Multiplex-Lebendzell-Bildgebung für das Ansprechen auf Medikamente in patientenabgeleiteten Organoidmodellen von Krebs

Zusammenfassung

Patient-Derived Tumor Organoids sind ein ausgeklügeltes Modellsystem für die Grundlagen- und translationale Forschung. Dieser Methodenartikel beschreibt die Verwendung von Multiplex-Fluoreszenz-Lebendzell-Imaging zur gleichzeitigen kinetischen Beurteilung verschiedener Organoid-Phänotypen.

Zusammenfassung

Patient-Derived Organoid (PDO) Modelle von Krebs sind ein multifunktionales Forschungssystem, das menschliche Krankheiten im Vergleich zu Krebszelllinien besser rekapituliert. PDO-Modelle können erzeugt werden, indem Tumorzellen von Patienten in extrazellulären Basalmembranextrakten (BME) kultiviert und als dreidimensionale Kuppeln plattiert werden. Kommerziell erhältliche Reagenzien, die für phänotypische Assays in Monolayer-Kulturen optimiert wurden, sind jedoch oft nicht mit BME kompatibel. Hier beschreiben wir eine Methode zur Platte von PDO-Modellen und zur Bewertung von Arzneimittelwirkungen mit einem automatisierten Lebendzell-Bildgebungssystem. Darüber hinaus verwenden wir Fluoreszenzfarbstoffe, die mit kinetischen Messungen kompatibel sind, um die Zellgesundheit und Apoptose gleichzeitig zu quantifizieren. Die Bilderfassung kann so angepasst werden, dass sie in regelmäßigen Zeitabständen über mehrere Tage erfolgt. Benutzer können Arzneimittelwirkungen in einzelnen Z-Ebenenbildern oder einer Z-Projektion von Serienbildern aus mehreren Brennebenen analysieren. Mit Hilfe der Maskierung werden bestimmte Parameter von Interesse berechnet, wie z. B. PDO-Zahl, Fläche und Fluoreszenzintensität. Wir liefern Proof-of-Concept-Daten, die die Wirkung von Zytostatika auf die Zellgesundheit, Apoptose und Lebensfähigkeit demonstrieren. Diese automatisierte kinetische Bildgebungsplattform kann auf andere phänotypische Messwerte erweitert werden, um verschiedene therapeutische Effekte in PDO-Modellen von Krebs zu verstehen.

Einleitung

Von Patienten stammende Tumororganoide (PDOs) entwickeln sich schnell zu einem robusten Modellsystem zur Untersuchung der Krebsentwicklung und des therapeutischen Ansprechens. PDOs sind dreidimensionale (3D) Zellkultursysteme, die das komplexe genomische Profil und die Architektur des Primärtumors rekapitulieren ^1,2. Im Gegensatz zu herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Kulturen immortalisierter Krebszelllinien erfassen und erhalten PDOs die intratumorale Heterogenität ^3,4, was sie zu einem wertvollen Werkzeug sowohl für die mechanistische als auch für die translationale Forschung macht. Obwohl PDOs ein immer beliebteres Modellsystem werden, sind kommerziell erhältliche Reagenzien und Analysemethoden für zelluläre Effekte, die mit PDO-Kulturen kompatibel sind, begrenzt.

Der Mangel an robusten Methoden zur Analyse subtiler Veränderungen des Behandlungsansprechens behindert die klinische Umsetzung. Das Goldstandard-Reagenz für die Zellgesundheit in 3D-Kulturen, CellTiter-Glo 3D, verwendet den ATP-Spiegel als Determinante für die Zellviabilität ^5,6. Obwohl dieses Reagenz für Endpunkt-Assays nützlich ist, gibt es mehrere Vorbehalte, vor allem die Unfähigkeit, Proben nach Abschluss des Assays für andere Zwecke zu verwenden.

Die Lebendzellbildgebung ist eine ausgeklügelte Form der kinetischen Mikroskopie, die in Kombination mit fluoreszierenden Reagenzien in der Lage ist, eine Vielzahl von Messwerten für die Zellgesundheit innerhalb von PDO-Modellen zu quantifizieren, einschließlich Apoptose ^7,8,9 und Zytotoxizität¹⁰. In der Tat war die Bildgebung lebender Zellen ein wesentlicher Bestandteil des Hochdurchsatz-Screenings von Verbindungen in 2D-Plattformen^11,12. Systeme wie der Incucyte haben die Technologie erschwinglich und damit für Forschungsgruppen in einer Vielzahl von Umgebungen zugänglich gemacht. Die Anwendung dieser Systeme zur Analyse von 3D-Kulturen steckt jedoch noch in den Kinderschuhen.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Bewertung des Ansprechens auf Medikamente in PDO-Modellen von Krebs unter Verwendung von Multiplex-Lebendzell-Bildgebung (Abbildung 1). Durch die Analyse von Hellfeldbildern können Veränderungen der PDO-Größe und -Morphologie kinetisch überwacht werden. Darüber hinaus können zelluläre Prozesse gleichzeitig im Zeitverlauf mit fluoreszierenden Reagenzien wie Annexin V Red Dye für Apoptose und Cytotox Green Dye für Zytotoxizität quantifiziert werden. Die vorgestellten Methoden sind für das Lebendzell-Bildgebungssystem Cytation 5 optimiert, aber dieses Protokoll kann an verschiedene Lebendzell-Bildgebungsplattformen angepasst werden.

Protokoll

Studien mit menschlichen Tumorproben wurden vom University of Iowa Institutional Review Board (IRB), Protokoll #201809807, überprüft und genehmigt und in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, wie sie in der Helsinki-Erklärung von 1964 und ihren späteren Änderungen festgelegt sind. Die Einverständniserklärung wurde von allen an der Studie teilnehmenden Probanden eingeholt. Einschlusskriterien sind unter anderem die Diagnose Krebs und die Verfügbarkeit von Tumorproben.

1. Plattieren intakter PDOs in einer 96-Well-Platte

1. Reagenzien vorbereiten.
   1. 96-Well-Platten über Nacht auf 37 °C vorheizen und BME über Nacht auf 4 °C auftauen.
   2. Bereiten Sie vollständige Organoid-Nährmedien vor, die für die Kultivierung des interessierenden Krebstyps optimiert sind. Spezifische Nährmedien, die für die hierin gezeigten Experimente verwendet werden, sind in der ergänzenden Tabelle 1 angegeben.
      HINWEIS: Medienkomponenten müssen möglicherweise für verschiedene Tumorarten modifiziert werden. Zum Beispiel wird das Organoid-Kulturmedium mit 100 nM Östradiol für gynäkologische Tumoren ergänzt¹³. Vorbereitete Medien sind 1 Monat lang bei 4 °C stabil. Für die Langzeitlagerung aliquotieren Sie das Medium in 50-ml-Röhrchen und lagern Sie es bei -20 °C.
2. Bereiten Sie zwei separate Aliquots von Organoid-Nährmedien bei 4 °C und 37 °C vor. Wenn beispielsweise 60 Wells in einer 96-Well-Platte plattiert werden, verwenden Sie 6 ml warme Organoid-Nährmedien und 150 μl eiskalte Organoid-Nährmedien.
3. Organoid-Waschpuffer vorbereiten: Ergänzen Sie 1x PBS mit 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA und 10 μM Y-27632. Bei 4 °C lagern
4. Ernten Sie g.U., die in einer 24-Well-Platte kultiviert werden. Führen Sie alle Schritte auf Eis oder bei 4 °C durch, sofern nicht anders angegeben.
   1. Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung mit einem Vakuumleitungssystem an.
   2. Fügen Sie 500 μl eiskalten Organoid-Waschpuffer hinzu und pipettieren Sie vorsichtig 2-3x mit einer 1000-μl-Pipette. Den Teller 10 Minuten auf Eis ausbrüten.
   3. Übertragen Sie den Inhalt jedes Wells in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Um sicherzustellen, dass alle PDOs in Suspension sind, spülen Sie jede Vertiefung mit zusätzlichen 300 μl Organoid-Waschpuffer und geben Sie sie in das konische 50-ml-Röhrchen. 5 min bei 350 x g bei 4 °C zentrifugieren
   4. Saugen Sie den Überstand aus dem BME/Organoid-Pellet mit einem Vakuumleitungssystem an und lassen Sie ~ 5 ml im Röhrchen. Fügen Sie 20 ml Organoid-Waschpuffer hinzu und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit einer serologischen 10-ml-Pipette. 10 Minuten auf Eis inkubieren.
   5. 5 min bei 350 x g bei 4 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand mit einem Vakuumleitungssystem an und achten Sie darauf, das PDO-Pellet nicht zu stören.
5. Plattieren von PDOs in einer 96-Well-Platte: Führen Sie alle Schritte auf Eis durch, sofern nicht anders angegeben.
   1. Resuspendieren Sie das PDO-Pellet in einer geeigneten Menge eiskalter Organoid-Nährmedien, um eine PDO-Suspension herzustellen. Übertragen Sie die PDO-Suspension in ein eiskaltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Um die Menge der Organoid-Nährmedien zu berechnen, bestimmen Sie die Anzahl der Wells, die in einer 96-Well-Platte plattiert werden sollen, wobei zu berücksichtigen ist, dass PDOs in einer 5-μl-Kuppel in einem Verhältnis von 1:1 aus Organoid-Kulturmedien und BME plattiert werden. Wenn Sie beispielsweise eine 96-Well-Platte plattieren und nur die inneren 60 Wells verwenden, beträgt die benötigte Gesamtmenge an PDO-Suspension 300 μl: 150 μl Organoid-Nährmedien und 150 μl BME. Bei Modellen, die ein optimales Wachstum bei unterschiedlichen BME-Prozentsätzen aufweisen, kann das Verhältnis von BME:Medien in diesem Schritt modifiziert werden, obwohl es wichtig ist, das Verhältnis über alle Assays für jedes spezifische Modell zu standardisieren. Um Pipettierfehler zu berücksichtigen, fügen Sie jeder Komponente 10 % Volumen hinzu.
   2. Zählen Sie die Anzahl der PDOs.
      1. 2,5 μl der PDO-Suspension in ein eiskaltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit 2,5 μl BME mischen. Übertragen Sie die 5-μl-Mischung auf einen sauberen Glasobjektträger. Decken Sie den Objektträger nicht ab. Die Mischung verfestigt sich zu einer Kuppel.
      2. Visualisieren Sie mit einem Hellfeldmikroskop bei 4x. Zählen Sie die Anzahl der g.U. in der 5-μl-Mischung; das Ziel ist es, etwa 25-50 PDOs pro 5-μl-Dom zu haben.
         Anmerkungen: Wenn die gewünschte Dichte in der Testmischung nicht erreicht wird, passen Sie das Endvolumen der PDO-Suspension an, indem Sie entweder mehr Organoid-Nährmedien hinzufügen oder die PDO-Suspension zentrifugieren und das PDO-Pellet in einem geringeren Volumen eiskalter Organoid-Nährmedien resuspendieren. Unabhängig davon, wie die PDO-Suspension in diesem Schritt modifiziert wird, ist das endgültige Verhältnis von BME: PDO-Suspension in Schritt 1.5.3. sollte 1:1 sein.
   3. Mischen Sie die PDO-Suspension mit einer 200-μl-Pipette mit breiten Bohrungsspitzen vorsichtig mit einer gleichen Menge BME, um ein Verhältnis von 1:1 von Organoid-Nährmedien zu BME zu erreichen. Vermeiden Sie Blasen, die die Integrität der Kuppeln stören.
   4. Mit einer 20-μl-Pipettore 5-μl-Dome in die Mitte jedes Wells einer vorgewärmten 96-Well-Platte säen und nur die inneren 60 Wells aussäen. Um eine gleichmäßige Verteilung der PDOs zu gewährleisten, pipettieren Sie den Inhalt des 1,5-ml-Röhrchens regelmäßig mit einer 200-μl-Pipette mit breiten Spitzen.
   5. Nachdem alle Vertiefungen ausgesät wurden, den Deckel auf die Platte legen und vorsichtig umdrehen. Inkubieren Sie die umgekehrte Platte bei 37 °C für 20 Minuten im Gewebekultur-Inkubator, damit sich die Kuppeln verfestigen können.
      HINWEIS: Durch das Umdrehen der Platte wird sichergestellt, dass die BME/Organoid-Nährmedienkuppel die 3D-Struktur beibehält, um ausreichend Platz für die PDO-Bildung zu bieten.
   6. Die Platte so umdrehen, dass sie mit offenem Deckel sitzt, und 5 Minuten bei 37 °C inkubieren.

2. Behandlungen und Zugabe von Fluoreszenzfarbstoffen für das Multiplexing

1. Während sich die BME-Kuppeln in den 96-Well-Platten verfestigen, bereiten Sie Verdünnungen von fluoreszierenden Reagenzien für die Bildgebung lebender Zellen vor. Spezifische Parameter für das Multiplexing von Annexin V Red Dye und Cytotox Green Dye sind hierin angegeben.
2. Vorbereitung des Fluoreszenzreagenzes (Tag -1): Berechnen Sie das geeignete Volumen der Organoid-Nährmedien basierend auf der Anzahl der zu behandelnden Wells, wobei davon ausgegangen wird, dass jedes Well mit 100 μl farbstoffdosiertem Medium behandelt wird. Farbstoff in vorgewärmten Organoid-Nährmedien auf die gewünschte Konzentration verdünnen.
   HINWEIS: Die Gesamtmenge der benötigten Medien variiert je nach Experiment. Fügen Sie dem Endvolumen 10 % hinzu, um Pipettierfehler auszugleichen. Um beispielsweise die inneren 60 Wells einer 96-Well-Platte zu behandeln, bereiten Sie 6,6 ml farbstoffdosiertes Medium vor (Tabelle 1).
3. Behandeln Sie jede Vertiefung mit 100 μl 2x farbstoffdosiertem Organoid-Kulturmedium. Geben Sie 200 μl steriles 1x PBS in die äußeren leeren Vertiefungen der Platte. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: PBS in den peripheren Vertiefungen verringert die Verdunstung von Medien aus den inneren Vertiefungen.
4. Zugabe von Arzneimitteln/Behandlungsmitteln (Tag 0): Bereiten Sie Arzneimittel in vorgewärmten Organoid-Nährmedien in einer 2-fachen Konzentration in einem Volumen von 100 μl pro Vertiefung vor.
   HINWEIS: DMSO kann in hohen Konzentrationen für Zellen toxisch sein. Eine Konzentration von 0,1 % DMSO wird in den in dieser Studie durchgeführten Experimenten nicht überschritten. Zusätzlich zu Medikamenten werden einige fluoreszierende Reagenzien als DMSO-Lösung verteilt. Es ist wichtig, die Gesamt-DMSO-Konzentration bei der Arbeit mit solchen Reagenzien zu berücksichtigen.
5. Geben Sie 100 μl 2x farbstoffdosiertes Medium in jede Vertiefung; Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.

3. Einrichten von Bildgebungsparametern

1. Platte in Zytation 5 legen. Offen Gen5-Software. Klicken Sie > manuellen Imager-Modus auf Neue Aufgabe. Wählen Sie Jetzt aufnehmen und geben Sie die folgenden Einstellungen ein: Objektiv (gewünschte Vergrößerung auswählen); Filter (Mikroplatte auswählen); Mikroplattenformat (wählen Sie die Anzahl der Wells); und Behältertyp (Plattentyp auswählen). Klicken Sie auf Deckel verwenden und Langsamere Trägergeschwindigkeit verwenden. Klicken Sie auf OK.
   HINWEIS: Gefäßtyp: Seien Sie bei der Auswahl von Informationen über die Platte so genau wie möglich, da die Software für jeden Plattentyp und jede Dicke des Kunststoffs auf den spezifischen Abstand vom Objektiv zur Unterseite der Platte kalibriert ist.
   Langsamere Trägergeschwindigkeit: Aktivieren Sie dieses Kontrollkästchen, um eine Unterbrechung der Kuppeln beim Be- und Entladen von Platten zu vermeiden.
2. Erstellen Sie einen Z-Stapel, der die gesamte BME-Kuppel abbildet.
   1. Wählen Sie ein Well of Interest aus, das angezeigt werden soll (linkes Feld, unter dem Histogramm).
   2. Wählen Sie den Hellfeldkanal (linkes Bedienfeld, oben). Klicken Sie auf Automatisch belichten und passen Sie die Einstellungen nach Bedarf an.
   3. Legen Sie den unteren und oberen Rand des Z-Stapels fest: Erweitern Sie die Registerkarte "Imaging-Modus " (linker Bereich, Mitte). Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Z-Stapel . Klicken Sie mit den Kursanpassungspfeilen (linker Bereich, Mitte) auf die Abwärtseinstellung, bis alle PDOs unscharf und unscharf geworden sind. Legen Sie dies als unteren Rand des Z-Stapels fest. Wiederholen Sie den Vorgang in die entgegengesetzte Richtung, indem Sie die Kursanpassungspfeile verwenden, um die Oberseite des Z-Stapels festzulegen.
   4. Um sicherzustellen, dass die Z-Stapel-Einstellungen für andere Wells von Interesse geeignet sind, wählen Sie ein anderes Well-Feld aus (linker Bereich, unter dem Histogramm) und visualisieren Sie die Ober- und Unterseite des Z-Stapels.
   5. Um die Fokuspositionen manuell einzugeben, klicken Sie auf die drei Punkte neben der Feineinstellung (linkes Feld, oben). Es öffnet sich ein Fenster; Geben Sie den obersten Z-Stapel-Wert ein (im linken Bereich in der Mitte unter Imaging-Modus). Wiederholen Sie den Vorgang für den unteren Z-Stapel-Wert. Passen Sie nach Bedarf an, um den gewünschten Z-Bereich zu erfassen, indem Sie Schritt 3.2.3 wiederholen. Wenn Anpassungen erforderlich waren, wählen Sie ein anderes Well aus, um die Einstellungen zu überprüfen.
3. Legen Sie die Belichtungseinstellungen für die Leuchtstoffkanäle fest. Die Einstellungen sind für zwei Leuchtstoffkanäle (GFP & TRITC) beschrieben. Die genaue Anzahl der Fluoreszenzkanäle hängt vom Experiment ab und davon, welche Fluoreszenzwürfel im Lebendzell-Bildgebungssystem installiert sind.
   HINWEIS: Wenn die Signalintensität am Ende des Experiments voraussichtlich deutlich höher ist, sollten Benutzer Testexperimente durchführen, um die optimalen Belichtungseinstellungen am Ende des Experiments zu bestimmen, die dann bei der Einrichtung der Anfangsparameter angewendet werden können.
   1. Erweitern Sie die Registerkarte Imaging-Modus (linker Bereich, Mitte) und öffnen Sie Imaging-Schritt bearbeiten. Ein Popup-Fenster wird angezeigt.
   2. Klicken Sie unter Kanäle auf die Blase für die gewünschte Anzahl von Kanälen. Legen Sie einen Kanal für das Hellfeld und zusätzliche Kanäle für jeden Fluoreszenzkanal fest. In diesem Beispiel ist Kanal 1 = Hellfeld; Kanal 2 = GFP; Kanal 3 = TRITC. Wählen Sie in den Dropdown-Menüs Farbe die entsprechende Einstellung für jeden Kanal aus. Schließen Sie das Bearbeitungsfenster, indem Sie auf OK klicken.
   3. Richten Sie jeden fluoreszierenden Kanal ein.
      1. Schalten Sie den Kanal auf GFP um (linkes Feld, oben).
      2. Klicken Sie auf Automatisch belichten (linker Bereich, oben). Erweitern Sie die Registerkarte Belichtung (linkes Bedienfeld, Mitte) und passen Sie die Belichtungseinstellungen an, um das Hintergrundsignal zu minimieren.
      3. Kopieren Sie die Belichtungseinstellungen auf die Registerkarte Bildmodus , indem Sie die Schritte 3.3.3.3-3.3.3.6 ausführen.
      4. Klicken Sie auf das Symbol Kopieren neben dem Feld Imaging-Schritt bearbeiten . Klicken Sie auf Imaging-Schritt bearbeiten, um ein weiteres Fenster zu öffnen.
      5. Klicken Sie unter dem GFP-Kanal auf das Symbol Zwischenablage in der Zeile Belichtung , um dem Kanal die Einstellungen für Beleuchtung, Integrationszeit und Kameraverstärkung hinzuzufügen.
      6. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.3.4-3.3.3.5 für den TRITC-Kanal. Klicken Sie auf OK , um das Fenster zu schließen.
4. Richten Sie die Bildvorverarbeitungs- und Z-Projektionsschritte ein, um die Bildvorverarbeitung zu automatisieren.
   1. Klicken Sie auf das Kamerasymbol (linkes Feld, untere Ecke). Es öffnet sich ein neues Fenster.
   2. Klicken Sie unter Verarbeitungsschritt hinzufügen (linker Bereich, unten) auf Bildvorverarbeitung. Es öffnet sich ein neues Fenster.
   3. Deaktivieren Sie auf der Registerkarte Hellfeld die Option Bildvorverarbeitung anwenden.
   4. Stellen Sie sicher, dass für jede Registerkarte "Fluoreszenzkanal " die Option "Bildvorverarbeitung anwenden" ausgewählt ist. Deaktivieren Sie Dieselben Optionen wie Kanal 1 verwenden und klicken Sie auf OK. Das Fenster wird geschlossen.
   5. Klicken Sie unter Verarbeitungsschritt hinzufügen auf Z-Projektion. Es öffnet sich ein neues Fenster. Passen Sie bei Bedarf den Slice-Bereich an (z. B. um den Z-Bereich einzugrenzen). Schließen Sie das Fenster, indem Sie OK auswählen.
5. Protokoll erstellen.
   1. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Bildsatz . Klicken Sie im Dropdownmenü auf Experiment aus diesem Bildsatz erstellen. Das Imaging-Fenster wird geschlossen und das Prozedurfenster wird geöffnet.
      HINWEIS: Die im manuellen Imager-Modus ausgewählten Parameter werden automatisch in das neue Fenster geladen, wodurch ein experimentelles Protokoll erstellt werden kann.
   2. Temperatur und Farbverlauf einstellen: Klicke unter der Überschrift "Aktionen" (links) auf "Temperatur einstellen". Es öffnet sich ein neues Fenster. Wählen Sie Inkubator Ein und geben Sie die gewünschte Temperatur manuell unter Temperatur ein. Geben Sie als Nächstes unter Farbverlauf manuell 1 ein. Schließen Sie das Fenster, indem Sie OK auswählen.
      Anmerkungen: Durch die Erzeugung eines Gradienten von 1 °C wird verhindert, dass sich Kondenswasser auf dem Deckel der Platte bildet.
   3. Weisen Sie dem Bild Vertiefungen zu.
      1. Doppelklicken Sie unter Beschreibung auf den Bildschritt. Klicken Sie auf Vollplatte (rechte Ecke, oben). Dadurch wird das Fenster Plattenlayout geöffnet.
      2. Markieren Sie interessante Vertiefungen mit dem Cursor. Klicken Sie auf OK. Aktivieren Sie bei Bedarf die Kontrollkästchen "Autofokus-Binning " und " Binning erfassen ". Klicken Sie auf OK , um das Fenster zu schließen.
         HINWEIS: Das Binning erfordert eine Belichtungsanpassung, wie in Schritt 3.3.3.2 oben beschrieben. Im Abschnitt "Diskussion" finden Sie spezifische Szenarien, in denen diese Funktion verwendet werden kann.
   4. Legen Sie Intervalle für die kinetische Bildgebung fest.
      1. Klicken Sie auf Optionen unter der Überschrift Andere (links). Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Diskontinuierliches kinetisches Verfahren .
      2. Geben Sie unter Geschätzte Gesamtzeit die Laufzeit für das Experiment ein (z. B. 5 Tage). Geben Sie unter Geschätztes Intervall das Intervall ein, in dem die Platte abgebildet werden soll (z. B. alle 6 h).
      3. Klicken Sie nach jedem Durchlauf auf Pause , damit die Platte in den Inkubator übertragen werden kann. Schließen Sie das Fenster, indem Sie OK auswählen.
   5. Aktualisieren Sie die Schritte zur Datenreduzierung.
      1. Klicken Sie auf OK , um das Prozedurfenster zu schließen. Es öffnet sich eine Registerkarte, auf der Sie die Schritte zur Datenreduzierung aktualisieren können. Wählen Sie Ja aus. Doppelklicken Sie auf Bildvorverarbeitung. Klicken Sie sich durch die verschiedenen Kanäle, um die Einstellungen zu überprüfen, und klicken Sie auf OK.
      2. Doppelklicken Sie auf Z-Projektion. Klicken Sie sich durch die verschiedenen Kanäle, um die Einstellungen zu überprüfen. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie dann erneut auf OK , um das Datenreduzierungsfenster zu schließen.
   6. Formatieren Sie das Plattenlayout.
      1. Öffnen Sie den Plattenlayout-Assistenten, und legen Sie die Well-Typen fest, indem Sie die Schritte 3.6.2 bis 3.6.3 ausführen.
      2. Klicken Sie auf das Symbol Plattenlayout in der Symbolleiste (linke Ecke, oben), um den Plattenlayout-Assistenten zu öffnen.
      3. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen neben den im Experiment verwendeten Well-Typen. Geben Sie unter Assay-Kontrollen die Anzahl der verschiedenen Kontrolltypen mit den Pfeilen ein. Klicken Sie auf Weiter , um das Fenster Assay Control #1 zu öffnen.
      4. Legen Sie die Bedingungen für die Assay-Kontrollbohrung gemäß den Schritten 3.6.5-3.6.8 fest.
      5. Geben Sie im Fenster Assay Control #1 die Kontrollbeschriftung in das Feld Plate Layout ID ein. Geben Sie bei Bedarf den vollständigen Namen in das nebenstehende Feld ein. Wählen Sie die Anzahl der Replikationen für die jeweilige Kontrollbedingung mit den Pfeilen aus.
      6. Wenn Sie mehrere Konzentrationen oder eine Verdünnungsreihe innerhalb des Steuerelements verwenden, klicken Sie auf Verdünnungen/Konzentrationen definieren und wählen Sie im Dropdown-Menü den Typ aus. Geben Sie die Werte für jede Konzentration/Verdünnung in die Tabelle ein.
         HINWEIS: Die Auto-Funktion kann verwendet werden, wenn sich die Konzentrationen in einem gleichmäßigen Inkrement ändern.
      7. Wählen Sie die Registerkarte Farbe in der Symbolleiste aus. Wählen Sie die gewünschte Textfarbe und Hintergrundfarbe für die Steuerung im Dropdown-Menü. Klicken Sie auf Weiter.
      8. Wiederholen Sie dies bei Bedarf mit zusätzlichen Steuerelementen.
      9. Legen Sie die Bedingungen für die Probenvertiefung gemäß 3.6.10-3.6.12 fest.
      10. Geben Sie auf der Seite Beispieleinrichtung das Beispiel-ID-Präfix ein (z. B. SPL). Wählen Sie die Anzahl der Replikationen mit den Pfeilen aus. Wenn Sie Proben mit unterschiedlichen Behandlungskonzentrationen verwenden, wählen Sie Konzentrationen oder Verdünnungen im Dropdown-Menü Typ . Geben Sie Verdünnungen/Konzentrationen in die Tabelle ein und geben Sie Einheiten in das Feld Einheit ein.
      11. Wählen Sie Identifikationsfelder in der Symbolleiste aus. Geben Sie den /die gewünschte(n) Kategoriename(n) (z.B. Proben-ID, Medikament) in die Tabelle ein.
      12. Wählen Sie die Registerkarte Farbe in der Symbolleiste. Wählen Sie für jede Behandlungsgruppe/Probe eine andere Farbe. Klicken Sie auf Fertig stellen. Dadurch wird die Seite Plattenlayout geöffnet.
          HINWEIS: Die Zahlen auf der linken Seite korrelieren mit den verschiedenen Probennummern.
      13. Weisen Sie Beispiel-IDs zu, indem Sie die Schritte 3.6.14-3.6.16 ausführen.
      14. Auswählen SPL1 aus dem linken Bereich. Verwenden Sie den Cursor, um Wells auszuwählen.
          HINWEIS: Die Werkzeuge für die automatische Auswahl können im Feld für die Serienzuweisung angepasst werden. Die Anzahl der Replikate und die Ausrichtung des Layouts können vorgegeben werden.
      15. Wiederholen Sie den Vorgang mit anderen Proben, um das Plattenlayout zu vervollständigen. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf OK.
      16. Wählen Sie in der Symbolleiste Datei die Option Beispiel-IDs aus. Füllen Sie die Spalten der Proben-ID mit den entsprechenden Informationen für jede Probe aus (z. B. Arzneimitteltyp). Drücken Sie OK.
   7. Speichern Sie das Protokoll.
      1. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Datei > Protokoll speichern unter. Wählen Sie den Speicherort für die Datei aus. Geben Sie einen Dateinamen ein. Klicken Sie auf Speichern, um das Fenster zu schließen.
      2. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Datei > Beenden . Es öffnet sich eine Registerkarte, auf der Sie Änderungen am manuellen Imager-Modus speichern können. Wählen Sie Nein aus.
      3. Es öffnet sich eine Registerkarte, auf der Sie die Änderungen an Experiment 1 speichern können. Wählen Sie Nein aus. Es öffnet sich eine Registerkarte, auf der Sie die Protokolldefinition aktualisieren können. Wählen Sie Aktualisieren aus. Schließen Sie die Software.
6. Importieren Sie das Protokoll in BioSpa OnDemand und schließen Sie die Einrichtung des Experiments ab.
   1. Öffnen Sie die Software BioSpa OnDemand (Planungssoftware).
   2. Wählen Sie einen freien Steckplatz in der Software aus.
   3. Entfernen Sie die Platte aus dem Lebendzell-Bildgebungssystem. Klicken Sie auf Schublade öffnen , um auf den entsprechenden Steckplatz in der Planungssoftware zuzugreifen und die Platte einzusetzen. Klicken Sie auf Schublade schließen.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann jederzeit ausgeführt werden, nachdem das Protokoll in Schritt 3.5.7 oben erstellt wurde. Die Platte muss sich jedoch in der Cytation 5 befinden, um einen Zeitmesslauf in Schritt 3.6.4.3 durchzuführen.
   4. Importieren Sie das Protokoll.
      1. Wählen Sie auf der Registerkarte Verfahrensinformationen im Dropdown-Menü Benutzer aus. Klicken Sie neben dem Protokollslot auf Auswählen > Neuen Eintrag hinzufügen.
      2. Klicken Sie neben dem Protokollsteckplatz auf Auswählen. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet, in dem Sie zum gewünschten Protokoll in der Dateiarchitektur navigieren können. Klicken Sie auf Öffnen , um das Protokoll in die Planungssoftware zu importieren.
      3. Geben Sie die Zeit ein, die für die Abbildung der Platte benötigt wird. Klicken Sie auf OK , um das Fenster Gen5-Protokollliste zu schließen.
         HINWEIS: Dieser Schritt ist besonders wichtig, wenn mehrere Experimente gleichzeitig ausgeführt werden. Um die Zeit zu bestimmen, die für das Image benötigt wird, klicken Sie auf Jetzt einen Timing-Lauf durchführen. Klicken Sie auf OK.
   5. Legen Sie Bildgebungsintervalle fest und planen Sie das Experiment.
      1. Geben Sie unter Intervall das in Schritt 3.5.4 festgelegte Imaging-Intervall ein.
      2. Wählen Sie unter Startzeitoptionen die Option Wenn verfügbar aus. Wählen Sie unter Dauer die Option Fest oder Fortlaufend aus.
         HINWEIS: Es kann eine bestimmte Startzeit festgelegt werden, anstatt das Protokoll zum nächsten verfügbaren Zeitpunkt auszuführen. Wenn Sie Feste Dauer auswählen, wird ein bestimmter Endpunkt für das Experiment festgelegt und der Benutzer muss einen experimentellen Zeitrahmen festlegen. Die kontinuierliche Dauer ermöglicht die Ausführung des Experiments ohne Endpunkt und kann nur beendet werden, indem ein Benutzer das Experiment beendet.
      3. Klicken Sie auf Planplatte/Schiff. Dadurch wird die Plattenvalidierungssequenz geöffnet. Es öffnet sich eine Registerkarte mit der vorgeschlagenen ersten Lesezeit. Klicken Sie auf Ja , um diesen Zeitplan zu akzeptieren.

4. Bildanalyse in Gen5-Software (Abbildung 2)

1. Öffnen Sie das Bildanalysemodul.
   1. Öffnen Sie Gen5. Wählen Sie im Task-Manager Experimente > Öffnen aus. Wählen Sie das Experiment aus, um die Datei zu öffnen. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Platte > Ansicht.
   2. Ändern Sie das Dropdown-Menü Daten in Z-Projektion. Doppelklicken Sie auf eine Quelle von Interesse. Wählen Sie Analysieren aus, > ich einen neuen Schritt zur Datenreduzierung der Bildanalyse einrichten möchte. Klicken Sie auf OK.
2. Zelluläre Analyse
   1. Primäre Maske
      1. Wählen Sie unter Analyseeinstellungen die Option Typ: Mobilfunkanalyse und Erkennungskanal: ZProj[Tsf[Hellfeld]] (linker Bereich, Mitte).
      2. Klicken Sie auf Optionen. Dadurch wird die Seite Primäre Maske und Anzahl geöffnet. Aktivieren Sie im Feld Schwellenwert die Option Auto und klicken Sie auf Übernehmen. Klicken Sie auf das Feld Objekte hervorheben (rechter Bereich, unten), um Objekte innerhalb des festgelegten Schwellenwerts anzuzeigen. Passen Sie bei Bedarf an, um Objekte von Interesse einzubeziehen.
         HINWEIS: Die Schwellenwerteinstellungen basieren auf der Pixelintensität. Wenn der Schwellenwert beispielsweise auf 5000 festgelegt ist, werden Pixel mit einer Intensität von mehr als 5000 in die Analyse einbezogen.
      3. Legen Sie unter Objektauswahl die minimale und maximale Objektgröße (μm) fest. Passen Sie bei Bedarf an, um Zelltrümmer/einzelne Zellen auszuschließen.
         HINWEIS: Die PDO-Größe kann je nach Modell und Typ erheblich variieren. Verwenden Sie das Messwerkzeug in der Gen5-Software, um die minimalen und maximalen PDO-Größenschwellenwerte für jedes Modell zu bestimmen. Benutzer können einen kleineren Mindestschwellenwert für die PDO-Größe im Verhältnis zu dem vom Messwerkzeug angegebenen Wert wählen, um den Ausschluss von PDO-Fragmenten zu einem späteren Zeitpunkt nach der medikamentösen Behandlung zu verhindern.
      4. Um die Analyse auf einen bestimmten Bereich des Wells zu beschränken, deaktivieren Sie die Option Gesamtes Bild analysieren und klicken Sie auf Stecken. Verwenden Sie im Fenster "Image Plug " das Dropdown-Menü, um Plug-Form auszuwählen . Passen Sie die Größen- und Positionsparameter nach Bedarf an den gewünschten Bereich an.
         HINWEIS: Es ist wichtig, die Anzahl der PDOs innerhalb des Plugs zu maximieren und gleichzeitig PDO-freie Bereiche auszuschließen, um den Hintergrund zu minimieren. Legen Sie eine Plug-Größe fest, die die Mehrheit der interessierenden Objekte über Replikate hinweg konsistent erfasst. Es ist wichtig, einen Stopfen zu erzeugen, der auch die Kanten der Kuppel ausschließt, da er alle Objekte ausschließt, die aufgrund der Lichtbrechung durch die extreme Krümmung der Kuppel an den Rändern verzerrt erscheinen könnten. Primäre Kantenobjekte einschließen können auch deaktiviert werden, um nur ganze PDOs innerhalb des Plugs zu erfassen.
   2. Subpopulationsanalyse. Ein Beispiel für die Ausweisung von Teilpopulationen ist in Abbildung 3 dargestellt.
      1. Klicken Sie in der Symbolleiste Mobilfunkanalyse auf Berechnete Metriken. Klicken Sie auf Relevante Metriken auf Objektebene auswählen oder erstellen (rechte Ecke, unten). Wählen Sie unter Metriken für verfügbare Objekte die gewünschten Metriken aus (z. B. Zirkularität) und klicken Sie auf die Schaltfläche Einfügen. Klicken Sie auf OK.
         HINWEIS: Die Morphologie und Dichte jedes PDO-Modells bestimmt die besten Metriken von Interesse zur Unterscheidung der Subpopulation.
      2. Klicken Sie in der Symbolleiste Zellanalyse auf Subpopulationsanalyse. Klicken Sie auf Hinzufügen, um eine neue Teilpopulation zu erstellen. Es öffnet sich ein Popup-Fenster.
      3. Geben Sie bei Bedarf einen Namen für die Teilpopulation ein. Wählen Sie unter Objektmetriken eine gewünschte Metrik aus und klicken Sie auf Bedingung hinzufügen. Geben Sie im Fenster Bedingung bearbeiten Parameter für die ausgewählte Objektmetrik ein. Wiederholen Sie dies bei Bedarf mit zusätzlichen Metriken.
         HINWEIS: Die Parameter können manuell angepasst oder mit dem Sucherwerkzeug eingestellt werden. Um beispielsweise Schmutz auszuschließen, können Benutzer Fläche als Objektmetrik hinzufügen und Objekte auswählen, die kleiner als 800 sind. Zirkularität als Objektmetrik wird routinemäßig verwendet, und je nach Modell sind alle Objekte mit einer Rundheit von mehr als 0,2 bis 0,5 enthalten.
      4. Aktivieren Sie in der Tabelle unten im Fenster die gewünschten Ergebnisse, die angezeigt werden sollen. Klicken Sie auf OK > Übernehmen.
      5. Um die Objekte innerhalb der Teilauffüllung anzuzeigen, verwenden Sie das Dropdown-Menü Objektdetails (rechter Bereich, Mitte), um die Teilauffüllung auszuwählen. Objekte, die unter die Parameter fallen, werden im Bild hervorgehoben.
         HINWEIS: Um die Hervorhebungsfarben der primären Maske und der Unterfüllung zu ändern, klicken Sie auf Einstellungen (rechter Bereich, unten).
      6. Um die Parameter für Teilpopulationen anzupassen, öffnen Sie das Fenster Teilpopulationsanalyse erneut über die Werkzeugleiste Zellanalyse . Wählen Sie die Teilpopulation aus und klicken Sie auf Bearbeiten. Klicken Sie auf Schritt hinzufügen.
         HINWEIS: Dadurch wird die gleiche Analyse auf alle Vertiefungen innerhalb des Experiments zu allen Zeitpunkten angewendet. Im Dropdown-Menü auf der Seite Matrix können verschiedene Metriken für die individuelle Anzeige ausgewählt werden.

5. Exportieren von Daten aus Gen5 nach Excel

1. Um eine Datendatei für den Export anzupassen, wählen Sie in der Symbolleiste das Symbol Berichts-/Export-Generatoren aus. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Neuer Export nach Excel.
2. Wählen Sie auf der Seite Eigenschaften des Popupfensters die Option Bereich > Platte und Inhalt > Benutzerdefiniert. Klicken Sie auf die Option Inhalt in der Symbolleiste. Klicken Sie auf Vorlage bearbeiten, um das Excel-Programm zu öffnen.
3. Wählen Sie in der Tabelle Add-Ins > Tabelle > Well-Daten aus. Bewegen Sie den Mauszeiger über die verschiedenen Auswahlmöglichkeiten, um Optionen für den Export anzuzeigen. Wählen Sie die gewünschte Metrik aus (z. B. Objektmittelwert[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
   HINWEIS: Das Plattenlayout kann der Tabellenkalkulationsanalysevorlage hinzugefügt werden, indem Sie Add-Ins > Protokollzusammenfassung > Layout auswählen.
4. Ein Bearbeitungsfenster wird geöffnet. Legen Sie im Feld Wells die Wells für den Export entweder mit Well-ID oder Well # fest. Wählen Sie OK aus. Eine Vorlage wird in die Tabellenkalkulationsdatei geladen. Schließen Sie die Tabelle. Die Vorlage wird automatisch gespeichert.
5. Klicken Sie im Fenster Neuer Export nach Excel auf OK und schließen Sie das Fenster Bericht-/Export-Generatoren.
6. Klicken Sie auf das Symbol Exportieren in der Gen5-Symbolleiste. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben der gewünschten Exportdatei. Klicken Sie auf OK. Gen5 füllt die Tabellenkalkulationsvorlage automatisch aus und öffnet die Datei in Excel.

6. Externe Datenanalyse

1. Öffnen Sie die Exportdatei (.xlsx) in Excel.
2. Teilen Sie für jedes Welling jeden einzelnen Wert durch den 0:00-Zeitpunktwert für dieses Well. Dadurch wird der Zeitpunkt 0 auf 1 gesetzt, und jeder Wert darüber hinaus ist relativ zum ursprünglichen Messwert.
3. Öffnen Sie eine neue Datei in der Datenanalysesoftware. Wählen Sie die Option XY-Layout .
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurde GraphPad Prism (Version 9.5.1) verwendet.
4. Eingabebeschriftungen für jede Datengruppe. Kopieren Sie die Zeitpunkte und die entsprechenden normalisierten Werte für jede Behandlungsgruppe und fügen Sie sie in die Prisma-Tabelle ein. Ein Diagramm für die Daten wird automatisch generiert und ist unter Diagramme zu finden.

Ergebnisse

Unser Ziel war es, die Machbarkeit der Verwendung von Multiplex-Lebendzell-Imaging zur Beurteilung des PDO-Therapieansprechens zu demonstrieren. Proof-of-Concept-Experimente wurden in zwei separaten PDO-Modellen des Endometriumkarzinoms durchgeführt: ONC-10817 und ONC-10811 (siehe ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 2 für ONC-10811-Daten). Apoptose (Annexin-V-Färbung) und Zytotoxizität (Cytotox Green-Aufnahme) wurden als Reaktion auf den Apoptose-induzierenden Wirkstoff Staurosporin kinetisch überwacht. Konkret wurden PDOs in 96-Well-Platten plattiert, mit Annexin V Red und Cytotox Green Farbstoffen behandelt und über Nacht in einen 37 °C heißen Inkubator gegeben, wie in Abbildung 1 dargestellt. Wir bestätigten in zwei unabhängigen PDO-Modellen, dass die Behandlung mit Annexin V und Cytotox Green Farbstoffen nicht toxisch ist (Ergänzende Abbildung 2). Am folgenden Tag wurden die PDOs mit steigenden Konzentrationen von Staurosporin (0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM) behandelt. Anschließend wurden Protokolle in der Gen5-Software erstellt und die Experimente auf einen Zeitraum von 5 Tagen festgelegt, wobei alle 6 Stunden eine Bildgebung durchgeführt wurde. Die Daten wurden mit der Zellularanalysefunktion in der Gen5-Software analysiert, wie in Abschnitt 4 des Protokolls beschrieben. Die Primärmaske wurde mit der Auto-Schwellenwert-Funktion mit deaktiviertem "Berührende Objekte teilen" und mit Größenparametern von Minimum: 30 μm und Maximum: 1000 μm eingestellt. Die PDO-Subpopulation wurde durch Zirkularität > 0,25 definiert. Die mittleren Objektintensitäten in den TRITC- (Annexin V, Apoptose) und GFP-Kanälen (Cytotoxgrün, Zytotoxizität) innerhalb der designierten PDO-Subpopulation wurden zur weiteren Analyse als .xlsx Datei exportiert. Die mittlere Objektintensität für jedes Well zu jedem Zeitpunkt sowohl im GFP- als auch im TRITC-Kanal wurde auf den Zeitpunkt 0 normalisiert. Normalisierte Fluoreszenzdaten wurden dann in eine Prismendatei übertragen und als Liniendiagramm visualisiert.

Die Behandlung mit Staurosporin führte zu einem signifikanten, dosisabhängigen Anstieg der Apoptose und einer Abnahme der Zellgesundheit im Laufe der Zeit im Vergleich zur Vehikelkontrolle, was durch den Anstieg der mittleren Objektintensität sowohl im TRITC- (Annexin V) als auch im GFP-Kanal (Zytotox) belegt wird (Abbildung 4, Abbildung 5, Ergänzendes Video 1, Ergänzendes Video 2, Ergänzendes Video 3, Ergänzendes Video 4, Ergänzendes Video 5, Ergänzendes Video 6 und Ergänzendes Video 7). Die Dosen von 500 nM, 100 nM und 10 nM Staurosporin führten jeweils zu einem statistisch signifikanten Anstieg sowohl der Apoptose als auch der Zytotoxizität im Laufe der Zeit (Abbildung 5A-C) sowie am Ende des Experiments (Abbildung 5E, F). Darüber hinaus hemmte Staurosporin das Wachstum und die Bildung von PDO bei diesen Konzentrationen effektiv, was sich in einer allgemeinen Abnahme der gesamten PDO-Fläche zeigte, während die Kontrollbohrungen eine Zunahme der gesamten PDO-Fläche aufwiesen (Abbildung 4 und Abbildung 5D).

Da ein großer Vorteil der Lebendzell-Bildgebung die Fähigkeit ist, die Variabilität in der Beschichtung zu korrigieren, führten wir ein Experiment durch, bei dem die Zellviabilität als Endpunktmaß bewertet wurde. Proof-of-Concept-Endpunkt-Assay-Daten wurden mit einem PDO-Modell gesammelt, das aus einem vom Patienten stammenden Xenotransplantat von Prostatakrebs generiert wurde. Zu Beginn des Behandlungszeitraums (Tag 0) wurden Hellfeldbilder aufgenommen, gefolgt von der Zugabe eines Dual-Farbstoff-Reagenzes, das sowohl die Lebensfähigkeit (Acridinonore, AO) als auch den Zelltod (Propidiumiodid, PI) misst. Die AO-Komponente sendet bei der Bindung an doppelsträngige DNA ein grün fluoreszierendes Signal aus, ein Indikator für die Lebensfähigkeit von Zellen. Die PI-Komponente färbt tote kernhaltige Zellen und kann verwendet werden, um den Zelltod als Reaktion auf die Behandlung zu quantifizieren. Um die Variabilität bei der PDO-Beschichtung zu berücksichtigen, haben wir eine Methode entwickelt, um die Anzahl der PDOs pro Well zum Zeitpunkt 0 zu bestimmen, indem wir Hellfeldbilder in digitale Phasenkontrastbilder umwandeln (Ergänzende Abbildung 3 und Ergänzende Datei 1).

Prostatakrebs-PDOs wurden 7 Tage lang mit Daunorubicin, einem Chemotherapeutikum, das den Zelltod verursacht, behandelt. Nach Abschluss des Experiments wurden die Proben mit AOPI gefärbt, wie in Ergänzungsdatei 1 beschrieben, gefolgt von der Analyse von Fluoreszenzbildern in Gen5. Abbildung 6A zeigt eine Reihe von Bildern aus dem AOPI-Endpunkt-Assay an Tag 7. Beim Vergleich von Vehikel-behandelten PDOs (erste Reihe) mit PDOs, die mit 10 μM Daunorubicin behandelt wurden (zweite Zeile), gab es eine deutliche Abnahme der grünen Fluoreszenz (Maß für die Lebensfähigkeit, Spalte zwei) und eine Zunahme der roten Fluoreszenz (Maß für den Zelltod, Spalte drei). Diese Ergebnisse wurden dann in Abbildung 6B quantifiziert, wo wir die Reihe von Messwerten zeigen, die mit der AOPI-Endpunktfärbetechnik erzielt werden können. Das Diagramm oben links zeigt die aus dem AO-Farbstoff generierte Viabilitätsmessung, normiert auf die PDO-Zahl, die durch die digitale Phasenkontrast-Bildanalyse jedes Wells an Tag 0 bestimmt wurde. Diese Daten korrelieren mit dem visuellen Ergebnis aus Abbildung 6A, wobei mit zunehmender Konzentration von Daunorubicin die Lebensfähigkeit drastisch abnahm. Dies wird in der oberen rechten Grafik weiter rekapituliert, die eine Zunahme des Zelltods zeigt, die durch eine Zunahme der mit der PI-Färbung erfassten roten Fluoreszenz gekennzeichnet ist.

Die PI-Daten wurden dann mit dem Viabilitätswert (AO) kombiniert, um ein Verhältnis von Lebensfähigkeit zu Totwert zu berechnen (Abbildung 6B, Grafik unten links). Dieses Verhältnis ist ein nützlicher Ansatz, um festzustellen, ob ein Medikament zytostatisch oder zytotoxisch ist. Insbesondere erreicht ein zytotoxisches Medikament viel näher an 0 als ein Zytostatikum, da ein zytostatisches Medikament das Wachstum hemmt, aber möglicherweise keinen Zelltod induziert. Schließlich kann die Fläche der PDOs mit der grünen Fluoreszenz der AO-Färbung genau berechnet werden, selbst wenn PDOs Zelltod und Blubbing durchlaufen können. Die untere rechte Grafik zeigt die durchschnittliche PDO-Fläche, die als Summe der in der Subpopulationsanalyse angegebenen Fläche dividiert durch die PDO-Zahl berechnet wurde. Die Analyse des Areals kann weitere Hinweise darauf geben, ob eine Behandlung lediglich das PDO-Wachstum hemmt oder tatsächlich eine PDO-Regression verursacht. Beachten Sie, dass die Analyse der durchschnittlichen PDO-Fläche mit dem GFP-Kanal und der Zellularanalysefunktion durchgeführt wurde, im Gegensatz zu Abbildung 5D, bei der die Hellfeldbilder zur Berechnung der gesamten PDO-Fläche verwendet wurden. Diese Daten unterstreichen die Flexibilität der Analysepipeline in Abhängigkeit von der Datenverfügbarkeit und dem Benutzerinteresse.

Schließlich verglichen wir den Goldstandard für Viabilitätsmessungen, CellTiter-Glo 3D, mit der Viabilitätsfluoreszenzmessung mit AOPI (Abbildung 6C). Beachten Sie, dass die Daten in diesem Panel nicht auf die PDO-Zahl zum Zeitpunkt 0 normalisiert wurden, da diese Normalisierung normalerweise nicht von Laboren durchgeführt wird, die das CellTiter-Glo 3D-Kit verwenden. Wir beobachteten in beiden Assays den gleichen Trend für die Arzneimittelwirkung, wobei die PDO-Lebensfähigkeit mit zunehmender Daunorubicin-Konzentration abnahm. Der einzige visuelle Unterschied zwischen diesen Auslesungen bestand darin, dass die CellTiter-Glo 3D-Analyse vor der AOPI-Analyse einen IC50 erreichte und fast vollständig 0 erreichte. Dieses Ergebnis kann durch den Wirkmechanismus von Daunorubicin erklärt werden. Daunorubicin ist ein Topoisomerase-II-Inhibitor, der doppelsträngige DNA-Brüche einführt, die zu einem Zellzyklusarrest und schließlich zu Apoptose führen¹⁴. Während des Zellzyklusarrests kann es zu einer ATP-Depletion kommen¹⁵. Da der CellTiter-Glo 3D-Assay auf einer ATP-Luciferase-Reaktion basiert, um ein Lumineszenzsignal zu erzeugen, stellen wir die Hypothese auf, dass die stärkere Verringerung der Zellviabilität bei höheren Konzentrationen von Daunorubicin eher auf ATP-Depletion als auf den vollständigen Zelltod zurückzuführen ist. Um diese Idee zu unterstützen, zeigen die Bilder in Abbildung 6A eine Population, die PDOs in der Kultur lebt, was durch grüne Fluoreszenz gekennzeichnet ist.

Abbildung 1: Überblick über das Beschichtungs-, Bildgebungs- und Analyseprotokoll. PDOs werden in einer 96-Well-Platte plattiert und mit Fluoreszenzfarbstoffen und Medikamenten behandelt. Bildgebungsparameter für das Experiment (z. B. Belichtung, Z-Stapel) werden in der Gen5-Software erstellt. Die Bilder werden von der Cytation 5 aufgenommen und in Gen5 verarbeitet, und die Daten werden zur weiteren Analyse exportiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Übersicht über die Funktion "Mobilfunkanalyse". 1: Stecker festlegen: Ein Stecker ist für Interessenbereiche vorgesehen. 2: Primäre Maske festlegen: Die primäre Maske definiert Objekte von Interesse basierend auf Größe und Pixelintensität in einem Kanal Ihrer Wahl. In diesem repräsentativen Bild sind die in der primären Maske enthaltenen Objekte violett umrandet. 3: Subpopulation definieren: Eine zusätzliche Subpopulation kann definiert werden, um die gewünschte Population für die Analyse weiter zu verfeinern. Die Teilgesamtheit im Beispielbild (gelb umrandet) wird basierend auf der Kreisförmigkeit (>0,25) und der Fläche (>800) definiert. Die Bilder wurden mit einem 4x-Objektiv aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Beispiele für die Maskierung von Subpopulationen mit der Funktion "Zellanalyse". Subpopulationen werden im Hellfeldkanal definiert. Die Teilpopulation in den Beispielbildern (gelb umrandet) wird basierend auf der Zirkularität (>0,25) und der Fläche (>800) definiert. Die Bilder wurden mit einem 4X-Objektiv aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Die Behandlung mit Staurosporin führt zu einem dosisabhängigen Anstieg der Apoptose und Zytotoxizität. Hellfeldbilder (4x Objektiv) mit GFP- und TRITC-Fluoreszenzüberlagerung werden für die 500 nM-, 10 nM- und 0,1 nM-Dosen von Staurosporin zu 3 Zeitpunkten gezeigt: 0 h, 54 h, 114 h. Das rote Fluoreszenzsignal zeigt Apoptose (Annexin V) und das grüne Fluoreszenzsignal zeigt Zytotoxizität (Cytotox) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Multiplex-Fluoreszenz-Lebendzell-Bildgebung zur Beurteilung der PDO-Reaktion. Das PDO-Modell ONC-10817 wurde in 96-Well-Platten plattiert und über Nacht bei 37 °C mit den Farbstoffen Annexin V Red (1:400) und Cytotox Green (200 nM) inkubiert. Am folgenden Tag wurden die PDOs mit steigenden Konzentrationen von Staurosporin behandelt und ~5 Tage lang alle 6 Stunden abgebildet. (A,B) Zeit- und dosisabhängiger Anstieg der (A) Zytotoxizität oder (B) Apoptose als Reaktion auf Staurosporin. Die Daten wurden als mittlere Objektintensität im GFP- oder TRITC-Kanal dargestellt. (C) Vergleich des zeitlichen Verlaufs von Apoptose und Zytotoxizität als Reaktion auf 100 nM oder 500 nM Staurosporin. Die Daten wurden als Werte für die mittlere Objektintensität in den GFP- und TRITC-Kanälen dargestellt. (D) Staurosporin hemmt das Wachstum von g.U. Die Daten wurden als durchschnittliche Gesamtfläche der g.U. dargestellt. Die Daten in A-D wurden auf die PDO-Zahl zum Zeitpunkt 0 h in jeder Vertiefung normalisiert und als Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aufgetragen. N=5 technische Replikate pro Behandlung. p < 0,0001 vs. Fahrzeugsteuerung durch 2-Wege-ANOVA. (E) Repräsentative Hellfeld-, GFP- und TRITC-Bilder von 500 nM Staurosporin-behandelten PDOs im Vergleich zum Fahrzeug am Ende des Experiments (114 h). Die Bilder wurden mit einem 4x-Objektiv aufgenommen. (F) Quantifizierung der Zytotoxizität, Apoptose und Lebensfähigkeit zum Zeitpunkt von 114 Stunden. Die mittlere Intensität des GFP-Objekts (links) und die mittlere Intensität des TRITC-Objekts (Mitte) wurden zum Zeitpunkt von 114 Stunden unter Verwendung der Ergebnisse der Panels A-C berechnet. Die Lebensfähigkeit (rechts) wurde mit dem CellTiter-Glo 3D-Reagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers bewertet. Die Rohlumineszenzwerte (RLU) wurden auf die gesamte PDO-Fläche zum Zeitpunkt 0 h normalisiert und als Faltbarkeit relativ zur Fahrzeugsteuerung aufgetragen, die auf 1,0 festgelegt wurde. ** p<0,01, ***p<0,001, **** p<0,0001 vs. Fahrzeugsteuerung über Einweg-ANOVA mit Dunnetts Post-hoc-Test. N = 5 technische Wiederholungen pro Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Verwendung von Lebendzell-Bildgebung zur Unterstützung der Normalisierung von Endpunkt-Assay-Daten. PDOs wurden 7 Tage lang mit steigenden Konzentrationen des Topoisomerase-II-Inhibitors Daunorubicin behandelt. Die PDOs wurden AOPI-Färbelösung ausgesetzt und wie in der Zusatzdatei 1 beschrieben abgebildet. AO = Acridinorange, ein Maß für die Lebensfähigkeit (GFP-Kanal); PI = Propidiumiodid, ein Maß für den Zelltod (Texas Red Channel). (A) Repräsentative Bilder, die mit AOPI-Färbung nach 7-tägiger Behandlung mit 10 μM Daunorubicin oder Vehikelkontrolle (0,1 % DMSO) aufgenommen wurden. (B) Verschiedene Auslesungen unter Verwendung von AOPI-Fluoreszenz als Endpunkt-Viabilitäts-/Zelltodmethode. Siehe Ergänzungsdatei 1 für eine detaillierte Beschreibung der Analysemethoden. Oben links, Analyse der PDO-Lebensfähigkeit nach 7 Tagen, bestimmt durch AO-Färbung. Oben rechts, Analyse des Zelltods durch PI-Färbung. Die Daten für die AO- und PI-Färbung wurden auf die PDO-Zahl zum Zeitpunkt 0 h und dann auf die Fahrzeugkontrolle normalisiert, die auf 1,0 festgelegt wurde, und als Mittelwert und Standardabweichung aufgetragen. Unten links, Berechnung des Verhältnisses von Lebensfähigkeit zu Tot unter Verwendung der durchschnittlichen Objektintegrale für die AO- und PI-Färbungen. Unten rechts, Bereich der PDOs, bestimmt durch AO-Färbung. Die zelluläre Analyse wurde im GFP-Kanal durchgeführt. (C) Vergleich zweier Methoden zur Prüfung der Lebensfähigkeit der g.U. Nach der Bildgebung wurde die Viabilität mit dem CellTiter-Glo 3D-Reagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers bewertet. Das Faltenüberleben relativ zur Fahrzeugkontrolle wurde bei steigenden Konzentrationen von Daunorubicin aufgetragen. Die Daten stellen den Mittelwert und die Standardabweichung für N = 6 technische Replikate pro Behandlung dar; Die Daten wurden in Panel C nicht auf die Zeit 0 h normiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Behandlung	# der Brunnen	Medienvolumen	Anhang		100 μM Zytotox
			Verdünnung	Volumen	Verdünnung	Volumen
Multiplex	60	6,6 ml	1:400	16,5 μl	200 nM	13,2 μl

Tabelle 1: Beispiel für ein Multiplexing-Experiment. Annexin V Rot bindet exponiertes Phosphatidylserin an das äußere Segel apoptotischer Zellmembranen. Cytotox Green integriert sich in Zellen mit beeinträchtigter Membranintegrität und bindet DNA.

Ergänzende Abbildung 1: Multiplex-Lebendzell-Bildgebung von ONC-10811. PDOs wurden in 96-Well-Platten plattiert und über Nacht bei 37 °C in den Farbstoffen Annexin V Red (1:400) und Cytotox Green (200 nM) inkubiert. Am folgenden Tag wurden die PDOs mit steigenden Konzentrationen von Staurosporin behandelt und 5 Tage lang alle 6 Stunden abgebildet. (A) Zeit- und dosisabhängiger Anstieg der Zytotoxizität als Reaktion auf Staurosporin. Die Daten wurden als mittlere Objektintensität im GFP-Kanal dargestellt. (B) Dosis-Wirkungs-Verhältnis von Staurosporin bei 114 h. Die Daten wurden als Werte für die mittlere Objektintensität im GFP-Kanal zum Zeitpunkt von 114 Stunden aufgetragen. (C) Zeit- und dosisabhängiger Anstieg der Apoptose als Reaktion auf Staurosporin. Die Daten wurden als mittlere Objektintensität im TRITC-Kanal dargestellt. (D) Dosis-Wirkungs-Verhältnis von Staurosporin bei 114 h. Die Daten wurden als Werte für die mittlere Objektintensität im TRITC-Kanal zum Zeitpunkt von 114 Stunden dargestellt. Die Daten in A und C wurden auf die PDO-Zahl zum Zeitpunkt 0 h auf Bohrlochebene normalisiert. N = 5 technische Wiederholungen pro Behandlung in jedem Modell. p < 0,0001 vs. Fahrzeugsteuerung durch 2-Wege-ANOVA. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Die Behandlung mit Annexin V und Cytotox stört die PDO-Lebensfähigkeit nicht. Die PDOs wurden in 96-Well-Platten plattiert und über Nacht bei 37 °C mit den Farbstoffen Annexin V Red (1:400) und Cytotox Green (200 nM) inkubiert. Nach der 24-stündigen Inkubation wurde die Lebensfähigkeit mit dem CellTiter-Glo 3D-Assay gemäß dem Protokoll des Herstellers bewertet. (A) Lebensfähigkeit bei farbstoffbehandelten und unbehandelten g.U. zum Zeitpunkt von 24 Stunden. Es werden sowohl RLU-Werte (Relative Light Unit) als auch auf PDO-Summenfläche normierte Werte dargestellt. Insbesondere wurde die CellTiter-Glo3D-RLU für jedes Well zum Zeitpunkt der Beschichtung (d. h. unmittelbar nach der Farbstoffzugabe) auf die Summe der PDO-Fläche für dieses Well normalisiert. Die gesamte PDO-Fläche wurde mit der Berechnung "Objektsummenfläche" in der Zellanalyse bestimmt. N = 10. (B) Lebensfähigkeit bei farbstoffbehandelten und unbehandelten g.U. zum Zeitpunkt von 114 h. Es werden sowohl rohe Lumineszenzwerte als auch auf die gesamte PDO-Fläche normierte Werte dargestellt. Die CellTiter-Glo3D-RLU für jedes Well wurde auf die Summation des PDO-Bereichs 24 h nach der Beschichtung normiert, was der Zeit 0 h in den kinetischen Bildgebungsexperimenten entspricht. N = 5. Die Signifikanz in A und B wurde mit einem ungepaarten t-Test bewertet; p-Werte sind in den Diagrammen aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Markierungsfreie Analyse von PDOs mit digitalem Phasenkontrast. Diese Abbildung enthält repräsentative Bilder (2,5-faches Objektiv), die eine markierungsfreie Analyse darstellen, wie in der Ergänzungsdatei 1: Einrichten von Bildgebungsparametern für die Analyse einer einzelnen Brennebene (Hellfeld-/digitale Phasenkontrastbilder) und die digitale Phasenkontrastbildanalyse in der Gen5-Software beschrieben. (A) Beispiel für ein Hellfeldbild eines Prostatakrebs-PDXO-Modells in einer einzelnen Brennebene. (B) Das Hellfeldbild in A wurde in ein digitales Phasenkontrastbild umgewandelt. Dunkle Objekte im Hellfeldbild erscheinen hell im digitalen Phasenkontrastbild und umgekehrt. (C) Beispiel für eine PDO-Maskierung mit dem digitalen Phasenkontrastbild. Beachten Sie, dass die Kanten von Objekten von Interesse im Vergleich zu den Hellfeldbildern viel stärker definiert werden. In diesem repräsentativen Bild sind Objekte in der Primärmaske gelb umrandet. Die Teilpopulation in (C) (rosa umrandet) wird basierend auf der Zirkularität (>0,3), der Fläche (>1000), dem Mittelwert[Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500 und dem Peak[Dig.Ph.Con] > 12500 definiert. Die in dieser repräsentativen Abbildung verwendeten Parameter wurden auf die Daten in Abbildung 6 angewendet, um die Zellzahl am Tag 0 zu normalisieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: PDO-Modelle können in ihrer Morphologie und Plattierungskonsistenz variieren. Oberes Bild: Beispiele für die differentielle Dispersion von PDOs in den BME-Kuppeln. Unteres Bild: Repräsentative Bilder von diskohesiven vs. kreisförmigen g.U. Alle Bilder wurden mit einem EVOS-Mikroskop aufgenommen. Vergrößerungen werden notiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Beispielbilder mit Zellanalyse vs. Bildstatistik zur Quantifizierung der Fluoreszenz. Mit der Zellanalyse können Benutzer bestimmte Populationen innerhalb eines Bildes definieren und die Fluoreszenz in diesen Bereichen messen. Bildstatistiken können auch verwendet werden, um die Fluoreszenz in einem Bild zu messen, indem ein Schwellenwert zum Ausschluss von Hintergrundsignalen definiert wird. In der Diskussion finden Sie Informationen zu den Einschränkungen bei der Verwendung von Bildstatistiken. Die Bilder haben eine 4-fache Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Komponenten von Organoid-Nährmedien. Beachten Sie, dass die Reagenzien für die Kultivierung gynäkologischer Krebs-PDOs optimiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 1: Zeitraffervideo der 500 nM Staurosporin-Behandlung mit Bildern, die alle 6 Stunden aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 2: Zeitraffervideo der 100 nM Staurosporin-Behandlung mit Bildern, die alle 6 Stunden aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 3: Zeitraffervideo der 10 nM Staurosporin-Behandlung mit Bildern, die alle 6 Stunden aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 4: Zeitraffervideo der 1 nM Staurosporin-Behandlung mit Bildern, die alle 6 Stunden aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 5: Zeitraffervideo der 0,1 nM Staurosporin-Behandlung mit Bildern, die alle 6 Stunden aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 6: Zeitraffervideo der 0,01 nM Staurosporin-Behandlung mit Bildern, die alle 6 Stunden aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 7: Zeitraffervideo des Fahrzeugs (0,06 % DMSO) mit Bildern, die alle 6 Stunden aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Ergänzende Protokolle. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

PDO-Kulturen werden aufgrund ihrer Fähigkeit, zelluläre Reaktionen und Verhaltensweisen widerzuspiegeln, zu einem immer beliebteren In-vitro-Modellsystem². Bedeutende Fortschritte wurden bei der Erzeugung, Kultur und Expansion von PDO-Techniken erzielt, aber Methoden zur Analyse therapeutischer Reaktionen hinken hinterher. Kommerziell erhältliche 3D-Viabilitätskits sind lytische Endpunkt-Assays, bei denen potenziell wertvolle Daten zur kinetischen Reaktion fehlen und nachfolgende Analysen durch andere Methoden eingeschränkt^{werden 8}. Neue Studien wenden die Bildgebung lebender Zellen an, um das Ansprechen von Medikamenten in PDO-Modellen zu bewerten. Hier stellen wir eine Methode vor, um das therapeutische Ansprechen von PDO im Laufe der Zeit unter Verwendung von Multiplex-Fluoreszenz-Lebendzell-Imaging zu bewerten. Das Multiplexen von Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht die gleichzeitige Quantifizierung verschiedener zellulärer Reaktionen. Neben Apoptose und Zytotoxizität können wir uns vorstellen, dass dieser Ansatz in zukünftigen Studien erweitert werden kann, um andere phänotypische Effekte bei PDOs zu untersuchen.

Das hierin vorgestellte Protokoll ist so konzipiert, dass es kinetische Hellfeld- und Fluoreszenzbilder von PDOs erfasst, die als Kuppeln in einer 96-Well-Platte plattiert sind. Zu den wichtigsten Schritten gehören 1) Beschichtung, 2) Behandlung mit Farbstoff und Arzneimittel, 3) Definition von Bildgebungsparametern, 4) Bildvorverarbeitung und -analyse nach Abschluss der kinetischen Bilderfassung und 5) Datenexport zur Analyse in anderer Statistiksoftware (Abbildung 1). Intakte PDOs werden in einer 96-Well-Platte als 5-μl-BME-Kuppeln plattiert, die aus einem vordefinierten Verhältnis von BME und Organoid-Nährmedien (typischerweise 1:1) bestehen. Das hier vorgestellte Protokoll verwendet UltiMatrix als BME aufgrund der minimalen Variabilität von Charge zu Charge und der überlegenen optischen Eigenschaften für die Bildgebung. Modifikationen für die Ernte von g.U., die in anderen BMEs wie Matrigel kultiviert wurden, sowie für Modelle, die klumpig und schwer zu dissoziieren sind, können erforderlich sein (siehe Beispiele Ergänzende Abbildung 4). Als nächstes werden Fluoreszenzfarbstoffe zum Zeitpunkt der Beschichtung (Tag -1) in einer 2-fachen Konzentration in einem Volumen von 100 μl zu den Organoid-Nährmedien gegeben und über Nacht inkubiert, um den Zelltod zu bestimmen. Am folgenden Tag (Tag 0) werden Medikamente oder andere Behandlungen in einer 2-fachen Konzentration in einem Volumen von 100 μl zu Organoid-Nährmedien gegeben und dann für ein Endvolumen von 200 μl in jede Vertiefung gegeben. Das Endvolumen von 200 μl reduziert den Meniskuseffekt bei der Bildgebung. Kinetische Bilder werden mit dem Cytation 5 Plattenleser in Verbindung mit dem BioSpa-Tischinkubator aufgenommen. Der BioSpa-Inkubator ermöglicht die Inkubation von Versuchsplatten bei einer festen Temperatur von 37 °C und 5 % CO_{2 -} Umgebung. Bis zu 8 Platten können im BioSpa gelagert werden und somit können 8 Experimente gleichzeitig durchgeführt werden. Die Bildgebungsparameter für jede Platte werden in der Gen5-Software mit dem "Imager Manual Mode" eingerichtet und als Protokoll gespeichert. Das Protokoll wird dann in die Planungssoftware (BioSpa OnDemand) geladen. Die BioSpa OnDemand-Software automatisiert den Workflow für die kinetische Bildaufnahme, einschließlich der physischen Übertragung der Platte aus dem BioSpa-Inkubator in Cytation 5 und der Vorgabe, welches Protokoll in Gen5 für die Datenerfassung ausgeführt werden soll. Die Bilder werden mit der Zellularanalysefunktion in der Gen5-Software analysiert (Abbildung 2). Wir beschreiben spezifische Methoden zur Analyse von Z-Projektionen von Fluoreszenz- und Hellfeldbildern. Spezifische Methoden zur Analyse einzelner Z-Ebenen und/oder nur Hellfeldbilder sind in der Zusatzdatei 1 enthalten. Schließlich können Benutzer spezifische Datenmerkmale wie PDO-Fläche, Anzahl und mittlere Fluoreszenzintensität definieren, um sie als Excel-Tabelle für die anschließende statistische Analyse von Arzneimittelwirkungen zu exportieren.

Da PDO-Modelle ein relativ neues Modellsystem zur Untersuchung von Arzneimittelwirkungen sind, sind Methoden zur Anpassung an die Kulturbedingungen, insbesondere das Wachstum der BME, noch im Entstehen begriffen¹⁶. Der Großteil der Studien, die das Ansprechen von PDO auf eine medikamentöse Behandlung untersuchen, stützt sich auf ATP-basierte Endpunkt-Assays als Ersatz für die Zellgesundheit (CellTiter-Glo 3D). Diese Methode erfordert eine Zelllyse und schließt somit nachgelagerte Analysen aus. Alternative Endpunkt-Assays wie Fluoreszenzfärbung, Single-Timepoint-Bildgebung und morphologisches Tracking haben andere Metriken zur Charakterisierung des Arzneimittelansprechens bereitgestellt und gleichzeitig die Verwendung von Proben für zusätzliche Zwecke ermöglicht. Beispielsweise wurden In-Plate-Endpunktfixierungsprotokolle für die Hochdurchsatzanalyse von Arzneimittelwirkungen angewendet ^17,18. Ein Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie die umfangreiche Verarbeitung umgeht, die in der typischen Immunhistochemie und Immunfluoreszenzbildgebung^{erforderlich ist 19} und besonders nützlich ist, wenn die Probe begrenzt ist, wie dies bei PDO-Modellen der Fall ist. Es ist auch für hochauflösende Bildgebung mit konfokaler Mikroskopie geeignet. Ein weiterer Endpunkt-Assay, der keine Zelllyse erfordert, ist die Lebendzellbildgebung mit Reagenzien wie Propidiumiodid oder Acridinorange. Unsere vergleichende Analyse von CellTiter-Glo 3D und AOPI, wobei letzteres keine Zelllyse erfordert, zur Beurteilung der Zellviabilität und des Zelltods (Abbildung 6C) unterstreicht die Vorteile der Verwendung von Lebendzell-Imaging-Farbstoffen in PDO-Modellen. Diese Methode wurde von mehreren Gruppen, einschließlich unserer, angewendet, um phänotypische Effekte am Ende eines Experiments zu bewerten 18,19,20. Die kinetische Datenerfassung mit den Methoden der In-Well-Fixierung oder der Endpunkt-Lebendzell-Bildgebung erfordert jedoch eine erhebliche Probe. Die markierungsfreie morphologische Beurteilung von PDOs im Laufe der Zeit überwindet diese Einschränkung teilweise und kann mit einer Vielzahl von Bildgebungsmodalitäten beurteilt werden 8,10,17,18, doch Veränderungen in der Morphologie sind möglicherweise nicht repräsentativ für das Spektrum potenzieller Arzneimittelwirkungen wie Apoptose und Veränderungen der Zellviabilität. Wir haben eine signifikante Modell-zu-Modell-Variabilität bei morphologischen Veränderungen als Reaktion auf Medikamente beobachtet. Zum Beispiel nehmen einige PDOs während der Apoptose an Fläche zu, während andere Modelle schrumpfen können. Kinetische morphologische Bewertungen wurden in einer begrenzten Anzahl von Studien entweder mit fixierten oder lebenden Fluoreszenz-Endpunkt-Assays gemultiplext^18,20. Die hier vorgestellten Verfahren gehören zu den ersten, die verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe multiplexen, um gleichzeitig mehrere zelluläre Effekte in einem Hochdurchsatzsystem zu bewerten.

Eine der größten Verbesserungen der kinetischen Lebendzellbildgebung besteht darin, dass sie die wichtigsten Einschränkungen im Zusammenhang mit Endpunkt-Assays überwindet. Beispielsweise ist es technisch schwierig, eine gleiche Anzahl von PDOs pro Well zu plattieren, da die meisten automatisierten Zellzähler für Objekte mit einer Größe von weniger als 60 μm ausgelegt sind. Die Lebendzell-Bildgebung ermöglicht eine Normalisierung auf die PDO-Anzahl oder -Fläche zum Zeitpunkt 0 h in jedem Well, die dann verwendet werden kann, um Schwankungen in der Beschichtung zwischen den Wells auszugleichen. Der Goldstandard-Endpunkt-Assay für PDOs ist das CellTiter-Glo 3D-Kit, das ATP als Surrogat für die Zellviabilität misst. Wir haben diesen Assay ausgiebig in unseren Studien zu gynäkologischen und Prostatakrebs-PDOs^verwendet 13,21,22,23,24. Medikamente und andere therapeutische Modalitäten erfordern nicht nur eine Zelllyse für ATP-Messungen, sondern können auch den ATP-Spiegel verändern, was möglicherweise zu einer ungenauen Beurteilung des therapeutischen Ansprechens führt. Die Verwendung von Lebendzell-Imaging-Farbstoffen ermöglicht die Quantifizierung eines breiteren Spektrums spezifischer zellulärer Reaktionen wie Apoptose und Zytotoxizität. Wichtig ist, dass diese Reagenzien die Lebensfähigkeit der Zellen nicht stören oder DNA-Schäden verursachen, wie es bei Propidiumiodid der Fall ist. Dies ermöglicht eine wiederholte Beurteilung des PDO-Ansprechens im Laufe der Zeit. Obwohl wir die Verwendung von Acridinorange (AO) für kinetische Messungen nicht untersucht haben, sollte der Wirkmechanismus für AO eine solche Anwendung in Zukunft nicht ausschließen.

Tumore bestehen aus mehreren unterschiedlichen Zellpopulationen mit unterschiedlichen genomischen Profilen und Morphologien. Aufgrund der komplexen Heterogenität von PDO-Modellen können die individuellen PDO-Antworten variieren, und die Verfolgung dieser Reaktionen ist eine Herausforderung. Unser Protokoll bietet eine Methode zur Bewertung mehrerer PDO-Antwortmetriken auf Well-by-Well-Basis. Für die Bildgebung lebender Zellen gelten jedoch immer noch bestimmte technische Überlegungen. Die Anzahl der Wells einer 24-Well-Platte, die für die Aussaat einer 96-Well-Platte benötigt wird, hängt von der Dichte und Wachstumsrate jedes PDO-Modells ab. Da Verklumpungen die Bildanalyse beeinträchtigen können (Ergänzende Abbildung 4), benötigen PDO-Modelle möglicherweise zusätzliche Verarbeitungsschritte vor dem Plattieren. Bei Bedarf können PDOs während der Verarbeitung durch kräftiges Pipettieren mit einer p200-Spitze ohne breite Bohrung mechanisch geschert werden. Der enzymatische Aufschluss mit TrypLE Express kann auch vor dem Plattieren angewendet werden, um die PDO-Dissoziation und die Verringerung der Verklumpung zu fördern. Nach unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass die Dauer der TrypLE-Inkubation je nach Modell sehr unterschiedlich ist. Daher sollte die TrypLE-Inkubation für jedes Modell optimiert werden, insbesondere wenn Forscher Einzelzellsuspensionen erhalten möchten. Bei PDO-Modellen, die besonders empfindlich auf enzymatischen Verdau reagieren, kann eine Erholungszeit vor Beginn der Behandlung erforderlich sein.

Wir stellen Methoden für spezifische Reagenzien für die Bildgebung lebender Zellen vor. Eine Einschränkung in der breiten Anwendbarkeit der hier vorgestellten Verfahren ist ein Mangel an Reagenzien, die mit BME kompatibel sind. Bei anderen Farbstoffen/Reagenzien, die noch nicht für die Verwendung in PDOs optimiert wurden, kann eine zusätzliche Fehlerbehebung erforderlich sein, um die optimale Konzentration zu bestimmen und Lösungsmitteleffekte zu minimieren. Abhängig von der interessierenden Messwert (z. B. Apoptose oder Zytotoxizität) sollte die Behandlung mit einer Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den Zelltod induziert, wie Staurosporin oder Daunorubicin¹³ , verwendet werden, um die Reagenzbedingungen zu optimieren. Eine weitere Überlegung ist der optimale Zeitpunkt für die Farbstoffintegration in die BME-Kuppel. In unseren Experimenten führen wir vor der Behandlung eine Inkubation über Nacht durch, um eine vollständige Aufnahme des Farbstoffs in die Kuppeln zu ermöglichen und die Zellgesundheit zu bestimmen. Da die Signalintensität mit der Zeit zunimmt, sollten Forscher Pilotstudien mit den Farbstoffen durchführen, um die ideale Belichtungszeit am Ende des Experiments zu bestimmen und überbelichtete Bilder zu vermeiden. Schließlich sollten Reagenzien die zellulären Prozesse nicht beeinträchtigen. Zum Beispiel sind Farbstoffe, die in DNA interkalieren, nicht mit kinetischer Bildgebung kompatibel. Die Lebendzell-Bildgebung kann jedoch zur Datennormalisierung in Endpunkt-Assays verwendet werden. In der Tat stellen wir eine ergänzende Methode zur Quantifizierung der Zellviabilität und des Verhältnisses von Lebensfähigkeit zu toten Zellen unter Verwendung von AOPI vor. In diesem Experiment wird das Fluoreszenzsignal für jedes Well auf die PDO-Zahl normalisiert, die durch Lebendzellbildgebung am Tag 0 (Tag der Behandlung, Abbildung 6) bestimmt wird.

Eine weitere Einschränkung dieses Methodenpapiers ist die Abhängigkeit von manuellem Pipettieren für Experimente, was zu einer größeren Varianz bei technischen Replikationen führen kann. Weitere Verbesserungen der Datenreproduzierbarkeit können durch die Automatisierung anderer Schritte des experimentellen Prozesses erreicht werden, wie z. B. die Verwendung eines automatisierten Liquid Handlers für die Beschichtung und Medikamentenabgabe, wie andere gezeigt haben ^8,10. Diese Ergänzung erfordert jedoch zusätzliche Investitionen in die Forschungsinfrastruktur, die möglicherweise nicht allen Forschern zur Verfügung steht. Angesichts der Heterogenität der PDO-Fläche für jedes Modell ist die Normalisierung der Ergebnisse auf die anfängliche PDO-Zahl oder -Fläche zum Zeitpunkt 0 h immer noch ein nützlicher Ansatz mit automatisiertem Seeding.

Ein wesentlicher Vorteil von Cytation 5 gegenüber anderen Lebendzell-Bildgebungsplattformen ist die Möglichkeit, Bild- und Analysefunktionen anzupassen. Die Cytation 5/Gen5-Software hat jedoch eine steile Lernkurve und setzt voraus, dass die Benutzer über grundlegende Kenntnisse der Bildgebung verfügen. Eines der Ziele dieses Methodenpapiers ist es, Schritt-für-Schritt-Anleitungen bereitzustellen, um die Barriere für andere Forscher zu verringern, anspruchsvolle Bildgebungstechniken für lebende Zellen in ihre PDO-Forschungsprogramme zu integrieren. Während die hier vorgestellten spezifischen Analyseschritte für ein System gelten, können Benutzer die Multiplexing-Prinzipien auf andere Plattformen anwenden, mit dem Verständnis, dass die nachgelagerte Analyse die Verwendung von Software von Drittanbietern wie NIH ImageJ erfordern kann.

Analysemetriken sollten sowohl auf der Grundlage der experimentellen Ziele als auch der Beschichtungsbedingungen ausgewählt werden. Wenn das Experiment beispielsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff durchgeführt wird, um den Zelltod zu quantifizieren, ist die Fluoreszenzintensität eine effektive Auslesung. Die effektivste Fluoreszenzmetrik (Gesamtfluoreszenz vs. mittlere Objektintensität) hängt von den Beschichtungsbedingungen ab (Ergänzende Abbildung 4). Wenn PDOs gleichmäßig verteilt sind und eine kreisförmigere, zusammenhängende Morphologie aufweisen, kann die Fluoreszenz in einer definierten PDO-Subpopulation bestimmt werden. Die spezifische Funktion in der Gen5-Software ist die zelluläre Analyse, und die Ausgabe ist die mittlere Objektintensität. Wenn das PDO-Modell jedoch klumpig ist oder eine diskohesive Morphologie aufweist, empfehlen wir, das Fluoreszenzsignal auf Bildebene zu quantifizieren; Diese Funktion finden Sie unter Bildstatistik, und die Ausgabe ist Gesamtfluoreszenzintensität. Während diese Methode nützlich ist, um Änderungen auf der Ebene der einzelnen Wells zu beobachten, ist diese Metrik nicht spezifisch für Objekte von Interesse und könnte sich fälschlicherweise ändern, wenn sich die PDOs während der Dauer des Experiments außerhalb des festgelegten Stopfens bewegen. In Szenarien, in denen es signifikante Trümmer oder tote Einzelzellen gibt, wird die Verwendung der Zellanalyse empfohlen, um jedes Fluoreszenzsignal auszuschalten, das nicht spezifisch mit einem PDO assoziiert ist. Ein Beispiel für differentielle Ergebnisse unter Verwendung von Zellanalyse vs. Bildstatistik ist in der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt.

Um den optimalen Schwellenwert für die Bildstatistikfunktion zu bestimmen, kann das Linienwerkzeug verwendet werden. Mit dem Linienwerkzeug können Benutzer den Bereich der Fluoreszenzintensität innerhalb eines Bildes bestimmen. Wir legen den unteren Schwellenwert als 25%-Wert der Spitzenintensität innerhalb des Bildes fest. Um die fluoreszierenden Bereiche anzuzeigen, die im festgelegten Schwellenwert enthalten sind, aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Schwellenwertausreißer". Möglicherweise ist eine zusätzliche Feinabstimmung des unteren Schwellenwerts erforderlich.

Eine große Herausforderung bei der Bildgebung lebender Zellen besteht darin, die riesigen Datenmengen zu speichern, die bei jedem Experiment generiert werden. Dies ist besonders relevant im Fall von PDO-Kulturen, bei denen Z-Stacks verwendet werden, um über mehrere Fokusebenen hinweg abzubilden und eine Z-Projektion zu erzeugen. Es gibt mehrere Methoden, um dieses Problem zu lösen. Stellen Sie zunächst eine ausreichende Lagerkapazität sicher. Wir haben drei Solid-State-Festplatten mit insgesamt 17 TB verbaut. Weitere Optionen sind die Übertragung experimenteller Dateien auf externe Festplatten oder Netzwerkspeicher. Es wird nicht empfohlen, Dateien direkt in Cloud-basierten Speicher zu schreiben. Um Daten zu analysieren, die auf einem externen Laufwerk gespeichert wurden, übertragen Sie einfach das Experiment und die Bilddateien auf einen Computer, der mit Gen5-Software ausgestattet ist (HINWEIS: Die Übertragung großer Dateien kann längere Zeit in Anspruch nehmen). Vor der Analyse müssen die Bilder erneut mit dem Experiment verknüpft werden. Öffnen Sie die Testdatei, klicken Sie in der Symbolleiste auf Protokoll, und wählen Sie Protokolloptionen aus. Klicken Sie auf Optionen zum Speichern von Bildern und dann auf Neuen Bildordner auswählen. Suchen Sie die Bilddatei und klicken Sie auf Ordner auswählen, um sie erneut zu verknüpfen.

Abhängig von den Zielen des Experiments kann es auch geeignet sein, die Binning-Funktion innerhalb von Gen5 zu verwenden. Binning verringert die Dateigröße, indem die Anzahl der Pixel verringert wird, was zu einer geringeren Bildauflösung führt (siehe Schritt 3.5.3.2). Daher wird das Binning nicht empfohlen, wenn hochauflösende Bilder erforderlich sind. Wenn Sie die Binning-Funktion verwenden, müssen die Belichtungseinstellungen angepasst werden. Sobald die experimentelle Datei erstellt wurde, doppelklicken Sie auf den Bildabschnitt und klicken Sie auf das Mikroskopsymbol, um den manuellen Imager-Modus erneut zu öffnen. Verwenden Sie die Auto-Belichtungsfunktion oder passen Sie die Belichtung nach Bedarf manuell an.

Zusammenfassend stellen wir Methoden zur Beurteilung der Apoptose und Zellgesundheit von PDOs als Reaktion auf zytotoxische Wirkstoffe vor. Zukünftige Studien sind notwendig, um Methoden zu optimieren und zusätzliche Analysestrategien für die kinetische Bildgebung von PDOs zu entwickeln, wie z. B. andere Phänotypen und Wirkungen von Arzneimitteln, die zytostatisch und nicht zytotoxisch sind. Ein großes Hindernis ist die kommerzielle Verfügbarkeit von Farbstoffen und Reagenzien, die mit BME kompatibel sind. Es ist noch mehr Arbeit erforderlich, um besser zu verstehen, wie die kinetische Lebendzellbildgebung vollständig genutzt werden kann, um die meisten Daten aus diesen Modellen zu extrahieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL konisches Zentrifugenröhrchen	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED	Cube Agilent	1225012
96-Well-Platte	Corning Costar	3596	Vorgewärmt auf 37 & Grad; C
96-Well-Platte	Agilent	204626-100	Vorgewärmt auf 37 μd; C
A83-01	Tocris	2939	Die Endkonzentration beträgt 500 nM (Bestandteil des Organoid-Nährmediums)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	Bestandteil des Organoid-Nährmediums
B27 Supplement	Gibco	17504044	Die Endkonzentration beträgt 1x (Bestandteil des Organoid-Nährmediums)
BioTek BioSpa 8 Automatisierter Inkubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tisch-Inkubator; Die BioSpa OnDemand-Planungssoftware kommuniziert mit Gen5, um Platten zwischen dem BioSpa und dem Cytation 5 für die Bildgebung zu übertragen (dieses Protokoll verwendet Version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Platten-Reader; Für dieses Gerät wird Gen5-Software verwendet (dieses Protokoll verwendet Version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basalmembran-Extrakt	R& D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	rekonstituiert in DMSO
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0,5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Endkonzentration beträgt 10 & Mikro; M (Bestandteil von Organoid-Nährmedien)
Glutamax	Gibco	35050-061	Endkonzentration beträgt 1x (Bestandteil von Organoid-Nährmedien)
HEPES	Gibco	15630-080	Endkonzentration beträgt 10 mM (Bestandteil von Organoid-Kulturmedien)
EGF, tierversuchsfreies rekombinantes Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Endkonzentration beträgt 0,5 ng/ml (Bestandteil von Organoid-Kulturmedien)
Humanes FGF-10 Rekombinantes Protein	Gibco	100-26-1MG	Endkonzentration beträgt 10 ng/ml (Bestandteil von Organoid-Kulturmedien)
Rekombinantes Protein von humanem R-Spondin 1	Gibco	120-38-5UG	Die Endkonzentration beträgt 250 ng/ml (Bestandteil von Organoid-Kulturmedien)
Hydrocortison Stammlösung	StemCell Technologies	7926	Die Endkonzentration beträgt 500 ng/ml (Bestandteil von Organoid-Kulturmedien)
Imaging-Filterwürfel - GFP	Agilent	1225101
Imaging-Filterwürfel - TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Injektozyten Annexin V Roter Farbstoff	Sartorius	4641	Rekonstituiert in Organoid-Nährmedien
Inkubozyten-Cytotox Grünfarbstoff	Sartorius	4633	DMSO-Lösung
N-Acetyl-L-cystein	Sigma-Aldrich	A7250	Die Endkonzentration beträgt 1,25 mM (Bestandteil des Organoid-Kulturmediums)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Färbelösung	Fisher-Scientific	13366169	Hinzufügen eines Volumens von 1:50
Nicotinamid	Sigma-Aldrich	N0636	Die Endkonzentration beträgt 10 mM (Bestandteil eines Organoid-Kulturmediums)
Noggin	R& D Systems	6057-NG	Die Endkonzentration beträgt 100 ng/ml (Bestandteil des Organoid-Nährmediums)
Penicillin-Streptomycin	Gibco 15140122		Die Endkonzentration beträgt 10 Einheiten/ml (Bestandteil des Organoid-Kulturmediums)
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Die Endkonzentration beträgt 100 & Mikro; g/ml (Bestandteil von organoiden Nährmedien)
Rekombinantes humanes Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Die Endkonzentration beträgt 37,5 ng/ml (Bestandteil von organoiden Nährmedien)
Staurosporinlösung aus Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Die Endkonzentration beträgt 5 & Mikro; M (Bestandteil des Organoid-Nährmediums)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Die Endkonzentration beträgt 100 nM (Bestandteil des Organoid-Kulturmediums)