Herstellung und Charakterisierung von kolorektalen Krebs-Organoiden aus der SW1222-Zelllinie in ultrakurzer selbstorganisierender Peptidmatrix

In den letzten Jahren haben sich selbstorganisierende Peptide (SAPs) als vielversprechende Biomaterialien für Tissue-Engineering-Anwendungen herauskristallisiert. SAPs besitzen einzigartige Eigenschaften, darunter die spontane Bildung von Nanofasern, Biokompatibilität, biologische Abbaubarkeit und Nicht-Immunogenität, was sie zu attraktiven Kandidaten für die Gerüstentwicklung^{macht 1}. SAPs wurden zuvor zusammen mit verschiedenen Zelltypen verwendet, und insbesondere berichtete ultrakurze SAPs haben die Verkapselung von Stammzellen erleichtert und gleichzeitig ihre Pluripotenz über längere Zeiträume von mehr als 30 Passagen und mit minimaler Inzidenz von Chromosomenaberrationen aufrechterhalten ^2,3,4. Daher war die Adaption von SAPs für ihren Einsatz in der Organoidkultur ein rationaler Folgeschritt.

Organoide sind komplexe dreidimensionale Strukturen, die aus einzelnen pluripotenten Zellen entstehen. Aus diesen Strukturen entstehen verschiedene Zelltypen, die sich dann selbst organisieren, um die Entwicklungsprozesse des Embryonal- und Gewebewachstums in vitro zu replizieren ⁵. Dieses innovative Framework hat sich zu einem beeindruckenden Werkzeug für In-vitro-Untersuchungen entwickelt, das die genetischen, phänotypischen und verhaltensbezogenen Merkmale, die für In-vivo-Organe charakteristisch sind, effizient konserviert⁶. Nichtsdestotrotz ist ein Haupthindernis für den Übergang von Organoid-basierten Befunden vom Labor zum Krankenbett die Notwendigkeit der Reproduzierbarkeit⁷. Diese Variation der Ergebnisse wird in erster Linie auf die Schwierigkeit zurückgeführt, humane pluripotente Stammzellen vollständig in spezialisierte Zelllinien zu differenzieren, die durch das Fehlen einer authentischen Gewebearchitektur und die inhärente Komplexität, die in Organoidmodellen angetroffen wird, noch verstärkt wird. Angesichts der zunehmenden Popularität von stammzell- und organoidbasierten Studien⁸ ist die Nachfrage nach Biomaterialien mit dynamisch-mechanischen Eigenschaften und Integrin-ähnlichen Adhäsionsstellen oder Gerüsten mit kontrollierter Abbaubarkeit^{gestiegen 7,9}. Diese Attribute können durch den strategischen Einsatz biofunktionalisierter SAPs effektiv abgestimmt werden.

SAPs sind kurze Sequenzen von Aminosäuren mit der inhärenten Fähigkeit, sich spontan in wohldefinierten Strukturen zu organisieren¹⁰. Diese Peptide enthalten häufig abwechselnd hydrophobe und hydrophile Reste, die ihre Selbstorganisation durch nicht-kovalente Wechselwirkungen, einschließlich Wasserstoffbrückenbindungen, elektrostatischer Wechselwirkungen und hydrophober Effekte, vorantreiben^11,12. Der Selbstorganisationsprozess dieser Peptide wird in erster Linie durch die Notwendigkeit angetrieben, die freie Energie des Systems zu minimieren. In einer wässrigen Umgebung neigen die hydrophoben Rückstände dazu, sich zu gruppieren, um ihre Exposition gegenüber Wasser zu minimieren, während die hydrophilen Rückstände mit den umgebenden Wassermolekülen interagieren. Dieses Phänomen führt zur Bildung verschiedener Nanostrukturen. In diesem Fall bilden ultrakurze selbstorganisierende Peptide Nanofasern mit Eigenschaften, die von der Peptidsequenz und den Umweltbedingungen abhängen 2,12,13,14,15,16. Diese Peptide nehmen eine β-Wind-Konformation an, bei der sich einzelne Peptidstränge parallel oder antiparallel zueinander ausrichten und durch Wasserstoffbrückenbrücken stabilisiert werden (Abbildung 1). Das Vorhandensein positiver Ionen beschleunigt die Selbstorganisationsprozesse, die zur Bildung von Nanofasern führen.

Es wurde festgestellt, dass Peptid-Nanofasern eine angeborene Fähigkeit besitzen, erhebliche Mengen an Wasser einzuschließen. Diese Eigenschaft erleichtert die Erzeugung eines Hydrogels, das sich anschließend als biokompatibler und biologisch abbaubarer dreidimensionaler Raum manifestiert, der der Zellproliferation und dem Zellwachstum förderlich ist. Diese selbstorganisierenden Peptid-Nanofasern ahmen die topographischen Merkmale, die der natürlichen Umgebung der extrazellulären Matrix (ECM) innewohnen, auf komplexe Weise^{nach 1}. Diese Ähnlichkeit stattet die Zellen mit einer Umgebung aus, die ihren physiologischen Lebensraum imitiert, was die optimalen Zellaktivitäten weiter fördert¹⁷. Darüber hinaus ermöglicht die diesen Peptiden innewohnende Vielseitigkeit ein hohes Maß an Abstimmbarkeit⁴. Diese Anpassungsfähigkeit ermöglicht Änderungen der Eigenschaften der Matrix, wie z. B. Steifigkeit, Gelierungskinetik und Porosität. Diese Anpassungen werden durch Modifikationen an der Peptidsequenz erreicht. Folglich haben sich selbstorganisierende Peptide (SAPs) zu zentralen Komponenten in der modernen Biomaterialwissenschaft entwickelt und werden häufig als Gerüste für die Geweberegeneration und Zellkultur verwendet^13,17.

Einer der entscheidenden Vorteile von selbstorganisierenden Peptiden ist ihre Fähigkeit, auf molekularer Ebene leicht synthetisiert und modifiziert zu werden. Dieser Vorteil ermöglicht den Einbau spezifischer funktioneller Gruppen oder bioaktiver Motive in die Peptidsequenz, was das Design von Peptiden mit maßgeschneiderten Eigenschaften und Funktionalitäten ermöglicht 18,19,20 (Abbildung 1B). So können beispielsweise biofunktionalisierte SAPs so gestaltet werden, dass sie die EZM nachahmen und die Differenzierung mit Hilfe des RGD-Peptids^{fördern 19,21}. Es wurde auch berichtet, dass das Peptid Ben-IKVAV aufgrund seiner ligandenspezifischen Motity die Expression neuronaler Marker signifikant erhöht²². Diese Peptide können auch so verändert werden, dass sie bioaktive Moleküle anzeigen, wie z. B. Integrin-bindende Peptide, um das Überleben der Zellen zu verbessern²³. Schließlich wurden weitere biofunktionalisierte SAPs entwickelt, um die Angiogenese zu fördern, indem die IKVAV- und YIGSR-Motive in ihre Strukturen aufgenommen^{wurden 24}.

Biofunktionalisierte SAPs, über die in einer früheren Veröffentlichung berichtet wurde, zeigen, dass die Selbstorganisation weiter modifiziert werden kann, indem das naive Peptid einbezogen wird, von dem das biofunktionalisierte SAP abgeleitet wurde²⁵. Diese SAP-Mischungen können auch eine breite Palette von SAP-Formulierungen liefern, die sich in ihrer biochemischen Aktivität und ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften unterscheiden. Zum Beispiel ist das amphiphile Peptid IIFK ein ultrakurzes SAP, das einer Biofunktionalisierung mit verschiedenen Motiven standhalten kann, beispielhaft durch den Einbau des IKVAV-Motivs (Abbildung 1B). Beide Peptide können Nanofasern bilden, sowohl allein als auch kombiniert. Jede Formulierung führt zu Hydrogelen mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften (Abbildung 2)

Aufgrund der umfangreichen Palette potenzieller Permutationen und Alternativen, die sich aus der Biofunktionalisierung von SAPs ergeben, besteht jedoch die Notwendigkeit, eine schnelle und kostengünstige Option für Organoidtests bereitzustellen. Ein Kandidat für eine solche intensive und kostengünstige Organoid-Evaluierung ist die SW1222-Zelllinie, die aus dem humanen kolorektalen Adenokarzinom gewonnen wird^26,27. SW1222-Zellen besitzen Eigenschaften, die ihre Aggregation zu 3D-Strukturen ermöglichen, die Organoiden ähneln, was sie zu einem idealen Modell für die Untersuchung der Gewebeentwicklung und Anwendungen in der regenerativen Medizin macht. SW1222-Zellen wurden aufgrund ihrer intrinsischen Überexpression des LGR5-Gens als in der Lage identifiziert, Organoide zu erzeugen²⁷. Die Bildung von Organoiden aus einzelnen LGR5⁺-Stammzellen wurde bereits überzeugend nachgewiesen, ebenso wie die Neigung von SW1222-Zellen, morphologische Eigenschaften eines Darmkrebs-Organoids^{zu erreichen 28}.

In diesem Methodenpapier stellen wir detaillierte Protokolle zur Bewertung und Charakterisierung der Auswirkungen verschiedener biofunktioneller Peptide auf die Zelladhäsion und Lumenbildung anhand von SW1222-Zellen vor (Abbildung 3). Durch die Bereitstellung von Schritt-für-Schritt-Verfahren und bildgebenden Analysemethoden hoffen wir, wertvolle Einblicke in die Biofabrikation von Organoiden und die Bewertung vereinfachter SAP-Matrizen für die Organoidkultur zu bieten.

1. Vorbereitung des Puffers und der Lösung

HINWEIS: Bei allen angegebenen Konzentrationen handelt es sich um Endkonzentrationen.

1. Fügen Sie fötales Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin in einer Endkonzentration von 10 % bzw. 1 % hinzu, um vollständiges Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) herzustellen. Im Dunkeln bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern.
2. Mischen Sie MgCl₂ (3 mM), Saccharose (300 mM) und Triton X-100 (0,5%) in Phosphatpuffersalzlösung (PBS), um den Permeabilisierungspuffer herzustellen. Lagern Sie diese Lösung bis zu 2 Monate bei 4 °C.
3. Kombinieren Sie Rinderserumalbumin (BSA, 1%), Glycin (0,3 M) und Tween-20 (0,1%) in PBS, um einen Blockierungspuffer herzustellen. Lagern Sie diese Lösung bis zu 2 Monate bei 4 °C.
4. 10x bis 2x PBS mit Reinstwasser unter sterilen Bedingungen verdünnen. Lagern Sie diese Lösung über 6 Monate bei Raumtemperatur.
5. Sterilisieren Sie 3 mg des Peptidpulvers 30 Minuten lang unter ultraviolettem Licht. Fügen Sie 500 μl Reinstwasser hinzu, um es mit einem Vortex-Mischer aufzulösen.
   HINWEIS: Die Endkonzentration muss doppelt so hoch sein wie die Zielkonzentration, d. h. 6 mg/ml, da die 1x-Konzentration 3 mg/ml beträgt.

2. Herstellung von Darmkrebs-Organoiden aus SW1222 in Peptid

1. Tauen Sie ein Aliquot über Nacht bei 4 °C auf und bewahren Sie es bis zur Vorbereitung der Kellermatrixkontrolle in Eis auf.
2. Geben Sie ein 10-μl-Tröpfchen mit 2x Peptidlösung in die Mitte jeder Vertiefung in eine 24-Well-Platte. Lassen Sie die Platte 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Alternativ können Sie 8-10 Tröpfchen pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte geben.
   HINWEIS: Proben, die für die Konfokal- und Elektronenmikroskopie bestimmt sind, sind leichter zu manipulieren, wenn sie auf ein steriles Deckglas gesät werden.
3. Fügen Sie 10 μL von 2x PBS hinzu. Mischen Sie die PBS-Lösung vorsichtig mit der Spitze. Lassen Sie die Gele mindestens 20 Minuten lang stabilisieren, um sicherzustellen, dass die Tröpfchen nahezu intakt bleiben.
   HINWEIS: Das Ziel der PBS-Zugabe und des schonenden Mischens besteht darin, die Integrität des Tröpfchens zu erhalten und zu vermeiden, dass sich das Hydrogel in einer Schicht ausbreitet.
4. SW1222-Zellen werden mit 0,125 % Trypsin-EDTA-Lösung (5 ml) abgenommen. Die Zellen werden 5-10 min lang mit Trypsin bei 37 °C inkubiert, bis sie sich vom Kolben lösen. Verzichten Sie darauf, auf den Kolben zu klopfen, um ein Verklumpen der Zellen zu vermeiden.
5. Fügen Sie 5 ml vollständiges Medium hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem 30 μm Zellsieb. Alternativ können Sie eine Spritze mit einer 25-G-Nadel verwenden, um die Aggregate aufzubrechen.
6. Bereiten Sie eine Zellsuspension von 0,4 × 10⁶ Zellen/ml vor und injizieren Sie 2 μl der Zellsuspension in jedes Peptidtröpfchen mit einer 10-μl-Mikropipette.
7. Inkubieren Sie die Tröpfchen 30 Minuten lang bei 37 °C, 5 % CO_2. Geben Sie nach der Inkubation 0,5 ml supplementiertes Medium in jede Vertiefung.
8. Bereiten Sie während des Wartens die Kontrolle der Basalmembranmatrix vor, indem Sie das Hauptmaterial (8-12 mg/ml, je nach Charge) mit dem zugesetzten Medium auf eine Endkonzentration von 3 mg/ml verdünnen. Fügen Sie dieser Lösung Zellen hinzu (800 Zellen pro 25 μl).
   HINWEIS: Die Manipulation der Basalmembran muss immer auf Eis durchgeführt werden. Die Spitzen müssen vor dem Berühren des Hydrogels in eiskaltem PBS gespült werden. Andernfalls findet die Polymerisation in den Spitzen statt.
9. Platte 20 μl Tröpfchen der Basalmembranlösung in jede Vertiefung. Lassen Sie die Tröpfchen gelieren, indem Sie sie 20 Minuten lang bei 37 °C inkubieren. Nachdem das Material geliert ist, fügen Sie 0,5 ml vollständiges Medium hinzu.
10. Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage. Beobachten Sie, wie sich die Zellen bereits am 4. Tag organisieren und Signale der Lumenbildung zeigen.
11. Bilden Sie Zellen im Hellfeld an Tag 1, Tag 4 und Tag 7 ab, um das Wachstum von Organoiden zu bewerten.

3. Lebensfähigkeit und Verbreitung

1. Bereiten Sie drei Black-Well-Platten für den Viabilitätsassay und drei Black-Well-Platten für den Proliferationsassay vor. Geben Sie 25 μl 2x Peptidlösung pro Vertiefung hinzu und gelate Sie mit dem gleichen Volumen von 2x PBS. Säen Sie die Zellen wie oben beschrieben.
2. Bereiten Sie drei Vertiefungen für jede Formulierung des Peptid-Hydrogels vor, die als Rohlinge in der Proliferationsplatte verwendet werden sollen. Säen Sie keine Zellen auf diesen aus.
3. Nehmen Sie das Medium aus der Viabilitätsvertiefungsplatte und waschen Sie es 3 x 5 Minuten lang mit 1x PBS.
4. Verdünnen Sie Calcein-AM und Ethidium-Homodimer auf 8 μM aus dem Viabilitäts-/Zytotoxizitätskit für Säugetierzellen (siehe Materialtabelle) in dasselbe lichtgeschützte konische Röhrchen. Um 2 mL dieser Lösung zu 2 mL PBS in einem lichtgeschützten konischen Röhrchen herzustellen, fügen Sie 4 μl der Calcein-AM-Stammlösung und 8 μl der Ethidium-Homodimer-1-Stammlösung hinzu.
5. Die in Schritt 3.4 hergestellte Calcein/Ethidium-Homodimerlösung in die 96-Well-Platte geben. Fügen Sie 100 μl pro Vertiefung hinzu. Vor Licht schützen und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
6. 3 x 5 min mit 1x PBS waschen. Bilden Sie mindestens drei Felder (Mitte, oben, unten) ab, wenn Sie ein 4x-Objektiv verwenden, oder mindestens fünf Felder (Mitte, oben links, oben rechts, unten links, unten rechts), wenn Sie ein 10x- und 20x-Objektiv unter einem Fluoreszenzmikroskop verwenden.
7. Entfernen Sie das Medium von der Proliferationsvertiefungsplatte, um ein Endvolumen von 90 μl zu gewährleisten.
8. Fügen Sie 10 μl Alamar Blue-Lösung hinzu (siehe Materialtabelle), um eine Endkonzentration von 10 % zu erreichen.
9. Vor Licht schützen und 2-4 h bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren
10. Verwenden Sie einen Well-Platten-Reader, um die Fluoreszenz (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) oder die Absorption (570 nm) zu messen. Mittelwerten Sie die für die Leerzeichen erhaltenen Werte, und subtrahieren Sie sie von den Werten aus jedem Well, das Zellen enthält.
11. Berechnen Sie die Proliferationswerte, indem Sie den Mittelwert des Signals jeder Bedingung bilden und den Durchschnitt der jeweiligen Leerzeichen subtrahieren. Erstellen Sie Diagramme, indem Sie ein indiziertes Boxplot des relativen Absorptions-/Fluoreszenzsignals über der Zeit erstellen.

4. Adhärenz-Assay von Zellen an der Matrix

1. Bereiten Sie 100 μl Peptid-Hydrogele in zwei unabhängigen 96-Well-Platten vor.
2. Säen Sie 20.000 Zellen in jede Vertiefung und fügen Sie 100 μl Medium hinzu. Die Platten 90 min bei 37 °C, 5 % CO_{2 inkubieren}.
3. Nach der Inkubation nehmen Sie nur eine Platte und resuspendieren Sie das Medium vorsichtig mit einer P200-Mikropipette für 20-30 s. Achten Sie darauf, das Hydrogel nicht zu stören, indem Sie die Spitze vom Gel fernhalten. Wenn die mechanischen Eigenschaften des Hydrogels dies zulassen (G' > 8.000 Pa), klopfen Sie alternativ mit einem beweglichen Wirbel auf die vier Seiten der Well-Platte.
   HINWEIS: Durch das Re-Suspendieren des Mediums (oder das Klopfen auf die Well-Platte mit dem Wirbel) werden sowohl nicht gebundene Zellen als auch Zellen mit schwacher Adhäsion an der Oberfläche der Matrix entfernt. Die zelluläre Bindung erfolgt innerhalb von 90 Minuten, obwohl die Stärke dieser Bindung je nach den spezifischen Peptidhydrogelen und ihren Adhäsions- und Bindungseigenschaften variiert. Es ist bekannt, dass das Wachstum von kolorektalen Organoiden in Matrizen mit Steifigkeitswerten von unter 2.000 Pa begünstigt wird. Da die in diesem Protokoll vorgestellten Hydrogele weich und spröde sind, legen wir Wert auf eine sanfte mechanische Beanspruchung.
4. Entfernen Sie 100 μl Medium von beiden Well-Platten und fügen Sie Wash einmal mit 1x PBS hinzu.
5. Bereiten Sie eine DAPI-Lösung mit 1 μg/ml vor. 100 μl der DAPI-Lösung in alle Vertiefungen geben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Bilden Sie eine repräsentative Anzahl von Feldern unter einem Fluoreszenzmikroskop ab. Stellen Sie sicher, dass alle Bilder mit demselben Objektiv aufgenommen wurden, um das Pixel-Entfernungs-Verhältnis konstant zu halten.
   HINWEIS: Stellen Sie sich neun Felder für ein 10x-Objektiv oder 15 Felder mit einem 20x-Objektiv vor.
7. Laden Sie die Fluoreszenzbilder in eine Bildanalysesoftware (z. B. ImageJ) und analysieren Sie die Partikel auf allen Bildern.
   1. Wählen Sie im Menü Image die Option Type (Typ) und klicken Sie auf 8-Bit.
   2. Wählen Sie im Menü Bild die Option Anpassen und klicken Sie auf Helligkeit/Kontrast. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auto | Bewerben Sie sich.
   3. Wählen Sie im Menü Bild die Option Anpassen und klicken Sie auf Schwellenwert. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auto und schließen Sie das Fenster.
   4. Klicken Sie im Menü "Analysieren " auf "Partikel analysieren". Aktivieren Sie die Option zum Zusammenfassen und klicken Sie auf OK.
   5. Zeigen Sie im Fenster Zusammenfassung mit der Maus auf das Menü Datei und klicken Sie auf Speichern , um die Zusammenfassungswerte zu speichern.
8. Exportieren Sie die Ergebnisse für alle Bilder in eine Standard-Statistiksoftware.
9. Berechnen Sie den prozentualen Anteil der Fläche, die vor und nach dem Stress von Zellen bedeckt wurde. Erstellen Sie ein indiziertes Boxplot des prozentualen Anteils der Fläche für jede Bedingung.

5. Immunfärbung von Organoiden in Peptid-Hydrogel

1. 800 Zellen in 20 μl Tröpfchen Peptid-Hydrogel für 4 Tage säen, wie in den Schritten 2.1-2.10 beschrieben.
2. Entfernen Sie an Tag 4 das Medium und waschen Sie jede gut 2x mit 1x PBS.
3. 400 μl einer 4%igen Formaldehydlösung zugeben. Inkubieren Sie die Well-Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Entfernen Sie die Formaldehydlösung mit einem P1000 und waschen Sie sie einmal mit 1x PBS.
5. 1 ml Permeabilisierungspuffer zugeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer mit einem P1000 und waschen Sie ihn einmal mit 1x PBS.
7. Fügen Sie 0,5 ml Blockierungspuffer hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
8. Entfernen Sie den Blockierungspuffer mit einem P1000 und waschen Sie ihn mit 1x PBS.
9. Verdünnen Sie den Primärantikörper im Blockierungspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Geben Sie 200 μl in zwei Vertiefungen.
10. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
11. Entfernen Sie die Fleckenlösung mit einem P200 und waschen Sie sie einmal mit 1x PBS.
12. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper in einem Blockierungspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Geben Sie das Phalloidin-Konjugat im Verhältnis 1:40 in die sekundäre Antikörperlösung.
13. Vor Licht schützen und nicht länger als 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Fleckenlösung mit einem P200 und waschen Sie sie einmal mit 1x PBS.
14. Bereiten Sie eine DAPI-Lösung von 1 μg/ml im Blockierungspuffer vor. Geben Sie 300 μl der DAPI-Lösung in jede Vertiefung.
15. Vor Licht schützen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
16. Entfernen Sie die Fleckenlösung mit einem P200 und waschen Sie sie einmal mit 1x PBS.
17. Vor Licht schützen und bis zu 7 Tage bei 4 °C lagern.

6. Bildgebung und Bildanalyse von Organoiden in der Matrix

1. Nehmen Sie die gefärbten Proben mit einem Epifluoreszenzmikroskop bei 10x auf. Verwenden Sie nur die Phalloidin- und DAPI-Kanäle.
2. Öffnen Sie die Cellopose Software und drücken Sie Strg + L , um ein Bild zu laden. Da die Software Zugriff auf alle Dateien am Speicherort des ausgewählten Bildes hat, stellen Sie sicher, dass Sie alle Fluoreszenzbilder an diesem genauen Ort speichern, ohne Unterordner zu haben.
3. Geben Sie den durchschnittlichen Durchmesser der Kolonien in das Fenster Segmentierung ein und klicken Sie auf ENTER.
4. Wählen Sie ein benutzerdefiniertes Modell für Doppelpunkt-Organoide aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Modell ausführen .
   HINWEIS: Hier empfehlen wir, zwei von Grund auf neu entwickelte Modelle in Cellpose2.0^29,30 zu verwenden.
5. Drücken Sie Strg + S , um die Masken als .npy-Datei zu speichern.
6. Verwenden Sie die Pfeiltasten auf der Tastatur, um durch die Bilder des Ordners zu navigieren, und führen Sie das Modell für Doppelpunkt-Organoide für alle Bilder im Ordner aus.
7. Erstellen Sie eine Kopie des Ordners und wiederholen Sie die Schritte 6.2 bis 6.6 mit einem Modell für das Dickdarm-Organoid-Lumen.
8. Öffnen Sie ImageJ und klicken Sie auf Plugin | Makros | Laufen... , um die imagej_roi_converter.py Datei auszuführen, die auf der Cellpose Github-Site verfügbar ist, und warten Sie, bis ein Fenster angezeigt wird.
9. Wählen Sie die erste Datei aus dem Doppelpunkt-Organoid-Ordner aus und klicken Sie auf Öffnen.
10. Wählen Sie die Datei seg.npy aus, die der ersten Datei entspricht, und klicken Sie auf Öffnen.
    HINWEIS: ImageJ wandelt die Masken in interessante Bereiche um und überlappt sie mit den entsprechenden Fluoreszenzbildern.
11. Klicken Sie im Fenster ROI-Manager auf Alle auswählen und dann auf Messen.
12. Klicken Sie auf Datei | Speichern unter... im Fenster Ergebnisse und speichern Sie die Ergebnisse.
    HINWEIS: Dies führt zu einer .csv Datei, die alle Formeigenschaften jeder Kolonie im Feld enthält.
13. Wiederholen Sie die Schritte 6.8 bis 6.12 für dasselbe Bild im Ordner für das Dickdarm-Organoid-Lumen.
14. Laden Sie OriginPro und drücken Sie Strg + 3 , um den Importassistenten zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit den drei Punkten und wählen Sie sowohl .csv Dateien aus, die den Eigenschaften der Organoid- und Lumenform für dasselbe Bild entsprechen.
15. Kopieren Sie die Ergebnisse aus den Lumenformeigenschaften und fügen Sie sie in einer Spalte neben den Ergebnissen der Kolonie ein, um sicherzustellen, dass jede Lumenmessung mit der jeweiligen Kolonie gekoppelt ist.
16. Teilen Sie in einer neuen Spalte die Flächen des Lumens und der Kolonie, um die relative Lumenfläche der umgebenden Kolonie zu erhalten.
17. Wählen Sie die Spalte aus, die der Kreisförmigkeit jeder Kolonie und der Lumenfläche entspricht. Klicken Sie auf Plotten | Grundlegendes 2D | Zerstreuen.
18. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Zeichnungsfenster, und wählen Sie Details Zeichnung aus. Klicken Sie auf die Registerkarte Schwerpunkt(PRO) und aktivieren Sie die Optionen Schwerpunktpunkt für Teilmenge anzeigen, Mit Datenpunkten verbinden und Ellipse anzeigen.

Zunächst untersuchten wir die Zellen, die 7 Tage lang in einer 24-Well-Platte gezüchtet wurden, mittels Hellfeld-Bildgebung. Wir identifizierten kleine Cluster von Zellen, die sich im Laufe der Woche zu Organoiden zusammenfügten, wie in Abbildung 4 zu sehen ist. Mit einer kontrollierten Scan-Methode kann die Beweglichkeit der Zellen und der Organoide zwischen verschiedenen Tagen verfolgt werden. Im Allgemeinen haben wir uns die Entwicklung der Morphologie der Zellen während der gesamten Woche angesehen. Von SW1222 abgeleitete Organoide sollten eine runde Morphologie und ein helles Erscheinungsbild aufweisen. Ein dunkleres Erscheinungsbild deutet auf eine unerwünscht höhere Zelldichte hin, wie sie bei einigen der in Peptid P kultivierten Kolonien am Tag 7 zu sehen ist (Abbildung 4).

Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse der Zellviabilitäts- (Abbildung 5A) und Proliferationsassays (Abbildung 5B), die auf die Anzahl der toten und lebenden Zellen bzw. die metabolische Aktivität hinweisen. Hier verwendeten wir einen Calcein- und Ethidium-Homodimer-basierten Viabilitätsassay und stellten fest, dass diese Zellen an Tag 7 eine kleine Population toter Zellen aufwiesen, wenn sie in Matrigel kultiviert wurden. Dieses Phänomen trat auch in allen peptidbasierten Hydrogelen auf, nicht jedoch in der 2D-Kultur. Die Proliferationsergebnisse zeigten eine Gesamtzunahme der Stoffwechselaktivität zwischen Tag 1 und Tag 7. Darüber hinaus fanden wir bei mehreren Erkrankungen einen leichten Rückgang der Aktivität zwischen Tag 4 und Tag 7. Diese Beobachtung korreliert mit der Zunahme der toten Zellpopulation, die im Viabilitätsassay beobachtet wurde (Abbildung 5A).

Für eine vorläufige Bewertung der Interaktion zwischen den Zellen und der Biofunktionalisierung der Peptid-Hydrogele führten wir einen Adhäsionsassay durch, der auf mechanischer Belastung basiert, um eine Zellablösung zu induzieren. Wie in Abbildung 6 zu sehen ist, beeinflusste die Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen des biofunktionellen Peptids P2 die Anzahl der vor und nach dem Ablösungsprozess zurückgehaltenen Zellen signifikant. Hier haben wir ein Peptid verwendet, das nur das biofunktionelle Motiv des Peptids P2 als Positivkontrolle enthält. Wir verwendeten auch das nicht-biofunktionelle Peptid P als Negativkontrolle. Wie in der Grafik zu sehen ist, wiesen Zellen, die in Peptid P ausgesät wurden, eine relativ geringe anfängliche Adhäsion sowie einen niedrigen Retentionswert auf. Darüber hinaus korrelierte die Veränderung des Verhältnisses des biofunktionellen Peptids P2 mit der Anzahl der Zellen, die nach dem Stress zurückgehalten wurden. Daher können wir mit diesem Assay den Schluss ziehen, dass das P2-Peptid die Zelladhäsion beeinflusste, die durch das biofunktionelle Motiv angetrieben werden kann oder auch nicht, aber mit der Menge des in der Mischung vorhandenen biofunktionellen Peptids korrelierte.

Dann untersuchten wir die Wirkung der Matrices in den hergestellten Organoiden. Wir bewerteten die Zirkularität der Kolonie und die relative Größe des Lumens in Bezug auf die Größe der Kolonie, indem wir eine Formanalyse von Zytoskelett-gefärbten Proben durchführten, die 4 Tage lang kultiviert wurden. Die Datenpunkte wiesen eine bestimmte Verteilung entlang der x- und y-Achse auf, und jede Bedingung hatte einen Schwerpunkt mit einem bestimmten Wert für die Zirkularität und die relative Lumenfläche. Abbildung 7 zeigt, dass die in 2D kultivierten Zellen eine sehr hohe Variation in der Koloniezirkularität aufwiesen. Im Gegensatz dazu wiesen die in Matrigel kultivierten Zellen eine umfangreichere Verteilung für die relative Größe des Lumens auf.

Interessanterweise hatten die Schwerpunktwerte für alle peptidhaltigen Hydrogele eine sehr ähnliche Position. Der Abstand zwischen den Datenpunkten zeigte jedoch unterschiedliche Verteilungsprofile. Zum Beispiel hatte das P3-Peptid eine kleinere Verteilung unter den drei Peptid-Hydrogelen, während die Datenpunkte des nicht-biofunktionellen Peptids P eine größere Verteilung zu haben schienen. Diese Daten deuten darauf hin, dass sowohl Hydrogele mit P1 als auch mit P3 das Potenzial haben, für die Organoidkultur optimiert zu werden.

Schließlich untersuchten wir die Expression spezifischer Marker mittels Immunzytochemie an einer Probe, die mit den apikalen Markern ZO-1 und ezrin gefärbt wurde. Diese Marker ermöglichten die Bewertung der Polarisation der Zellen innerhalb jedes Organoids. Wir untersuchten auch Pan-Cadherin-Marker, um Zell-Zell-Verbindungen sichtbar zu machen, und einen Zytoskelett-spezifischen Marker (Phalloidin), um das Lumen sichtbar zu machen. Abbildung 8A zeigt die Organoide, die an Tag 4 und Tag 7 im nicht-biofunktionellen Peptid P, im biofunktionalisierten Peptid P1 und in Matrigel gefunden wurden. ZO-1- und EZRIN-Marker sollten in den apikalen und basolateralen Membranen des Organoids lokalisiert sein; Die richtige Zellpolarisation ermöglicht es uns, die Expression beider Moleküle bis zum 4. Tag in der Nähe des Lumenbereichs zu beobachten, der sonst unsichtbar ist. Wie in Abbildung 8 zu sehen ist, befanden sich ZO-1- und Ezrin-Marker in den apikalen Membranen der Organoide, die in Matrigel kultiviert wurden. Interessanterweise waren Ezrin-Marker im nicht-biofunktionellen Peptid P kaum sichtbar. Daraus schließen wir, dass die ineffiziente Polarisation der Zellen zu einer geringen Expression dieser Moleküle im Peptid P führte.

Darüber hinaus war die Dispersion der Zellkerne in den Peptidhydrogelen tendenziell unregelmäßig, während die in Matrigel eingebetteten Organoide eine einzige, asymmetrische Schicht von Zellkernen bildeten. Diese Beschreibung entspricht der idealen Morphologie für ein kolorektales Organoid; Obwohl die Orientierung der Zellkerne in den Peptidhydrogelen jedoch nicht vollständig asymmetrisch war, fanden sich dichtere Kolonien mit mehreren Schichten von Zellkernen hauptsächlich im nicht-biofunktionellen Peptid P. Im Gegensatz dazu müssen Zell-Zell-Verbindungen senkrecht zur apikalen und basolateralen Membran lokalisiert sein (Abbildung 8B). Dieser Marker ermöglichte es uns, die Ränder aller Zellen zu beobachten, die sich innerhalb der Kolonie befinden. Wenn die Zellen in Matrigel gezüchtet wurden, hatten sie am 7. Tag eine fast perfekt radiale Verteilung von Pan-Cadherin (Zell-Zell-Verbindungen). Im Gegensatz dazu wiesen nicht-polarisierte Kolonien, wie die in Peptid P, eine ungeordnete Anordnung der Zellen und die Expression von Zell-Zell-Verbindungen in der Nähe der basalen und apikalen Membran auf.

Abbildung 1: Ultrakurze selbstorganisierende Peptide, die Nanofasern bilden. (A) Darstellung des Selbstorganisationsprozesses für aliphatische ultrakurze Peptide. (B) Chemische Struktur von ultrakurzem SAP IIFK, biofunktionalisiert mit dem IKVAV-Liganden. Diese Abbildung wurde von Loo et al.4 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Struktur und Eigenschaften von Peptiden. (A) Die chemischen Strukturen des Ausgangspeptids IIFK und des biofunktionellen Peptids P2 sind dargestellt. (B) Die Testergebnisse des umgekehrten Fläschchens zeigen kritische Unterschiede in der Gelierungskonzentration und der Gelierungszeit. P2 bildet ein durchscheinendes Gel mit einem höheren CGC als das Ausgangspeptid IIFK. Bemerkenswert ist, dass das IIFK:P2 (1:1)-Gemisch eine noch höhere CGC und eine längere Gelierungszeit aufweist als jedes Peptid allein. (C) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen geben visuelle Einblicke in die strukturellen Eigenschaften von IIFK, P2 und dem IIFK:P2-Gemisch (1:1). (D) Die Bilder der Rasterkraftmikroskopie-Höhentopographie zeigen die gelierten Peptide in einer Konzentration von 8 mM und bieten einen detaillierten Blick auf ihre Oberflächenmerkmale. (E) Die Zirkulardichroismus-Spektroskopie zeigt die Konformationsänderungen des IIFK:P2-Gemisches bei verschiedenen Konzentrationen und gibt Aufschluss über deren Sekundärstrukturänderungen. (F) Rheologische Analysen messen die Steifigkeit der gelierten Peptide bei unterschiedlichen Konzentrationen und liefern wertvolle Einblicke in ihre mechanischen Eigenschaften. Diese Abbildung ist eine Reproduktion von Perez-Pedroza et al.25. Maßstabsleisten = 1 μm (C), 200 nm (D). Abkürzung: CGC = kritische Gelierungskonzentration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Diagramm, das die Peptidvorbereitung und das Zellaussaatverfahren für die Organoidherstellung und -charakterisierung nach Viabilität, Adhäsion, Organoidbildungskapazität und Immunfärbung in Peptidhydrogelen darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Hellfeldmikroskopie-Bilder, die von SW1222-Zellen aufgenommen wurden, die in Peptid-Hydrogelen kultiviert wurden, die als P und P1 markiert waren, verglichen mit der Matrigel-Kontrolle. Interessanterweise zeigen Organoide, die in den Peptid-Hydrogelen kultiviert werden, am siebten Tag eine überwiegend kugelförmige Morphologie. Im Gegensatz dazu scheinen diejenigen, die sich innerhalb des Matrigels befinden, eine verringerte Zelldichte zu zeigen, was an ihrem hellen Körper zu erkennen ist, verglichen mit dem abgedunkelten Körper der Organoidkultur in SAP (schwarze Pfeilspitzen). Nichtsdestotrotz zeigen sie eine offensichtliche Häufung zwischen benachbarten Kolonien. Darüber hinaus wird deutlich, dass die Migrationskapazität der Zellen innerhalb der Matrigel-Umgebung vergleichsweise verringert ist. Maßstabsbalken = 650 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Viabilitäts- und Proliferationsassays von SW1222-Zellen in biofunktionalisiertem SAP in verschiedenen Konzentrationen. (A) Viehabilitätsbewertung von Zellen, die in biofunktionellen Peptiden P1 und P2 kultiviert wurden, im Vergleich zu Matrigel und 2D. (B) Proliferationsbewertung von Zellkulturen in nicht-biofunktionellen Peptiden P1 und biofunktionellen Peptiden P2 im Vergleich zu Matrigel- und 2D-Kontrollen. Hier sehen wir ein ähnliches Verhalten wie bei den Zellen, die in Matrigel für den Lebend-/Tot-Assay wachsen. Eine leichte Zunahme abgestorbener Zellen (gelbe Pfeilspitzen) findet sich bei mehreren Erkrankungen, hauptsächlich bei Matrigel. Bei der Proliferation variieren die Trends je nach Art und Konzentration des Peptids, aber im Allgemeinen gibt es einen positiven Trend. Maßstabsleisten = 250 μm. Diese Abbildung wurde von Perez-Pedroza et al.25. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Auswirkungen des Peptids auf die Anzahl der abgelösten Zellen. (A) Fluoreszenzbilder von Zellen, die vor und nach mechanischer Belastung mit DAPI gefärbt wurden. Hier verwenden wir das Peptid P, das modifizierte Peptid P2 und das IKVAV-Motiv. (B) Die Veränderung der Zelladhäsion wurde durch Messung des abgedeckten Bereichs in ImageJ bestimmt. Die vergleichende Analyse ergab, dass das biofunktionalisierte Peptid P2 im Vergleich zum nicht-biofunktionellen Peptid P eine erhöhte Retentionskapazität aufwies. Skalenbalken = 100 μm. Diese Abbildung wurde von Perez-Pedroza et al.25 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Bewertung der Organoidbildungskapazität durch Schwerpunktberechnung der relativen Fläche des Lumens im Vergleich zur Zirkularität. Der Schwerpunkt und die Streuung der Daten variierten je nach Behandlung. Erwartungsgemäß war die schlechteste Leistung die der 2D-Messungen, die sich in einem umfangreichen Bereich von Zirkularitätswerten ausdehnten und die geringste relative Fläche des Lumens aufwiesen. Matrigel hatte nicht nur die höchste Rundheit, sondern auch das größte Lumen. Die Peptidbedingungen variierten in beiden Werten leicht, aber die P3-Bedingung wies die vernachlässigbarste Variation der Daten auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Konfokale Mikroskopie-Aufnahmen von Organoiden an Tag 4 und Tag 7 für verschiedene Marker. (A) ZO-1 (grün), ezrin (rot) und DAPI (blau) Marker werden verwendet, um die apikale Verteilung der Zellen innerhalb der Organoide zu finden. Wie in der Matrigel-Kontrolle zu sehen ist, sind diese Moleküle typischerweise in den apikalen und basolateralen Membranen lokalisiert. Das nicht-biofunktionelle Peptid P zeigt die Expression dieser Moleküle erst am 7. Tag. (B) Zell-Zell-Verbindungsmarker, die mit Pan-Cadherin-Antikörpern (grün) gefärbt sind, sollten senkrecht zu den basolateralen und apikalen Membranen der Organoide stehen. Zellkerne (blau) und Zytoskelett (rot) werden als Gegenfärbung verwendet. Das nicht-biofunktionelle Peptid P induzierte im Gegensatz zu den beiden anderen Behandlungen (P3 und Matrigel) die Expression von Zell-Zell-Verbindungen in der basolateralen Membran. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.