Summary
Este protocolo fornece um modelo de camundongo de câncer colorretal ulcerativo associado à coloproctite induzido por azometano combinado com sulfato de sódio dextrana. O modelo foi utilizado para avaliar a eficácia de compostos da medicina tradicional chinesa na prevenção e tratamento do câncer colorretal.
Abstract
O câncer colorretal (CCR) é uma neoplasia maligna comum do sistema digestivo e tornou-se a terceira neoplasia maligna mais comum em todo o mundo e a segunda causa de morte relacionada à malignidade. A coloproctite ulcerativa (RCU) é uma lesão pré-cancerosa, e o CCR associado à RCU (CCR-RCU) é o subtipo mais comum de CCR. Portanto, um modelo razoável de CCR-UC é a pedra angular e a garantia do desenvolvimento de novos fármacos. A medicina tradicional chinesa (MTC) tem sido amplamente utilizada no tratamento do CCR-RCU devido à sua boa eficácia. Como prescrição tônica clássica da MTC, a decocção de Liujunzi (LJZD) tem sido amplamente utilizada no tratamento do CCR-RCU. Neste estudo, um modelo de CCR-RCU foi estabelecido pela combinação de azometano e sulfato de sódio dextrana e o LJZD foi administrado. Os dados confirmaram que o LJZD pode efetivamente inibir a transição do câncer no UC-CRC usando o peso corporal do rato, comprimento colorretal, fatores patológicos e inflamatórios, função da barreira colorretal e marcadores de câncer. Esse protocolo fornece um sistema de avaliação da eficácia da MTC na prevenção e tratamento do CCR-RCU.
Introduction
O câncer colorretal (CCR) é uma neoplasia maligna comum do trato gastrointestinal, a terceira neoplasia maligna mais comum e a segunda causa de morte mais comum no mundo, sendo responsável por 10% da incidência mundial de câncer e 9,4% do total de mortes relacionadas aocâncer1,2. Fatores genéticos, inflamação crônica, dieta rica em gordura, diabetes e flora intestinal anormal são fatores de risco para CCR 3,4. Dentre elas, a doença inflamatória intestinal, especialmente a coloproctite ulcerativa (RCU), é um claro fator de risco paraCCR5,6. O CCR associado à RCU (CCR-RCC) é um processo de transição de inflamação, hiperplasia atípica e câncer baseado na inflamação crônica do colorreto, que é diferente do modelo típico de desenvolvimento de adenoma-adenocarcinoma doCCR7,8. Comparado com a população geral, o risco de CCR é aproximadamente 10-40 vezes maior em pacientes com doença inflamatóriaintestinal9.
Atualmente, a cirurgia ainda é o tratamento padrão para o CCR e, dependendo da localização e do estágio do tumor, a radioterapia, a terapia medicamentosa sistêmica ou a combinação de ambos sãopossíveis10. Embora essas modalidades tradicionais de tratamento tenham feito grandes progressos, devido à alta heterogeneidade e taxa de recorrência do CCR, o prognóstico é ruim e o efeito do tratamento não é oideal11,12. Portanto, a detecção precoce, o diagnóstico precoce e o tratamento abrangente são fundamentais para melhorar a taxa de sobrevida dos pacientes com CCR, e é particularmente importante prestar atenção à transformação da RCU em CCR. Ao longo dos anos, a medicina tradicional chinesa (MTC) tem atraído muita atenção no tratamento do CCR-RCU ou gastrite crônica devido aos seus efeitos colaterais limitados e eficácia significativa. Com base no tratamento dialético, famosos praticantes da medicina chinesa de várias gerações criaram um grande número de prescrições clássicas, como a decocção Huangqi Jianzhong13, a decocção Sijunzi14 e a pílula Sishen15.
A decocção de Liujunzi (LJZD) originou-se dos trabalhos de Yi Xue Zheng Zhuan compilados na Dinastia Ming e é uma prescrição clássica na MTC16. Como mostrado na Tabela 1, LJZD consiste de seis ervas tradicionais, incluindo Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. (Dangshen), Poria cocos (Schw.) Wolf (Fuling), Atractylodes macrocephala Koidz. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancão), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) e Pinellia ternata (Thunb.) Breit (Banxia), que tem o efeito de repor o qi e fortalecer o baço, secar a umidade e resolver o catarro. Na prática clínica moderna, é frequentemente usado para tratar gastrite crônica, úlceras gástricas e úlceras duodenais. Pesquisas farmacológicas modernas têm demonstrado que o LJZD e o LJZD modificado têm alto valor de aplicação no tratamento adjuvante do câncer da RCU e do trato digestivo 17,18,19.
Atualmente, existem muitas maneiras de construir modelos de camundongos UC-CRC, mas o modelo de camundongo induzido por azoximetano (AOM)/dextran sulfato de sódio (DSS) é o modelo de UC-CRC mais amplamente utilizado; os sintomas clínicos, as observações morfológicas e patológicas comprovaram que o modelo é muito semelhante ao CCR-RCU humano20,21. O princípio básico é primeiro induzir a carcinogênese com AOM carcinogênico químico e, em seguida, expor continuamente camundongos ao ambiente de estimulação inflamatória da ESD para simular o dano contínuo e o reparo do epitélio da mucosa intestinal, construindo assim um modelo de camundongo UC-CRC22. O objetivo deste estudo é estabelecer um modelo murino de CCR-RCC por injeção intraperitoneal de OMA e estimulação cíclica de ESD em curto prazo e avaliar o efeito da droga e do mecanismo molecular do LJZD no CCR-RCU, a fim de fornecer uma base científica para o tratamento do CCR-RCU.
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Protocol
O procedimento animal foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Medicina Chinesa de Changchun (Número de registro: 2021214). Camundongos C57BL/6J livres de patógenos específicos (8-10 semanas, peso 18-22 g), machos e fêmeas, foram alojados em gaiolas ventiladas independentemente a 22 °C e 65% de umidade relativa. Os camundongos iniciaram o experimento após 7 dias de alimentação adaptativa, durante os quais tiveram livre acesso à água e à dieta.
1. Preparação de medicamentos
- Preparação do LJZD
NOTA: O medicamento chinês utilizado foi adquirido ao Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Changchun e foi identificado como medicina chinesa genuína (ver Tabela 1).- Coloque Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g), Jiangbanxia (9 g) em um pote de cerâmica especializado (ver Tabela de Materiais). Adicionar 1000 ml de água destilada e deixar de molho à temperatura ambiente durante 1 h (ver figura 1A).
- Pó 12 g Encher em pó fino com um moedor e mergulhar em 300 mL de água destilada em outro recipiente por 1 h à temperatura ambiente.
- Misture a medicina chinesa acima no pote de cerâmica especializado. Ferva a mistura e depois mantenha em fogo médio até restar apenas 300 mL de decocção. Use gaze médica para filtrar e preservar o filtrado à temperatura ambiente.
- Adicionar 1000 mL de água destilada e repetir a operação de decocção acima mais uma vez. Filtre novamente usando gaze médica. Combine o filtrado e ferva até restarem apenas 150 mL.
- Centrifugar o líquido concentrado a 10.000 x g por 5 min e concentrar o sobrenadante obtido a 30 mL em fogo médio. Transfira o concentrado final para um prato e seque-o em estufa de secagem elétrica até que reste apenas o soluto em pó.
- Pesar o sólido acima e dissolvê-lo em água destilada estéril para obter uma solução contendo 22,85 mg de droga por 0,2 mL (114,16 mg/mL), que é a dose diária de camundongos.
- Preparação de ácido 5-amino salicílico
NOTA: O ácido 5-amino salicílico (5-AAS; ver Tabela de Materiais) tem um bom efeito preventivo na RCU-CCR, e foi usado como droga positiva neste estudo23.- Dissolver 64 mg de pó de 5-ASA em 200 mL de água destilada estéril para obter 1,82 mg/mL de solução de 5-AAS. A dose diária para um único camundongo foi de 0,2 mL.
- Preparação da solução injetável de AOM
- Adicionar 2,5 ml de água destilada estéril em pó de AOM 25 mg (ver Tabela de Materiais) e misturar por misturador de vórtice (ver Tabela de Materiais) para fazer 10 mg/ml de solução-mãe de AOM, conservar a -20 °C até à utilização.
- Preparar a solução de injeção de AOM diluindo a solução-mãe de AOM com água destilada estéril a 10:1 (1 mg/mL).
2. Estabelecimento do modelo UC-CRC
OBS: O experimento foi dividido em 4 grupos: controle, modelo, LJZD e grupo 5-ASA, sendo 10 camundongos em cada grupo. Com exceção do grupo controle, os demais grupos foram tratados com OMA e ESD.
- Injeção intraperitoneal de solução injetável de AOM
NOTA: Após alimentação adaptativa para 7 d, os camundongos receberam solução de injeção de AOM (1 mg/mL) por injeção intraperitoneal (ver Figura 1B).- Segure o mouse com a barriga para cima e a cabeça levemente para baixo. Segure a pele posterior para apertar a pele abdominal e perfure a pele aproximadamente 1 cm à direita da intersecção da linha da raiz de ambas as coxas na linha média do abdome com uma seringa de 1 mL (ver Tabela de Materiais).
- Empurre a agulha de seringa de 1 mL para uma distância de 3-5 mm sob a pele, mantendo-a paralela à linha média abdominal, e insira a agulha 0,3-0,5 mm na cavidade abdominal a 45°.
- Depois que a ponta passa pelo músculo abdominal, o operador sente uma perda súbita de resistência. Em seguida, puxe a seringa para fora e para trás para observar se ocorre infiltração de líquido. Caso contrário, empurre a solução de injeção de AOM lentamente para os ratos a 0,1 mL/10 g.
- Estimulação cíclica da solução de DSS a 2%
NOTA: Cada camundongo induzido por OMA recebeu 500 mL de solução de DSS nas semanas 3, 6 e 9, e os camundongos beberam livremente durante esse período.- Preparar a solução de DSS a 2% adicionando 500 ml de água destilada estéril a 10 g de DSS (ver Tabela de Materiais). Misture com um misturador de vórtices e conservar a 4 °C até à utilização.
- Cada camundongo induzido por OMA bebe livremente 500 mL de solução de DSS a 2% por 7 dias nas semanas 3, 6 e 9 após a indução com OMA.
3. Tratamento medicamentoso
NOTA: Humanos adultos precisam de 63 g de LJZD por dia. De acordo com a fórmula de conversão de dose experimental de camundongos e drogas humanas, dose experimental equivalente para camundongos (mg/kg) = dose humana (mg/kg)/peso corporal (60 kg) x 9,1, a dose diária de camundongos foi de cerca de 9,6 g/kg.
- Tratar o grupo LJZD e 5-ASA com 0,1 mL/10 g da solução preparada de LJZD e 5-AAS por gavagem gástrica na semana 7 e na semana 15, respectivamente.
- Para administração intragástrica em camundongos, execute o seguinte procedimento. Segure o mouse na mão esquerda e, na mão direita, segure o aparelho de perfusão do estômago. Insira a agulha da seringa na boca e deslize-a pela parede posterior da faringe dos ratos. Deslize pela faringe enquanto os ratos engolem e continuam a avançar. Quando houvesse uma sensação de resistência, e a seringa pudesse ser empurrada para dentro da faringe, puxe a agulha para fora e complete a injeção.
- Tratar o grupo controle e modelo com a mesma quantidade de soro fisiológico (ver Tabela de Materiais).
- Trate os ratos em cada grupo com droga apropriada uma vez por dia à mesma hora durante o período de administração.
4. Avaliação do modelo de CCR-RCU e eficácia do LJZD
- Escore do índice de atividade da doença
NOTA: De acordo com a Tabela 2, o escore do índice de atividade da doença (DAI) foi avaliado pela combinação de perda de peso, viscosidade fecal e sangramento fecal dos camundongos.- Registre o peso dos camundongos diariamente desde o início da alimentação adaptativa até o final do tratamento medicamentoso.
- Observe cuidadosamente a consistência fecal de cada camundongo experimental e registre os movimentos intestinais como uma das três condições: fezes normais, soltas e diarreia aquosa.
- Registrar o sangramento fecal dos animais experimentais como uma das três condições: sem sangramento, pouco sangramento e sangue visível nas fezes.
- Detecção do nível de IL-6 no soro
- Trate camundongos com LJZD ou 5-ASA por 9 semanas. Fixe os ratos segurando a pele do pescoço do rato com a mão esquerda e pressionando suavemente a mesa experimental para assumir a posição de decúbito lateral. Corte os bigodes dos ratos com uma tesoura. Corte cuidadosamente os bigodes dos ratinhos com uma tesoura (ver Tabela de Materiais) para evitar a contaminação do sangue.
NOTA: Os ratos que não conseguiam mexer livremente foram considerados devidamente fixados. Se isso não acontecer, os ratos devem ser fixados. - Anestesiar o camundongo por inalação de isoflurano a 2%. Esterilizar a pele ao redor do globo ocular com etanol (ver Tabela de Materiais). Pressione a pele dos olhos do lado suavemente para deixar o globo ocular congestionado e saliente.
- Aperte o globo ocular com uma pinça de cotovelo e remova os globos oculares com precisão e rapidez. Deixe o sangue escorrer para o tubo centrífugo (ver Tabela de Materiais). No processo, toque no coração do mouse para acelerar a coleta de sangue.
- Manter o sangue coletado em temperatura ambiente por 30 min e centrifugar a 3.500 x g por 10 min. Coletar o sobrenadante e detectar o nível de IL-6 de acordo com as instruções do kit de detecção de conteúdo IL-6 (consulte a Tabela de Materiais).
- Trate camundongos com LJZD ou 5-ASA por 9 semanas. Fixe os ratos segurando a pele do pescoço do rato com a mão esquerda e pressionando suavemente a mesa experimental para assumir a posição de decúbito lateral. Corte os bigodes dos ratos com uma tesoura. Corte cuidadosamente os bigodes dos ratinhos com uma tesoura (ver Tabela de Materiais) para evitar a contaminação do sangue.
- Separando o tecido colorretal
- Eutanasiar os camundongos após a coleta de sangue inalando isoflurano com overdose de 5% e deslocamento cervical (ver Tabela de Materiais) de acordo com a ética animal.
- Manter os camundongos em um ambiente anatômico criogênico. Imobilizar os camundongos em decúbito dorsal. Corte os pelos da parte inferior do abdômen com tesoura e esterilize-os com etanol.
- Aperte o ponto de intersecção entre as duas raízes da coxa e a linha média abdominal com pinça palpebral (ver Tabela de Materiais). Corte uma incisão transversal de cerca de 1-1,5 cm com tesoura.
- Clipar uma incisão longitudinal ao longo da linha mediana do abdome a partir do ponto médio da incisão transversal em direção ao processo xifoide.
- Remova os tecidos pericolorretais na direção do ânus para separar o colorreto do tecido circundante. Tenha cuidado para não danificar o colorreto.
- Empurre a pele do abdômen para os lados para expor totalmente o colorreto. Remova o colorreto da cavidade abdominal com pinça palpebral e corte os segmentos do ânus ao ceco (excluindo); O comprimento total é de cerca de 10 cm. Armazenar os tecidos colorretais obtidos em solução salina a 4 °C.
- Avaliação do comprimento e peso do reto
- Extrair o soro fisiológico a 4 °C com uma agulha de 5 ml (ver Tabela de Materiais) para lavar o interior do colorretal. Em seguida, coloque o colorreto sobre papel absorvente para absorver a umidade do tecido.
- Pese os tecidos colorretais e, em seguida, coloque-os em papel A4 para medir seu comprimento.
- Medir o número de tumores no colorreto
- Corte o colorreto longitudinalmente para desdobrá-lo completamente e observe o número e o tamanho dos tumores no colorreto.
- Análise patológica do colorreto
- Fixar o colorreto em paraformaldeído a 4% por 24 horas. Embutir o tecido retal fixado em parafina derretida e cortar continuamente com uma espessura de 5 μm por um micrótomo de congelamento de tecido.
- De acordo com o procedimento de Hou et al.24, desparafinar os cortes em xileno e desidratá-los com concentrações seriadas de etanol. Após coloração com solução de hematoxilina por 5 min, enxaguar os cortes com água pura. Depois disso, corar com solução de eosina a 0,5% por 1 minuto (ver Tabela de Materiais).
- Realizar novamente a desidratação do gradiente e o tratamento transparente com xileno. Selar os cortes e observá-los ao microscópio óptico (ver Tabela de Materiais) e fotografar, conforme descrito por Xie et al.25.
- Análise imunoistoquímica do colorreto
- Despifilar e desidratar as seções de acordo com o método acima. Reparar o antígeno nos cortes com técnica de reparo térmico a alta pressão, conforme descrito por Gok et al.26.
- Mergulhe os cortes em bloqueadores de peroxidase endógena à temperatura ambiente por 15 min. Selar as secções com soro de cabra (ver Tabela de Materiais).
- Adicione o anticorpo primário ZO-1 (1:1000), Occludina (1:1000) e KI67 (1:500; ver Tabela de Materiais) às seções e incube durante a noite a 4 °C. Enxaguar as secções com tampão PBS (ver Tabela de Materiais), adicionar anticorpo secundário de uso geral (1:5000; ver Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C durante 30 minutos.
- Adicione a solução DAB (consulte Tabela de materiais) às seções para desenvolvimento de cores. Contramanchar os cortes com solução de hematoxilina.
- Desidrate, transparente e sele as seções novamente. Observar a expressão da proteína pelo microscópio óptico.
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Representative Results
A decocção do LJZD foi preparada de acordo com a proporção de composição dos fármacos na Tabela 1 e o método de decocção da MTC na Figura 1A. De acordo com o momento indicado na Figura 1B, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 1 mg/mL de AOM no7º dia, e os camundongos tiveram livre acesso à água potável contendo 2% de DSS na3ª,6ª e9ª semanas. O modelo de camundongo UC-CRC foi estabelecido com sucesso na15ª semana. Enquanto isso, camundongos foram tratados com LJZD por gavagem da semana 7 à semana 15. Os dados mostraram que, em comparação com o grupo controle, o grupo modelo RCU-CCR teve uma perda de peso significativa, que foi aliviada pelo tratamento com LJZD (Figura 2A, P < 0,01). Ao final do estudo, o tratamento com LJZD melhorou o escore DAI em comparação com o grupo modelo UC-CRC (Figura 2B). Em comparação com o grupo controle, o grupo modelo RCU-CCR apresentou menor comprimento colorretal, que foi aumentado pelo tratamento com LJZD (Figura 2C,D, P < 0,01). A relação entre o peso colorretal e o peso corporal reflete o desenvolvimento do CCR em camundongos, e uma proporção maior indica o desenvolvimento agudo do tumor27. Em comparação com o grupo controle, o índice de órgãos colorretais do grupo modelo aumentou significativamente, e o tratamento com LJZD reduziu significativamente o índice de órgãos colorretais (Figura 2E, P < 0,05). Além disso, o tratamento com LJZD também inibiu a formação de tumores colorretais (Figura 2F, P < 0,01) e o nível sérico de fator pró-inflamatório IL-628 (Figura 2G, P < 0,05).
Os resultados anatomopatológicos confirmaram que, em comparação com o grupo controle, os camundongos do grupo modelo RCU-CCR tinham tumores colorretais maiores e haviam formado adenocarcinoma, enquanto o tratamento com LJZD reduziu o tamanho e o grau dos tumores (Figura 3). Dados imuno-histoquímicos demonstraram que o tratamento com LJZD aumentou a função de barreira colorretal em camundongos modelo UC-CRC, como indicado pela elevada expressão proteica de ZO-1 e Ocludina29 (Figura 4). Paralelamente, o tratamento com LJZD suprimiu os níveis de expressão proteica do marcador de câncer KI6730 (Figura 4).
Figura 1: Preparação do LJZD e estabelecimento de um modelo de câncer de coloproctite em camundongos.( A) A mistura de Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g) e Ban Xia processada com gengibre (9 g) foi imersa em 1000 mL de água destilada à temperatura ambiente por 1 h. O pó de 12 g de Fuling foi embebido em 300 mL de água destilada à temperatura ambiente por 1 h. A mistura das seis ervas acima foi decocada a 100 °C por 40 min. (B) No 7º dia, camundongos C57BL/6J foram injetados intraperitonealmente com 1 mg/mL de AOM. Os camundongos receberam água contendo 2% de DSS ad libitum na3ª,6ª e9ª semanas. De 7 a 15 semanas, camundongos receberam LJZD por gavagem. Abreviaturas: AOM, azometano; DAI, índice de atividade da doença; DSS, sulfato de dextran sódico; LJZD, Liujunzi Decocção; w, semana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação do modelo de CCR-RCU e eficácia do LJZD. (A) LJZD melhorou o peso corporal em camundongos modelo UC-CRC. (B) LJZD aliviou os escores DAI em camundongos modelo UC-CRC. (C, D) LJZD aumentou o comprimento do colorreto em camundongos modelo UC-CRC. (E) LJZD reduziu o índice de órgão do colorreto em camundongos modelo UC-CRC. (F) LJZD inibiu a tumorigênese colorretal em camundongos modelo de câncer de coloproctite. (G) LJZD suprimiu o nível sérico de IL-6 em camundongos modelo UC-CRC. #P< 0,05 e ##P< 0,01, em comparação com o grupo controle; *P < 0,05 e **P< 0,01, em comparação com o grupo modelo. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (n=10) e analisados por análise de variância (ANOVA) one-way seguida do teste de Tukey. P < 0,05 indicou diferença estatisticamente significante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação das características patológicas dos tecidos colorretais de camundongos pela coloração hematoxilina-eosina. Não houve dano patológico no grupo controle. O tecido tumoral do grupo modelo RCU-CCR era grande e tinha adenocarcinoma formado e neoplasia de alto grau, enquanto o grupo de tratamento LJZD tinha tecido tumoral reduzido acompanhado por uma pequena quantidade de adenoma local e neoplasia de baixo grau. A seta preta representa a glândula tumoral displásica pré-cancerosa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeito do LJZD na função de barreira colorretal e marcador de câncer em camundongos modelo UC-CRC. (A) Imagens imuno-histoquímicas de ZO-1, Ocludina e KI67. (B) Resultados estatísticos da expressão proteica de ZO-1, Ocludina e KI67. O tratamento com LJZD aumentou a expressão das proteínas funcionais da barreira colorretal ZO-1 e Occludin, enquanto diminuiu o nível do marcador de câncer KI67 em camundongos modelo UC-CRC. ## P < 0,01, em comparação com o grupo controle; ** P < 0,01, em comparação com o grupo modelo. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (n=10) e analisados por análise de variância (ANOVA) one-way seguida do teste de Tukey. P < 0,05 indicou diferença estatisticamente significante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componentes | Pinyin | Peso (g) |
| Codonopsis Radix | Dangshen | 12 |
| Poria cocos | Realização | 12 |
| Atractylodis Macrocephalae Rizoma | Baizhu | 12 |
| Alcaçuz | Gancao | 6 |
| Casca de laranja seca | Chenpi | 12 |
| Rizoma Pinelliae Preparata | Jiangbanxia | 9 |
Tabela 1: Composição e proporção de medicamentos no LJZD.
| Itens | Grau ou sintomas | Pontuações |
| Perda de peso | < 1% | 0 |
| 1%-5% | 1 | |
| 5%-10% | 2 | |
| 10%-15% | 3 | |
| ≥15% | 4 | |
| Exame de sangue oculto nas fezes | Negativo | 0 |
| Positivo | 2 | |
| sangue visível nas fezes a olho nu | 4 | |
| Consistência fecal | normal | 0 |
| fezes soltas | 2 | |
| diarreia aquosa | 4 |
Tabela 2: Escore do índice de atividade da doença para o modelo de CCR-RCU em camundongos.
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Discussion
O CCR é um dos cânceres mais comuns em todo o mundo, com aproximadamente 1.148.000 novos casos e mais de 576.000 mortes a cada ano. O CCR pode ser dividido em três tipos de acordo com diferentes causas, incluindo hereditárias, esporádicas e RCU-CCR31. A incidência de CCR em pacientes com doenças inflamatórias intestinais, como a RCU, é significativamente maior do que na população geral. A RCU estimula o desenvolvimento do CCR através da via inflamatória-neoplásica, que difere da via típica do adenoma-adenocarcinoma6. Atualmente, a causa do CCR-RCU é desconhecida, causada principalmente por inflamação crônica recorrente a longo prazo, com taxa de mortalidade de até 60%32,33. Não há tratamento eficaz para o CCR-RCU, que tem sido o foco de pesquisa nos últimos anos. A compreensão do mecanismo molecular do CCR-RCU é crucial para a detecção precoce e o tratamento preciso do CCR-RCU.
Atualmente, existem muitos métodos para construir modelos animais de CCU-CCR, e os mecanismos de formação são diferentes. O knockout do gene IL-10 ou Muc2/4, resultando em defeitos da barreira epitelial, pode induzir colite espontânea em camundongos, por isso é frequentemente usado para construir modelos animais de CCR baseados em defeitos genéticos associados à RCU 34,35,36. No entanto, o modelo animal de CCR-RCU induzido por knockout gênico não pode simular a patogênese completa da doença, e seu método de operação é complexo, o experimento é caro e tem limitações óbvias. A indução química é o método clássico e comum para a construção de modelos animais de CCR-RCU37,38. DSS, AOM, e dimetilhidrazina são todos indutores químicos comumente usados para a construção de UC-CRC. No entanto, o uso isolado desses reagentes químicos para estabelecer modelos animais leva muito tempo e tem uma baixa taxa de sucesso39. Estudos têm demonstrado que a incidência de CCR-RCU induzida pela combinação de OMA e ESD pode chegar a quase 100%40. Comparada a outros métodos, a combinação de OMA/ESD tem as vantagens de operação simples, forte controlabilidade, ciclo curto e alta taxa de replicação, podendo simular melhor o CCR-RCU humano em termos de patologia e mecanismo molecular40,41,42. Embora o uso da estimulação do ciclo AOM/DSS para construir o modelo de CCR-UC tenha muitas vantagens, ele também tem as desvantagens de longo tempo de modelagem, reagentes de modelagem caros e ainda não pode simular completamente a patogênese do CCR-UC humano.
A fim de buscar um potencial alvo terapêutico para o CCR-RCU, usamos AOM, um carcinógeno químico, em combinação com camundongos induzidos por DSS para estabelecer um modelo de CCR-UC. Neste estudo, camundongos expostos à OMA e estimulação cíclica da ESD apresentaram graus variados de sintomas relacionados ao CCR-RCU. Em comparação com o grupo controle, o escore DAI do grupo modelo aumentou significativamente, o que se manifestou como perda de peso, fezes sanguíneas, fezes soltas ou diarreia aquosa. Já o LJZD reduziu significativamente o escore DAI. O comprimento colorretal encurtado é um importante marcador de resposta inflamatória no CCR-RCU43,44. Neste estudo, o comprimento do colorreto dos camundongos modelo foi significativamente menor do que o do grupo controle, e o LJZD poderia melhorar o colorreto encurtado. A mucosa colorretal desenvolve inflamação crônica, que gradualmente evolui para hiperplasia atípica do tecido colorretal e, eventualmente, causacâncer45. Neste estudo, o número de tumores no tecido colorretal de camundongos do grupo modelo aumentou significativamente em comparação com o grupo controle e, correspondentemente, o peso do tecido colorretal também aumentou. Após o tratamento com LJZD, o número de tumores diminuiu significativamente, e o peso colorretal diminuiu. Sugere-se que o LJZD tem um efeito inibitório significativo sobre a formação de CCR induzido por RCU. Estudos prévios constataram que o LJZD pode aliviar a inflamação e reduzir os níveis de expressão de TNF-α, IL-6 e IL-1β in vivo 16,28,46. Neste estudo, o nível sérico de IL-6 de camundongos no grupo modelo foi aumentado, mas a produção de IL-6 sérica foi significativamente inibida após o tratamento com LJZD.
A observação microscópica mostrou infiltração inflamatória do tecido retal, destruição da barreira mucosa, redução da secreção de muco, irregularidade ou desaparecimento das células caliciformes, distorção ou atrofia das criptas intestinais e evidente distúrbio da estrutura glandular em camundongos tratados com AOM/DSS. Após o tratamento com LJZD, a morfologia das células caliciformes no tecido colorretal foi normal, a estrutura do recesso e da glândula foi regular, e o dano à barreira mucosa foi melhorado. A tight junction epitelial (TJ) é uma barreira mecânica indispensável para manter a integridade e permeabilidade celular, incluindo principalmente ZO-1 e Ocludina29. Tem sido relatado que a expressão de proteínas TJ como ZO-1 no tecido colorretal de pacientes com CCR-RCU está significativamente reduzida 47,48. Este estudo mostrou que a estrutura do tecido da mucosa colorretal de camundongos UC-CRC foi destruída, e a expressão de ZO-1 e Occludin no tecido diminuiu, enquanto LJZD poderia reverter essa diminuição, sugerindo que LJZD pode proteger a integridade da barreira mucosa colorretal aumentando a expressão de ZO-1 e Occludin. O antígeno nuclear associado (KI67) é um componente essencial da regulação do ciclo celular e é amplamente utilizado como indicador da atividade proliferativa de célulastumorais30,49. Neste estudo, a expressão da proteína KI67 foi aumentada no grupo modelo em comparação com o grupo controle, indicando proliferação significativa de células tumorais no tecido colorretal. Após o tratamento com LJZD, a expressão da proteína KI67 foi diminuída, o que mostrou que o LJZD teve um bom efeito sobre o CCR-RCU.
Em resumo, a injeção intraperitoneal de OMA e a estimulação da circulação por ESD podem efetivamente estabelecer um modelo de CCR-RCU em um curto período e são semelhantes ao CCR-UC humano em termos histopatológicos e mecanismos moleculares de formação. Como uma prescrição clássica, o LJZD pode reduzir o escore DAI, o peso do tecido colorretal e os níveis de fator inflamatório, inibir efetivamente o encurtamento do comprimento colorretal e desempenhar um papel no estágio de RCU em camundongos UC-CCR. Simultaneamente, pode aumentar a expressão das proteínas TJ, melhorar significativamente o dano patológico do tecido colorretal, reduzir a expressão da proteína KI67, reduzir significativamente a incidência de tumores teciduais e inibir o processo de transformação da RCU em CCR. Este estudo fornece uma nova ideia para o tratamento do CCR-RCU.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Jilin (YDZJ202201ZYTS181).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane | Sigma | A5486 | |
| 5-amino salicylic acid | Kuihua Pharmaceuticals Group Jiamusi Luling Pharmaceutical Co., Ltd | 3819413 | |
| C57BL/6J mice | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd | NO 210726210100853716 | |
| Cover slip | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432C | |
| DAB color development kit | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 2005289 | |
| Dewatering machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JJ-12J | |
| Dextran sulfate sodium | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd | MB5535 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Hematoxylin-eosin dye | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | B1000 | |
| IL-6 | Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd | MM-0163M2 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22-10 | |
| KI67 primary antibody | Google Biotechnology Inc | GB121141 | |
| Neutral gum | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | 10004160 | |
| Object slide | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432A | |
| Occludin primary antibody | Affnity | DF7504 | |
| Orthostatic optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse CI | |
| Pathological microtome | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| ZO-1 primary antibody | Abcam | ab221547 |
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