Summary
Этот протокол представляет собой мышиную модель язвенного колоректального рака, ассоциированного с колопроктитом, индуцированного азометаном в сочетании с декстрана сульфатом натрия. Модель была использована для оценки эффективности соединений традиционной китайской медицины в профилактике и лечении колоректального рака.
Abstract
Колоректальный рак (КРР) является распространенным злокачественным новообразованием пищеварительной системы и стал третьим по распространенности злокачественным новообразованием во всем мире и второй по значимости причиной смерти, связанной со злокачественными новообразованиями. Язвенный колопроктит (ЯК) является предраковым поражением, а ЯК-ассоциированный КРР (UC-CRC) является наиболее распространенным подтипом КРР. Таким образом, разумная модель ЯК-КРР является краеугольным камнем и гарантией разработки новых лекарственных препаратов. Традиционная китайская медицина (ТКМ) широко используется в лечении ЯК-КРР благодаря своей хорошей эффективности. В качестве классического тонизирующего средства ТКМ отвар Люцзюньцзы (LJZD) широко используется при лечении ЯК-КРР. В этом исследовании была создана модель UC-CRC путем сочетания азометана и декстрана сульфата натрия, и был введен LJZD. Полученные данные подтвердили, что LJZD может эффективно ингибировать переход рака при ЯК-КРР с помощью массы тела мыши, длины колоректальной кишки, патологических и воспалительных факторов, функции колоректального барьера и онкомаркеров. Данный протокол представляет собой систему оценки эффективности ТКМ в профилактике и лечении ЯК-КРР.
Introduction
Колоректальный рак (КРР) является распространенным злокачественным новообразованием желудочно-кишечного тракта, третьим по распространенности злокачественным новообразованием и второй по распространенности причиной смерти в мире, на его долю приходится 10% глобальной заболеваемости раком и 9,4% от общегочисла смертей, связанных с раком1,2. Генетические факторы, хроническое воспаление, диета с высоким содержанием жиров, диабет и аномальная кишечная флора являются факторами риска развития КРР 3,4. Среди них воспалительные заболевания кишечника, особенно язвенный колопроктит (ЯК), являются явным фактором риска развития КРР 5,6. ЯК-ассоциированный КРР (ЯК-КРР) – это переходный процесс воспаления, атипичной гиперплазии и рака, основанный на хроническом воспалении толстой кишки, который отличается от типичной модели развития аденомы-аденокарциномы КРР 7,8. По сравнению с общей популяцией, риск развития КРР примерно в 10-40 раз выше у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника9.
В настоящее время хирургическое вмешательство по-прежнему является стандартным методом лечения КРР, и в зависимости от локализации и стадии опухоли возможна лучевая терапия, системная лекарственная терапия или их комбинация10. Несмотря на то, что эти традиционные методы лечения добились значительного прогресса из-за высокой гетерогенности и частоты рецидивов КРР, прогноз неблагоприятный, а эффект лечения не идеален11,12. Поэтому раннее выявление, ранняя диагностика и комплексное лечение являются ключом к повышению выживаемости пациентов с КРР, и особенно важно обратить внимание на трансформацию ЯК в КРР. На протяжении многих лет традиционная китайская медицина (ТКМ) привлекала большое внимание в лечении ЯК-КРР или хронического гастрита из-за ее ограниченных побочных эффектов и значительной эффективности. Основываясь на диалектическом лечении, известные практикующие китайскую медицину разных поколений создали большое количество классических рецептов, таких как отвар Хуанци Цзяньчжун13, отвар Сыцзюньцзы14 и пилюля Сышэнь15.
Отвар Люцзюньцзы (LJZD) возник из работ И Сюэ Чжэн Чжуаня, составленных во времена династии Мин, и является классическим рецептом в ТКМ16. Как показано в таблице 1, LJZD состоит из шести традиционных трав, в том числе Codonopsis pilosula (Franch.) Наннф. (Dangshen), Poria cocos (Schw.), Wolf (Fuling), Atractylodes macrocephala Koidz. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancao), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) и Pinellia ternata (Thunb.) Брейт (Banxia), который обладает эффектом восполнения ци и укрепления селезенки, подсушивая сырость и рассасывая мокроту. В современной клинической практике его часто используют для лечения хронического гастрита, язвенной болезни желудка, двенадцатиперстной кишки. Современные фармакологические исследования показали, что LJZD и модифицированный LJZD имеют высокую прикладную ценность в адъювантном лечении ЯК и рака пищеварительного тракта 17,18,19.
В настоящее время существует множество способов построения мышиных моделей UC-CRC, но модель мышей, индуцированная азоксиметаном (AOM)/dextran sulfate sodium (DSS), является наиболее широко используемой моделью UC-CRC; клинические симптомы, морфологические и патологоанатомические наблюдения доказали, что модель очень похожа на ЯК-КРРчеловека 20,21. Основной принцип заключается в том, чтобы сначала индуцировать канцерогенез химическим канцерогеном AOM, а затем непрерывно подвергать мышей воздействию среды стимуляции воспаления DSS, чтобы имитировать непрерывное повреждение и восстановление эпителия слизистой оболочки кишечника, тем самым конструируя мышиную модельUC-CRC 22. Целью данного исследования является создание мышиной модели ЯК-КРР путем внутрибрюшинного введения АОМ и циклической стимуляции ДСС в краткосрочной перспективе, а также оценка влияния препарата и молекулярного механизма ЛЖЖД на ЯК-КРР, чтобы обеспечить научную основу для лечения ЯК-КРР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедура на животных была одобрена Комитетом по этике Чанчуньского университета китайской медицины (регистрационный номер: 2021214). Специфические мыши C57BL/6J (8-10 недель, масса 18-22 г), самцы и самки, содержались в независимо вентилируемых клетках при температуре 22 °C и относительной влажности воздуха 65%. Мыши начинали эксперимент после 7 дней адаптивного кормления, во время которого у них был свободный доступ к воде и рациону.
1. Приготовление препарата
- Подготовка LJZD
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемое китайское лекарство было приобретено в Филиале больницы Чанчуньского университета китайской медицины и было идентифицировано как подлинное китайское лекарство (см. Таблицу 1).- Положите Даншэнь (12 г), Байчжу (12 г), Ганьцао (6 г), Чэньпи (12 г), Цзянбанься (9 г) в специальный керамический горшок (см. Таблицу материалов). Добавьте 1000 мл дистиллированной воды и замочите при комнатной температуре на 1 ч (см. рисунок 1А).
- Порошок 12 г Измельчить в мелкий порошок с помощью измельчителя и замочить в 300 мл дистиллированной воды в другой емкости на 1 ч при комнатной температуре.
- Смешайте вышеуказанное китайское лекарство в специализированном керамическом горшке. Вскипятите смесь, а затем держите на среднем огне до тех пор, пока не останется всего 300 мл отвара. Используйте медицинскую марлю для процеживания и храните фильтрат при комнатной температуре.
- Добавьте 1000 мл дистиллированной воды и повторите вышеуказанную операцию с отваром еще раз. Процеживают еще раз, используя медицинскую марлю. Соедините фильтрат и кипятите до тех пор, пока не останется всего 150 мл.
- Центрифугируют концентрированную жидкость при 10 000 х г в течение 5 мин и далее концентрируют полученную надосадочную жидкость до 30 мл на среднем огне. Переложите готовый концентрат в посуду и высушите его с помощью электрической сушильной печи до тех пор, пока не останется только растворенное вещество в виде порошка.
- Взвесьте вышеуказанное твердое вещество и растворите его в стерильной дистиллированной воде до получения раствора, содержащего 22,85 мг препарата на 0,2 мл (114,16 мг/мл), что является суточной дозировкой мышей.
- Приготовление 5-аминоссалициловой кислоты
ПРИМЕЧАНИЕ: 5-аминосалициловая кислота (5-АСК; см. таблицу материалов) оказывает хорошее профилактическое действие на ЯК-КРР, и она использовалась в качестве положительного препарата в этом исследовании23.- Растворите 64 мг порошка 5-АСК в 200 мл стерильной дистиллированной воды до получения раствора 5-АСК 1,82 мг/мл. Суточная доза для одной мыши составляла 0,2 мл.
- Приготовление раствора для инъекций АОМ
- Добавьте 2,5 мл стерильной дистиллированной воды в порошок 25 мг AOM (см. Таблицу материалов) и перемешайте с помощью вихревого смесителя (см. Таблицу материалов) до получения исходного раствора AOM 10 мг/мл, храните при -20 °C до использования.
- Приготовьте раствор для инъекций АОМ, разбавив исходный раствор АОМ стерильной дистиллированной водой в соотношении 10:1 (1 мг/мл).
2. Создание модели UC-CRC
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент был разделен на 4 группы: контрольную, модельную, LJZD и группу 5-ASA, по 10 мышей в каждой группе. Кроме контрольной группы, остальные группы получали лечение АОМ и ДСС.
- Внутрибрюшинное введение раствора для инъекций АОМ
ПРИМЕЧАНИЕ: После адаптивного кормления в течение 7 дней мышам вводили раствор для инъекций AOM (1 мг/мл) путем внутрибрюшинной инъекции (см. рис. 1B).- Держите мышь животом вверх и слегка опущенной головой. Возьмитесь за кожу спины, чтобы подтянуть кожу живота, и проткните кожу примерно на 1 см справа от пересечения линии корня обоих бедер на средней линии живота шприцем объемом 1 мл (см. Таблицу материалов).
- Протолкните иглу шприца объемом 1 мл на расстояние 3-5 мм под кожей, держа ее параллельно средней линии живота, и введите иглу 0,3-0,5 мм в брюшную полость под углом 45°.
- После того, как наконечник проходит через мышцу живота, оператор ощущает внезапную потерю сопротивления. Затем потяните шприц наружу и назад, чтобы посмотреть, не просачивается ли жидкость. Если нет, медленно вводите раствор для инъекций AOM мышам в дозе 0,1 мл/10 г.
- Циклическая стимуляция 2% раствора ДСС
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждой мыши, индуцированной AOM, давали по 500 мл раствора DSS на 3-й, 6-й и 9-й неделях, и мыши свободно пили в течение этого периода.- Приготовьте 2% раствор ДСС, добавив 500 мл стерильной дистиллированной воды к 10 г ДСС (см. Таблицу материалов). Смешайте вихревым миксером и храните при температуре 4 °C до использования.
- Каждая мышь, индуцированная АОМ, свободно выпивает 500 мл 2% раствора ДСС в течение 7 дней на 3-й, 6-й и 9-й неделях после индукции АОМ.
3. Медикаментозное лечение
ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослым людям необходимо 63 г LJZD в день. Согласно формуле пересчета экспериментальной дозы препарата для мышей и человека, эквивалентная экспериментальная доза для мышей (мг/кг) = доза человека (мг/кг)/масса тела (60 кг) х 9,1, суточная доза мышей составила около 9,6 г/кг.
- На 7-й и 15-й неделях на 7-й и 15-й неделе соответственно лечат группу LJZD и группы 5-ASA 0,1 мл/10 г приготовленного раствора LJZD и 5-ASA через желудочный зонд.
- Для внутрижелудочного введения мышам выполняют следующую процедуру. Держите мышь в левой руке, а в правой держите аппарат перфузии желудка. Вставьте иглу шприца в рот и сдвиньте ее вниз по задней стенке глотки мышей. Скользите вниз по глотке, пока мыши глотают, и продолжайте двигаться вперед. Когда возникнет ощущение сопротивления, и шприц можно будет протолкнуть в глотку, вытащите иглу и завершите укол.
- Обработайте контрольную и модельную группы одинаковым количеством физиологического раствора (см. Таблицу материалов).
- Мышей в каждой группе обрабатывают соответствующим препаратом один раз в сутки в одно и то же время в течение периода введения.
4. Оценка модели UC-CRC и эффективности LJZD
- Оценка индекса активности заболевания
ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно таблице 2, индекс активности заболевания (DAI) оценивали путем объединения потери веса, вязкости кала и кровотечения из кала мышей.- Записывайте вес мышей ежедневно от начала адаптивного кормления до окончания медикаментозного лечения.
- Внимательно наблюдайте за консистенцией кала каждой подопытной мыши и записывайте испражнения как одно из трех состояний: нормальный, жидкий стул и водянистая диарея.
- Запишите фекальное кровотечение у экспериментальных животных как одно из трех состояний: отсутствие кровотечения, небольшое кровотечение и видимая кровь в стуле.
- Определение уровня IL-6 в сыворотке крови
- Лечите мышей LJZD или 5-ASA в течение 9 недель. Зафиксируйте мышей, взявшись левой рукой за кожу шеи мыши и осторожно надавливая на экспериментальный стол, чтобы принять положение бокового пролежня. Отрежьте ножницами усы мышей. Аккуратно срежьте мышам усы ножницами (см. Таблицу материалов), чтобы не допустить заражения крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, которые не могли свободно покачиваться, считались правильно зафиксированными. Если этого не происходит, мышей следует зафиксировать. - Обезболивайте мышь ингаляцией 2% изофлурана. Простерилизуйте кожу вокруг глазного яблока этанолом (см. Таблицу материалов). Осторожно надавите на кожу глаз сбоку, чтобы глазное яблоко было заложено и выпячивалось.
- Зажмите глазное яблоко локтевым пинцетом и извлеките глазные яблоки аккуратно и быстро. Дайте крови стечь в центробежную трубку (см. Таблицу материалов). В процессе нажимайте на сердце мыши, чтобы ускорить сбор крови.
- Собранную кровь хранят при комнатной температуре в течение 30 минут и центрифугируют ее при 3500 x g в течение 10 минут. Соберите надосадочную жидкость и определите уровень IL-6 в соответствии с инструкцией к набору для определения содержания IL-6 (см. Таблицу материалов).
- Лечите мышей LJZD или 5-ASA в течение 9 недель. Зафиксируйте мышей, взявшись левой рукой за кожу шеи мыши и осторожно надавливая на экспериментальный стол, чтобы принять положение бокового пролежня. Отрежьте ножницами усы мышей. Аккуратно срежьте мышам усы ножницами (см. Таблицу материалов), чтобы не допустить заражения крови.
- Разделение колоректальной ткани
- Усыпляют мышей после забора крови путем вдыхания 5% передозировки изофлурана и вывиха шейки матки (см. Таблицу материалов) в соответствии с этикой животных.
- Держите мышей в криогенной анатомической среде. Обездвижите мышей в положении лежа на спине. Обрежьте ножницами волосы в нижней части живота и простерилизуйте их этанолом.
- Зажмите точку пересечения двух корешков бедра и средней линии живота щипцами для век (см. Таблицу материалов). Сделайте ножницами поперечный разрез примерно 1-1,5 см.
- Обрежьте продольный разрез по срединной линии живота от середины поперечного разреза по направлению к мечевидному отростку.
- Удалите околоректальные ткани в направлении анального отверстия, чтобы отделить толстую кишку от окружающих тканей. Будьте осторожны, чтобы не повредить колоректум.
- Отодвиньте кожу живота в стороны, чтобы полностью обнажить колоректум. Удалить колоректум из брюшной полости щипцами для век и отрезать сегменты от анального отверстия до слепой кишки (исключая); Общая длина около 10 см. Полученные колоректальные ткани хранят в физиологическом растворе при температуре 4 °С.
- Оценка длины и веса прямой кишки
- Извлеките физиологический раствор при температуре 4 °C с помощью иглы объемом 5 мл (см. Таблицу материалов), чтобы промыть внутреннюю часть колоректума. Затем поместите колоректум на впитывающую бумагу, чтобы впитать влагу ткани.
- Взвесьте колоректальные ткани, а затем положите их на бумагу формата А4, чтобы измерить их длину.
- Измерьте количество опухолей в толстой кисти
- Разрежьте толстую кишку вдоль, чтобы полностью развернуть ее, и понаблюдайте за количеством и размером опухолей в колоректуме.
- Патологоанатомический анализ толстой кишки
- Зафиксируйте толстую кишку в 4% параформальдегиде на 24 ч. Неподвижная ткань прямой кишки помещается в расплавленный парафин и непрерывно разрезается толщиной 5 мкм с помощью микротома для замораживания тканей.
- Согласно методике Hou et al.24, срезы депарафинизируют в ксилоле, а затем обезвоживают последовательными концентрациями этанола. После окрашивания раствором гематоксилина в течение 5 мин промыть срезы чистой водой. После этого окрашивают 0,5% раствором эозина в течение 1 мин (см. Таблицу материалов).
- Снова выполните градиентное обезвоживание и прозрачную обработку ксилолом. Запечатайте срезы и осмотрите их под оптическим микроскопом (см. таблицу материалов) и сфотографируйте, как описано Xie et al.25.
- Иммуногистохимический анализ толстой кишки
- Депарафинизируйте и обезвоживайте срезы в соответствии с вышеописанным методом. Репарировать антиген в срезах с помощью техники термической репарации под высоким давлением, как описано Gok et al.26.
- Замочите срезы в эндогенных блокаторах пероксидазы при комнатной температуре на 15 мин. Запечатайте срезы козьей сывороткой (см. Таблицу материалов).
- Добавьте в срезы первичные антитела ZO-1 (1:1000), окклюдин (1:1000) и KI67 (1:500; см. таблицу материалов) и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Срезы промывают буфером PBS (см. Таблицу материалов), добавляют к нему вторичные антитела общего назначения (1:5000; см. Таблицу материалов) и инкубируют при 37 °C в течение 30 мин.
- Добавьте решение DAB (см. Таблицу материалов) в разделы для разработки цвета. Окрасьте срезы раствором гематоксилина.
- Обезвоживайте, прозрачните и снова загерметизируйте секции. Наблюдайте за экспрессией белка с помощью оптического микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Отвар ЛЖЗД готовили в соответствии с соотношением составов препаратов в таблице 1 и методом отваривания ТКМ на рисунке 1А. В соответствии с временным моментом, указанным на рисунке 1B, мышам внутрибрюшинно вводили 1 мг/мл АОМ на7-й день, и мышам предоставляли свободный доступ к питьевой воде, содержащей 2% DSS, на3-й,6-й и9-й неделях. Модель мыши UC-CRC была успешно создана на15-й неделе. Между тем, мышей лечили LJZD через зонд с 7-й по 15-ю неделю. Данные показали, что по сравнению с контрольной группой, в модельной группе ЯК-КРР наблюдалась значительная потеря массы тела, которая была смягчена лечением LJZD (рис. 2A, стр. < 0,01). В конце исследования лечение LJZD улучшило показатель DAI по сравнению с модельной группой UC-CRC (рис. 2B). По сравнению с контрольной группой, модельная группа ЯК-КРР имела более короткую колоректальную длину, которая была увеличена при лечении LJZD (рис. 2C, D, P < 0,01). Отношение массы толстой кишки к массе тела отражает развитие КРР у мышей, а более высокое соотношение указывает на развитие острой опухоли27. По сравнению с контрольной группой индекс колоректальных органов модельной группы был достоверно повышен, а лечение ЖЖЖД значительно снижало индекс колоректальных органов (рис. 2E, P < 0,05). Кроме того, лечение LJZD также ингибировало образование колоректальных опухолей (рис. 2F, P < 0,01) и уровень сывороточного провоспалительного фактора IL-628 (рис. 2G, P < 0,05).
Патологоанатомические результаты подтвердили, что по сравнению с контрольной группой, мыши в модельной группе UC-CRC имели более крупные колоректальные опухоли и сформировали аденокарциному, в то время как лечение LJZD уменьшало размер и степень опухоли (рис. 3). Иммуногистохимические данные показали, что лечение LJZD усиливало функцию колоректального барьера у мышей модели UC-CRC, о чем свидетельствует повышенная экспрессия белков ZO-1 и окклюдина29 (рис. 4). Параллельно лечение LJZD подавляло уровни экспрессии белка онкомаркера KI6730 (рис. 4).
Рисунок 1: Подготовка LJZD и создание мышиной модели рака колопроктита. А) Смесь Даншэнь (12 г), Байчжу (12 г), Ганьцао (6 г), Ченпи (12 г) и обработанного имбирем Бань Ся (9 г) погружали в 1000 мл дистиллированной воды комнатной температуры на 1 ч. 12 г порошка Фулинга замачивали в 300 мл дистиллированной воды комнатной температуры в течение 1 ч. Смесь вышеуказанных шести трав отваривали при 100 °C в течение 40 мин. (B) На 7-й день мышам C57BL/6J внутрибрюшинно вводили 1 мг/мл AOM. Мышам давали воду, содержащую 2% DSS, вволю на3-й,6-й и9-й неделях. С 7 по 15 недель мышам давали LJZD через зонд. Сокращения: АОМ, азометан; DAI, индекс активности заболевания; ДСС, декстран сульфат натрия; LJZD, отвар Люцзюньцзы; w, неделя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оценка модели UC-CRC и эффективности LJZD. (A) LJZD улучшил массу тела у мышей модели UC-CRC. (B) LJZD улучшил показатели DAI у мышей модели UC-CRC. (С, Г) LJZD увеличил длину толстой кишки у мышей модели UC-CRC. (E) LJZD снижал органный индекс толстой кишки у мышей модели UC-CRC. (F) LJZD ингибировал колоректальный опухолегенез у мышей модели колопроктита. (G) LJZD подавлял уровень IL-6 в сыворотке крови у мышей модели UC-CRC. #P< 0,05 и ##P< 0,01 по сравнению с контрольной группой; *P < 0,05 и **P< 0,01 по сравнению с модельной группой. Данные были выражены в виде среднего ± стандартных отклонений (n=10) и проанализированы методом одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим критерием Тьюки. P < 0,05 указывали на статистически значимую разницу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Оценка патологических особенностей колоректальных тканей у мышей методом окрашивания гематоксилин-эозином. В контрольной группе патологических повреждений не выявлено. Опухолевая ткань модельной группы UC-CRC была большой и сформировала аденокарциному и неоплазию высокой степени злокачественности, в то время как в группе лечения LJZD опухолевая ткань была редуцирована, что сопровождалось небольшим количеством локальной аденомы и низкодифференцированной неоплазии. Черная стрелка обозначает предраковую диспластическую опухоль железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Влияние LJZD на функцию колоректального барьера и маркер рака у мышей модели UC-CRC. (A) Иммуногистохимические изображения ZO-1, окклюдина и KI67. (B) Статистические результаты экспрессии белков ZO-1, Окклюдина и KI67. Лечение LJZD увеличивало экспрессию функциональных белков колоректального барьера ZO-1 и окклюдина, в то время как уровень онкомаркера KI67 снижался у мышей модели UC-CRC. ## P < 0,01 по сравнению с контрольной группой; ** P < 0,01 по сравнению с модельной группой. Данные были выражены в виде среднего ± стандартных отклонений (n=10) и проанализированы методом одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим критерием Тьюки. P < 0,05 указывали на статистически значимую разницу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Компоненты | Пиньинь | Вес (г) |
| Кодонопсис Радикс | Дангшэнь | 12 |
| Пориа кокосовый орех | Фулинг | 12 |
| Atractylodis Macrocephalae Rhizoma | Байчжу | 12 |
| Солодка | Ганьцао | 6 |
| Сушеная цедра апельсина | Ченпи | 12 |
| Корневище Pinelliae Preparata | Цзянбанься | 9 |
Таблица 1: Состав и пропорции препаратов в ЖЖЖД.
| Элементы | Степень или симптомы | Отзывов |
| Потеря веса | < 1% | 0 |
| 1%-5% | 1 | |
| 5%-10% | 2 | |
| 10%-15% | 3 | |
| ≥15% | 4 | |
| Анализ кала на скрытую кровь | Отрицательная | 0 |
| Положительная | 2 | |
| видимая кровь в стуле невооруженным глазом | 4 | |
| Консистенция фекалий | нормальный | 0 |
| жидкий стул, | 2 | |
| водянистая диарея, | 4 |
Таблица 2: Оценка индекса активности заболевания для модели UC-CRC у мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
КРР является одним из самых распространенных видов рака во всем мире, ежегодно регистрируется около 1 148 000 новых случаев заболевания и более 576 000 смертей. КРР можно разделить на три типа в зависимости от различных причин, включая наследственный, спорадический и ЯК-КРР31. Частота КРР у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника, такими как ЯК, значительно выше, чем в общей популяции. ЯК стимулирует развитие КРР через воспалительно-раковый путь, который отличается от типичного пути аденома-аденокарцинома6. В настоящее время причина ЯК-КРР неизвестна, в основном она вызвана длительным рецидивирующим хроническим воспалением с летальностью до 60%32,33. Не существует эффективного лечения ЯК-КРР, который в последние годы является горячей точкой исследований. Понимание молекулярного механизма ЯК-КРР имеет решающее значение для раннего выявления и точного лечения ЯК-КРР.
В настоящее время существует множество методов построения животных моделей ЯК-КРР, и механизмы формирования различны. Нокаут гена IL-10 или Muc2/4, приводящий к дефектам эпителиального барьера, может индуцировать спонтанный колит у мышей, поэтому его часто используют для построения моделей CRC животных, основанных на генетических дефектах, связанных с UC34,35,36. Тем не менее, животная модель ЯК-КРР, индуцированная нокаутом гена, не может смоделировать полный патогенез заболевания, а метод ее действия сложен, эксперимент дорог и имеет очевидные ограничения. Химическая индукция является классическим и распространенным методом построения моделей UC-CRC на животных37,38. DSS, AOM и диметилгидразин являются широко используемыми химическими индукторами для построения UC-CRC. Тем не менее, использование только этих химических реагентов для создания животных моделей занимает много времени и имеетнизкую вероятность успеха. Исследования показали, что частота возникновения ЯК-КРР, индуцированного комбинацией АОМ и DSS, может достигать почти 100%40. По сравнению с другими методами, комбинация AOM/DSS имеет такие преимущества, как простота эксплуатации, сильная управляемость, короткий цикл и высокая скорость репликации, а также может лучше моделировать ЯК-КРР человека с точки зрения патологии и молекулярного механизма 40,41,42. Несмотря на то, что использование стимуляции цикла AOM/DSS для построения модели UC-CRC имеет много преимуществ, оно также имеет недостатки, такие как длительное время моделирования, дорогостоящие моделирующие реагенты и все еще не может полностью смоделировать патогенез UC-CRC человека.
Для того, чтобы найти потенциальную терапевтическую мишень для ЯК-КРР, мы использовали AOM, химический канцероген, в сочетании с DSS-индуцированными мышами для создания модели ЯК-КРР. В этом исследовании у мышей, подвергшихся воздействию АОМ и циклической стимуляции DSS, наблюдалась различная степень симптомов, связанных с ЯК-КРР. По сравнению с контрольной группой показатель DAI модельной группы был значительно повышен, что проявлялось потерей массы тела, стулом с кровью, жидким стулом или водянистой диареей. В то время как LJZD значительно снизил оценку DAI. Укороченная длина колоректальной кишки является важным маркером воспалительной реакции при ЯК-КРР43,44. В этом исследовании длина колоректума модельных мышей была значительно короче, чем у контрольной группы, и LJZD мог улучшить укороченный колоректум. На слизистой оболочке толстой кишки развивается хроническое воспаление, которое постепенно перерастает в атипичную гиперплазию колоректальной ткани и в конечном итоге вызывает рак45. В данном исследовании количество опухолей в колоректальной ткани мышей модельной группы значительно увеличилось по сравнению с контрольной группой, и, соответственно, увеличилась и масса колоректальной ткани. После лечения LJZD количество опухолей значительно уменьшилось, а масса толстой кишки уменьшилась. Предполагается, что LJZD оказывает значительное ингибирующее действие на формирование КРР, индуцированного ЯК. Предыдущие исследования показали, что LJZD может облегчить воспаление и снизить уровни экспрессии TNF-α, IL-6 и IL-1β in vivo 16,28,46. В данном исследовании уровень ИЛ-6 в сыворотке крови мышей в модельной группе был повышен, но продукция сывороточного ИЛ-6 была значительно ингибирована после лечения LJZD.
Микроскопическое наблюдение показало воспалительную инфильтрацию тканей прямой кишки, разрушение слизистого барьера, снижение секреции слизи, нерегулярность или исчезновение бокаловидных клеток, искажение или атрофию кишечных крипт, а также явное нарушение структуры железы у мышей, получавших AOM/DSS. После лечения LJZD морфология бокаловидных клеток в колоректальной ткани была нормальной, структура углубления и железы была нормальной, повреждение слизистого барьера улучшилось. Эпителиальное плотное соединение (TJ) является незаменимым механическим барьером для поддержания целостности и проницаемости клеток, в основном включая ZO-1 и окклюдин29. Сообщалось, что экспрессия белков TJ, таких как ZO-1, в колоректальной ткани пациентов с ЯК-КРР значительно снижена47,48. Это исследование показало, что структура ткани колоректальной слизистой оболочки мышей UC-CRC была разрушена, а экспрессия ZO-1 и окклюдина в ткани снизилась, в то время как LJZD может обратить вспять это снижение, предполагая, что LJZD может защищать целостность слизистого барьера толстой кишки, увеличивая экспрессию ZO-1 и окклюдина. Ядерно-ассоциированный антиген (KI67) является важным компонентом регуляции клеточного цикла и широко используется в качестве индикатора пролиферативной активности опухолевых клеток30,49. В этом исследовании экспрессия белка KI67 была увеличена в модельной группе по сравнению с контрольной группой, что указывает на значительную пролиферацию опухолевых клеток в колоректальной ткани. После лечения LJZD экспрессия белка KI67 была снижена, что показало, что LJZD оказывает хорошее влияние на UC-CRC.
Таким образом, внутрибрюшинная инъекция AOM и стимуляция кровообращения DSS могут эффективно создать модель UC-CRC за короткий период времени и аналогичны UC-CRC человека с точки зрения гистопатологии и молекулярных механизмов формирования. В качестве классического рецепта LJZD может снижать показатель DAI, массу колоректальной ткани и уровни воспалительного фактора, эффективно ингибировать укорочение колоректальной длины и играть роль в стадии ЯК у мышей с ЯК-КРР. Одновременно он может увеличивать экспрессию белков TJ, значительно улучшать патологическое повреждение колоректальной ткани, снижать экспрессию белка KI67, значительно снижать частоту возникновения тканевых опухолей, ингибировать процесс трансформации ЯК в КРР. Это исследование дает новую идею для лечения ЯК-КРР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Департаментом науки и технологий провинции Цзилинь (YDZJ202201ZYTS181).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane | Sigma | A5486 | |
| 5-amino salicylic acid | Kuihua Pharmaceuticals Group Jiamusi Luling Pharmaceutical Co., Ltd | 3819413 | |
| C57BL/6J mice | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd | NO 210726210100853716 | |
| Cover slip | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432C | |
| DAB color development kit | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 2005289 | |
| Dewatering machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JJ-12J | |
| Dextran sulfate sodium | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd | MB5535 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Hematoxylin-eosin dye | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | B1000 | |
| IL-6 | Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd | MM-0163M2 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22-10 | |
| KI67 primary antibody | Google Biotechnology Inc | GB121141 | |
| Neutral gum | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | 10004160 | |
| Object slide | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432A | |
| Occludin primary antibody | Affnity | DF7504 | |
| Orthostatic optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse CI | |
| Pathological microtome | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| ZO-1 primary antibody | Abcam | ab221547 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
- Tsai, K. Y., et al. Novel heavily fucosylated glycans as a promising therapeutic target in colorectal cancer. J Transl Med. 21 (1), 505 (2023).
- Chen, X., et al. Smoking, genetic predisposition, and colorectal cancer risk. Clin Transl Gastroenterol. 12 (3), e00317 (2021).
- Keum, N., Giovannucci, E. Global burden of colorectal cancer: emerging trends, risk factors and prevention strategies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (12), 713-732 (2019).
- Sninsky, J. A., Shore, B. M., Lupu, G. V., Crockett, S. D. Risk factors for colorectal polyps and cancer. Gastrointest Endosc Clin N Am. 32 (2), 195-213 (2022).
- Rivera, A. P., et al. Ulcerative colitis-induced colorectal carcinoma: A deleterious concatenation. Cureus. 14 (2), e22636 (2022).
- Faye, A. S., Holmer, A. K., Axelrad, J. E.
- Becker, W. R., et al. Single-cell analyses define a continuum of cell state and composition changes in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer. Nat Genet. 54 (7), 985-995 (2022).
- Choi, J. K., Kim, D. W., Shin, S. Y., Park, E. C., Kang, J. G. Effect of ulcerative colitis on incidence of colorectal cancer: Results from the nationwide population-based cohort study (2003-2013). J Cancer. 7 (6), 681-686 (2016).
- Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
- Shah, S. C., Itzkowitz, S. H. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mechanisms and management. Gastroenterology. 162 (3), 715.e3-730.e3 (2022).
- Fabregas, J. C., Ramnaraign, B., George, T. J. Clinical updates for colon cancer care in 2022. Clin Colorectal Cancer. 21 (3), 198-203 (2022).
- Hu, J., et al. Pharmacological and molecular analysis of the effects of Huangqi Jianzhong decoction on proliferation and apoptosis in GES-1 cells infected with H. pylori.Front Pharmacol. 13, 1009705 (2022).
- Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115876 (2023).
- Zhang, X. Y., et al. Sishen pill maintained colonic mucosal barrier integrity to treat ulcerative colitis via Rho/ROCK signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5536679 (2021).
- Wu, X., Dai, Y., Nie, K. Research progress of Liujunzi decoction in the treatment of tumor-associated anorexia. Drug Des Devel Ther. 16, 1731-1741 (2022).
- Han, Y., et al. Liujunzi decoction exerts potent antitumor activity in oesophageal squamous cell carcinoma by inhibiting miR-34a/STAT3/IL-6R feedback loop and modifies antitumor immunity. Phytomedicine. 111, 154672 (2023).
- Chen, D., Zhao, J., Cong, W. Chinese herbal medicines facilitate the control of chemotherapy-induced side effects in colorectal cancer: Progress and perspective. Front Pharmacol. 9, 1442 (2018).
- Wang, M., Wang, S., Su, Q., Ma, T. Effect of combining early chemotherapy with Zhipu Liujunzi decoction under the concept of strengthening and consolidating body resistance for gastric cancer patients and nursing strategy. Contrast Media Mol Imaging. 2021, 2135924 (2021).
- Lin, Y., Koumba, M. H., Qu, S., Wang, D., Lin, L. Blocking NFATc3 ameliorates azoxymethane/dextran sulfate sodium induced colitis-associated colorectal cancer in mice via the inhibition of inflammatory responses and epithelial-mesenchymal transition. Cell Signal. 74, 109707 (2020).
- Yu, C. T., et al. Identification of significant modules and targets of Xian-Lian-Jie-Du decoction based on the analysis of transcriptomics, proteomics and single-cell transcriptomics in colorectal tumor. J Inflamm Res. 15, 1483-1499 (2022).
- Lin, L., Wang, D., Qu, S., Zhao, H., Lin, Y. miR-370-3p alleviates ulcerative colitis-related colorectal cancer in mice through inhibiting the inflammatory response and epithelial-mesenchymal transition. Drug Des Devel Ther. 14, 1127-1141 (2020).
- Qiu, X., Ma, J., Wang, K., Zhang, H. Chemopreventive effects of 5-aminosalicylic acid on inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer and dysplasia: a systematic review with meta-analysis. Oncotarget. 8 (1), 1031-1045 (2017).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. J Ethnopharmacol. 249, 112426 (2020).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Gok, A., et al. Role of reduced Bdnf expression in novel Apc mutant allele-induced intestinal and colonic tumorigenesis in mice. In Vivo. 37 (4), 1562-1575 (2023).
- Lin, Y., et al. Pou3f1 mediates the effect of Nfatc3 on ulcerative colitis-associated colorectal cancer by regulating inflammation. Cell Mol Biol Lett. 27 (1), 75 (2022).
- Xu, W., Zhao, R., Yuan, B. The therapeutic effect of traditional LiuJunZi decoction on ovalbumin-induced asthma in Balb/C mice. Can Respir J. 2021, 6406295 (2021).
- Kaihara, T., et al. Redifferentiation and ZO-1 reexpression in liver-metastasized colorectal cancer: possible association with epidermal growth factor receptor-induced tyrosine phosphorylation of ZO-1. Cancer Sci. 94 (2), 166-172 (2003).
- Lei, H. T., et al. Ki67 testing in the clinical management of patients with non-metastatic colorectal cancer: Detecting the optimal cut-off value based on the restricted cubic spline model. Oncol Lett. 24 (6), 420 (2022).
- Olén, O., et al. Colorectal cancer in ulcerative colitis: a Scandinavian population-based cohort study. Lancet. 395 (10218), 123-131 (2020).
- Arnold, M., et al. Global patterns and trends in colorectal cancer incidence and mortality. Gut. 66 (4), 683-691 (2017).
- Biller, L. H., Schrag, D. Diagnosis and treatment of metastatic colorectal cancer: A review. Jama. 325 (7), 669-685 (2021).
- Talero, E., et al. Expression patterns of sirtuin 1-AMPK-autophagy pathway in chronic colitis and inflammation-associated colon neoplasia in IL-10-deficient mice. Int Immunopharmacol. 35, 248-256 (2016).
- Qian, Z., et al. Mulberry fruit prevents LPS-induced NF-κB/pERK/MAPK signals in macrophages and suppresses acute colitis and colorectal tumorigenesis in mice. Sci Rep. 5, 17348 (2015).
- Pothuraju, R., et al. Depletion of transmembrane mucin 4 (Muc4) alters intestinal homeostasis in a genetically engineered mouse model of colorectal cancer. Aging. 14 (5), 2025-2046 (2022).
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Zeng, B., et al. Dextran sodium sulfate potentiates NLRP3 inflammasome activation by modulating the KCa3.1 potassium channel in a mouse model of colitis. Cell Mol Immunol. 19 (8), 925-943 (2022).
- Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S.
- Tanaka, T., et al. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Song, J. L., et al. Dietary mixed cereal grains ameliorate the azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colonic carcinogenesis in C57BL/6J mice. J Med Food. 23 (4), 440-452 (2020).
- Zou, Y. F., et al. Effects of Huaier extract on ameliorating colitis-associated colorectal tumorigenesis in mice. Onco Targets Ther. 13, 8691-8704 (2020).
- Luo, X., et al. Obacunone reduces inflammatory signalling and tumour occurrence in mice with chronic inflammation-induced colorectal cancer. Pharm Biol. 58 (1), 886-897 (2020).
- Dai, Y., et al. Liujunzi Decoction ameliorated cisplatin-induced anorexia by inhibiting theJAK-STAT signaling pathway and coordinating anorexigenic and orexigenic neuropeptides in rats. J Ethnopharmacol. 285, 114840 (2022).
- Ghosh, D., Dutta, A., Kashyap, A., Upmanyu, N., Datta, S. PLP2 drives collective cell migration via ZO-1-mediated cytoskeletal remodeling at the leading edge in human colorectal cancer cells. J Cell Sci. 134 (18), jcs253468 (2021).
- Yan, S., et al. Berberine regulates short-chain fatty acid metabolism and alleviates the colitis-associated colorectal tumorigenesis through remodeling intestinal flora. Phytomedicine. 102, 154217 (2022).
- Ma, Y. L., et al. Immunohistochemical analysis revealed CD34 and Ki67 protein expression as significant prognostic factors in colorectal cancer. Med Oncol. 27 (2), 304-309 (2010).
