966
Inverses Phasenkontrastmikroskop  UOPDSZ2000X
ITS (Insulin, Transferrin, Natriumselenit)SigmaI31465 μ g/ml Insulin, 5 μ; g/mL Transferrin, 5 ng/mL Natriumselenit
KnockOut SR Serum Ersatz für ESCs/iPSCsgibco10828-02810%
MatrigelBioCoat
356234-Pan-CKAbcamab77531:1000
ParaformaldehydNoninBioNBS01354,00%
ParaformaldehydMKBioMM-15054%
PDGFRΒAbklonalesA14441:100
Quantitatives Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-InstrumentApplied BiosystemsStep One
Plus-rekombinantes humanes FGF-basicPeprotech100-18B4 ng/ml
Rekombinanter humaner Leukämie-Hemmfaktor (Lif)Peprotech300-0510 ng/ml
RNeasy Mini-RNA-IsolationskitQiagen74104-
SCFBiossbs-0545R1:100
SCFAbcamab526031:50
StereomikroskopZEISSSteREO Discovery. V8
Sterile chirurgische RundklingeCareforde29500Größe 10
TaqMan Genexpression Assay MixAngewandte Biosysteme4448489
Triton X-100MERCKX1000,20 %
TrypanblauThermoFisher152500610,40 %
Trypsin-EDTAGenviewGP31080,25 %
Tween 20MERCKP9416-Ultra
Clean BenchLaiTeLT20200705SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
Vim Abcamab925471:100

Referenzen

  1. Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
  2. Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
  3. Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
  4. Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
  5. Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
  6. Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
  7. Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
  8. Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).
  9. Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).
  10. Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).
  11. Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
  12. Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
  13. Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).
  14. Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
  15. Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566(2018).
  16. Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).
  17. Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
  18. Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  19. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  20. Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).
  21. Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).
  22. Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
  23. Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
  24. O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265(2020).
  25. Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
  26. Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115(2017).
  27. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
  28. Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
  29. Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
  30. Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
  31. González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
  32. Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
  33. Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. Stem cells in the limbal stroma. Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).
  34. Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
  35. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

LNC Isolierunglimbale StammzellenZellkulturCollagenase VerdauTrypsin EDTAImmunfluoreszenzf rbungDurchflusszytometrieStammzellmarkerquantitative PCR
Isolierung und Identifizierung von Limbus-Nischenzellen
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.