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Methodenartikel

Immunmetabolische Schaltkreise in der Infektion zur Weiterentwicklung wirtsgerichteter Therapien

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DOI:

10.3791/66980

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13. September 2024

 , 
1Systems Medicine Laboratory, Biotechnology Research and Innovation Council - National Centre for Cell Science (BRIC-NCCS)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für das Design, die Konstruktion und die Bereitstellung eines tetracyclingesteuerten induzierbaren synthetischen Schaltkreises vorgestellt. Die Wirkung der synthetischen Schaltkreise auf die Parasiteneliminierung und die Zytokinexpression kann durch Kanalisierung der vorgestellten Pipeline untersucht werden. Dieses Protokoll ist relevant für Forscher, die synthetische Schaltkreise bei Infektionskrankheiten untersuchen.

Zusammenfassung

Der Immunstoffwechsel ist eine zentrale Determinante für das Fortschreiten der Leishmaniose. Der auf synthetischer Biologie basierende Ansatz hat als Schritt hin zu therapeutischen Interventionen, die auf wirtsassoziierte Faktoren abzielen, die Leishmaniose verursachen, große Aufmerksamkeit erregt. Die Synthetische Biologie befasst sich mit der orthogonalen und modularen Entwicklung genetischer Komponenten, um biologische Systeme präzise zu modulieren und Zellen neue Funktionen zu verleihen. In der vorliegenden Studie wurde die Aufklärung einer systematischen Pipeline für die Entwicklung eines induzierbaren Tetracyclin-kontrollierten (TetON)-basierten synthetischen Schaltkreises zum Ziel gesetzt, Succinatdehydrogenase als Therapeutikum zu liefern, um die Eliminierung intrazellulärer Leishmania-Parasiten zu erleichtern. Das skizzierte Protokoll beschreibt den Entwurf einer synthetischen Schaltung und deren anschließende Validierung. Die vorgeschlagene Strategie konzentriert sich auch auf den Einbau von synthetischen Schaltkreisen in das Plasmid-Rückgrat als Transportvehikel. Darüber hinaus wurden Verabreichungsmaschinen mit Polyplex-basierten Nanopartikeln für die Verabreichung synthetischer Schaltkreise in murinen Makrophagen-Zelllinien eingesetzt, ohne die zelluläre Morphologie zu beeinträchtigen. Es wurde eine Standardisierung der Methode zur Selektion transfizierter Zellen und zur Bestimmung der optimalen Induktionskonzentration für die Expression synthetischer Schaltkreise durchgeführt. Beobachtungen zeigen eine deutliche Verringerung der intrazellulären Parasitenlast in transfizierten Zellen im Vergleich zu infizierten Zellen. Proinflammatorische Zytokine wurden nach der Infektion in einem synthetischen Schaltkreis exprimiert, transfiziert und induzierte Zellen als Mechanismus zur Förderung der Parasiteneliminierung. Dies unterstreicht die auf synthetischer Biologie basierende Methode als wirksamen Ansatz bei Leishmaniose, indem sie auf Wirtsfaktoren abzielt, die mit dem Fortschreiten der Krankheit verbunden sind.

Einleitung

Die Weiterentwicklung der ganzheitlichen, integrativen Medizin ist ein bedeutender Zusammenhang, der zwischen metabolischen Veränderungen in Immunzellen und ihrer Fähigkeit, den Immunzellphänotyp bei Infektionskrankheiten zu modulieren, identifiziert wurde. Der Immunstoffwechsel bietet neue Perspektiven für die Aufklärung der Pathogenese der beim Menschen weit verbreiteten Infektionskrankheiten. Darüber hinaus bietet sie vielversprechende Techniken für die Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten, indem sie neue Ziele für Interventionen identifiziert1. Die metabolische Reprogrammierung von Immunzellen wird bei verschiedenen Infektionskrankheiten, einschließlich Leishmaniose, festgestellt. Leishmania spp. ist verantwortlich für die Entstehung von Leishmaniose, von der Leishmania major (L. major) kutane Leishmaniose (CL) verursacht. L. Hauptparasiten haben einen signifikanten Einfluss auf den Stoffwechsel von Wirtszellen, insbesondere in Makrophagen, für die Proliferation und das Überleben als intrazelluläre Parasiten2. Makrophagen können typischerweise in entweder klassisch aktivierte (M1) oder alternativ aktivierte (M2) Untergruppen polarisieren, wobei M1-Zellen eine hohe proinflammatorische Zytokinsekretion und Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) durch den Metabolismus von Stickstoffspezies besitzen. M2-Zellen weisen erhöhte Spiegel an entzündungshemmenden Zytokinen auf und weisen eine hohe Arginase-Aktivität durch den Stickstoffstoffwechselauf 3. Beide Phänotypen unterscheiden sich also nicht nur durch ihre Immunantwort, sondern auch in ihren Stoffwechselwegen.

Die Systembiologie der Leishmaniose zielt darauf ab, molekulare Ziele für die Entwicklung neuartiger Therapeutika durch Wirkstoffdesign und -entwicklung zu identifizieren. Die Rekonstruktion von Signalnetzwerken und Stoffwechselwegen hilft dabei, Leishmaniose als ganzheitliches Modell zu verstehen und Erkenntnisse zur Identifizierung der Hauptkomponente zu gewinnen, die den erkrankten Zustand antreibt. Die mathematische Modellierung ist einer der beliebtesten angewandten analytischen Ansätze zum Verständnis der Komplexität von Leishmaniose4. Immunmetabolische Netzwerke und mathematische Modelle ermöglichten die Identifizierung der Succinatdehydrogenase (SDHA) als Schlüsselkomponente des M1-Phänotyps, der exprimiert wird, um den Parasitenzu eliminieren 5. Die Synthetische Biologie findet Anwendung in der Diagnostik, der Impfstoffentwicklung und in der Therapie bei Leishmaniose. Der Stoffwechsel, der auf die Modulation der Immunantwort abzielt, kann durch Werkzeuge der synthetischen Biologie erreicht werden. Zur Modulation der Inositolphosphoryl-Ceramid-Synthase, die den Sphingolipidstoffwechsel reguliert und die Immunsignalisierung des Wirts verändert, wurde ein genetischer Schaltkreis mit bistabilem Verhalten verwendet, um die intrinsische Robustheit des L. major-Infektionsmodellssynthetisch einzustellen 6,7. Die Systembiologie und die Synthetische Biologie können somit eine modellbasierte gentechnische Plattform für die Entwicklung der Präzisionsmedizin im Leishmania-Modellsystem bieten.

Der M1-Phänotyp ist durch die Expression von immunmetabolischen Signalnetzwerken gekennzeichnet, bei denen die Produktion von inflammatorischen Zytokinen und Stoffwechselwegen die Parasiteneliminierung synergistisch verbessert. Die M1-Polarisation bedeutet die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wie Interleukin-12 (IL-12), Interferon-gamma (IFN-γ) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α). Zu den Stoffwechselwegen, die im M1-Phänotyp stark angereichert sind, gehören die Glykolyse, der Pentosephosphat-Weg und der verkürzte Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus)5. Der verkürzte TCA-Zyklus steuert die Parasiteneliminierungsmaschinerie durch erhöhte Succinat- und Citratwerte, die die Produktion von NO3 steuern. Die Akkumulation von Succinat durch SDHA führt zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors Hypoxie-induzierbarer Faktor 1-alpha (HIF-1α), der die Produktion von IL-1β8 induziert. Im M2-Phänotyp werden die Oxidation von Fettsäuren, eine Erhöhung der Glutaminverwertung und eine verstärkte oxidative Phosphorylierung von Glukose zusammen mit der Produktion von entzündungshemmenden Zytokinen wie Interleukin-10 (IL-10), dem transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGF-β), Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13)3 beobachtet. M2 weist längliche Mitochondrien als charakteristisches Merkmal auf, was zu einer erhöhten Effizienz bei der Energieerzeugung führt. Sie verwenden Fettsäuren, Glukose und Glutamin als Substrate, um den TCA-Zyklus anzutreiben, und erzeugen dadurch ATP durch oxidative Phosphorylierung mit einer höheren Rate, um das Wachstum und die Proliferation von Parasiten zu fördern9. Das SDHA-Enzym, das für die Succinatakkumulation durch verkürztes TCA verantwortlich ist, kann nicht nur die NO-Produktion fördern, sondern auch einen succinatabhängigen Sauerstoffverbrauch durch den Elektronentransport initiieren10. In Leishmania-infizierten Makrophagen wird SDHA um das 2,17-fache herunterreguliert, was darauf hindeutet, dass auch die aerobe Atmung herunterreguliert sein könnte11. Um den Succinatkonsum zu erhöhen, um eine entzündungsfördernde Zytokin-vermittelte NO-Produktion zu induzieren und die Parasiteneliminierung zu fördern, ist die Expression von SDHA unerlässlich.

Der synthetische Schaltkreis bietet präzisionsgerichtete Therapien, die das erkrankte System verändern können, um eine bistabile Oszillation zu erreichen, die einen gesunden Phänotyp auf raumzeitlicher Ebene wiederherstellen kann. Die synthetische Schaltung und der Ausdruck machen das System dynamisch und robust. Ein entscheidender Faktor, der zur Weiterentwicklung der synthetischen Biologie beiträgt, liegt in der Fähigkeit, genetische Teile und Elemente modular zusammenzusetzen, um die Generierung komplexer Architekturen und maßgeschneiderter Funktionalitäten zu ermöglichen12. Einschränkungen, die mit traditionellen Expressionstechniken verbunden sind, haben die Entstehung von Tetracyclin-Operon-basierten induzierbaren Plasmid-Syntheseschaltkreisen vorangetrieben, die eine schnelle Bewertung des Plasmids und eine einfache Verabreichung über verschiedene Zelltypen hinweg ermöglichen13. Das Tetracyclin-responsiver Repressor (TetR)-Protein zeigt, wenn es als Dimer vorliegt, eine starke Bindungsaffinität zum Tet-Operon (TetO), wodurch die Transkription effektiv unterdrückt wird. Bei der Wechselwirkung seines Liganden, Doxycyclin (dox), erfährt TetR jedoch eine strukturelle Veränderung, die zu seiner Dissoziation von TetO führt, wodurch die Transkription ungehindert ablaufen kann. Dieser Schaltkreis kann eine Proteintranslationskontrolleaufweisen 14. Daher wurde durch die definierte Methodik der entworfene Tetracyclin-Operon-basierte induzierbare Plasmidsynthesekreislauf in die Lage versetzt, SDHA im pEGFP-N1-Vektor zu exprimieren. Die Bewertung der Transformationseffizienz der Schaltung und ihrer Ausbeute gab Aufschluss über die Kompetenz der Lieferung. Durch den Restriktionsverdau des Vektors konnte die Bestimmung der Klonierungseffizienz bestätigt werden. Des Weiteren wurde eine transfizierte RAW264.7-Maus-Makrophagen-Zelllinie, die von Peritonealmakrophagen von Balb/c-Mäusen abgeleitet wurde, für die Doxycyclin-dosisabhängige Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in transfizierten Zellen beobachtet. Zusätzlich wurde der Effekt der Parasiteneliminierung in transfizierten Zellen durch eine Expression des synthetischen Schaltkreises bestätigt. Darüber hinaus wurde eine Induktion und Expression von proinflammatorischen Zytokinen beobachtet, die durch eine Erhöhung des Infektionszeitpunkts in den transfizierten und induzierten Zellen des synthetischen Schaltkreises gesteuert wurde, was direkt mit der Funktion des synthetischen Schaltkreises verbunden war.

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Protokoll

1. Zellkultur von RAW264.7-Zellen

HINWEIS: Verwenden Sie niedrige Durchgangszahlen zum Experimentieren. Die RAW264.7-Zelllinie wurde vom National Cell Repository des Biotechnology Research Innovation Council-National Centre for cell Sciences (BRIC-NCCS) in Pune beschafft. Da es sich bei der RAW264.7-Zelllinie um eine Makrophagen-Zelllinie handelt, kann es vorkommen, dass sie sich mit zunehmenden Passagen zu differenzieren beginnt. Nach der Wiederbelebung der Zellen wird die Zelllinie nach 2 Passagen zur Transfektion verwendet.

  1. Keimen Sie 5 x 105 Zellen der RAW264.7-Zelllinie in einem 25cm 2-Kolben, ergänzt mit 5 mL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 100 I.E./ml Penicillin als vollständiges Medium.
  2. Die Zellen werden für Wachstum und Proliferation in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C aufbewahrt, bis eine Konfluenz von 90 % erreicht ist.
  3. Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie es 3x mit 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS). Geben Sie 1 ml PBS in den Kolben, kratzen Sie die Zellen mit einem Schaber ab und sammeln Sie die Zellen in einem 1,5-ml-Röhrchen.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei 24 °C und resuspendieren Sie das Pellet mit einer 1 mL-Pipette in 1 mL DMEM-Komplettmedium.
  5. Zählen Sie die Zellen in der Zellzählkammer mit 0,5 % Trypanblau, um den Prozentsatz der lebenden Zellen zu bestimmen.

2. Zellkultur des Parasiten L. major

HINWEIS: L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) war ein Geschenk von BRIC-NCCS. Promastigoten sollten eine Durchgangsnummer kleiner als 10 haben. Die niedrigere Passagezahl stellt sicher, dass der Parasit gesund ist und seine Fähigkeit, Makrophagen zu infizieren, höher ist.

  1. Züchten Sie L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) in Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), ergänzt mit 20% FBS als vollständiges Medium.
  2. Saatgut 1 x 106 Promastigoten in einem unbelüfteten 25cm 2 Kolben mit 5 ml vollständigem Medium. Inkubieren Sie den Kolben 5 Tage lang bei 27 °C und beobachten Sie den Parasiten Promastigote L. major in der stationären Phase bei 20x in einem Hellfeldmikroskop.
    HINWEIS: Promastigoten in der stationären Phase können innerhalb von 4-7 Tagen nach der Kultivierung erreicht werden. Sie zeichnen sich durch ihren länglichen, geißelförmigen Zustand und ihre verminderte Beweglichkeit aus.

3. Entwerfen eines synthetischen Schaltkreises in Plasmid als Verabreichungsvektor

  2. Identifizierung genetischer Bestandteile aus dem iGEM-Teileregister
    1. Öffnen Sie das Register der biologischen Normteile (Materialtabelle) und klicken Sie auf Suchen. Geben Sie den Namen der genetischen Komponente ein, z. B. CMV-Promotor.
      HINWEIS: Der Prozess zur Suche nach der iGEM-ID muss für alle genetischen Komponenten des synthetischen Schaltkreises durchgeführt werden. Die Schritte zur Identifizierung der iGEM-ID des CMV-Promotors sind aufgeführt; Anschließend müssen die Schritte für andere Komponenten wiederholt werden.
    2. Um die Nukleotidsequenz des CMV-Promotors zu erhalten, klicken Sie auf die Option Teilesequenz abrufen und speichern Sie die Datei als Textdatei.
      HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass Bestände aller genetischen Teile verfügbar sind.
    3. Die Schritte 3.2.1 und 3.2.2 sind für alle genetischen Teile (Tetracyclin-Operator, Kozak-Sequenz, TetR, P2A und GFP) mit Ausnahme von SDHA zu wiederholen.
    4. Um die proteinkodierende Sequenz von SDHA zu erhalten, öffnen Sie NCBI und wählen Sie Nukleotid aus der Dropdown-Liste neben dem Suchfenster aus. Geben Sie Succinat-Dehydrogenase und Mus musculus ein und suchen Sie nach der Nukleotidsequenz.
    5. Klicken Sie auf die Option CDS, um die Codierungssequenz von SDHA abzurufen und die Sequenz in einer Textdatei zu speichern.
    6. Führen Sie die Nukleotidsequenz aller genetischen regulatorischen Teile nacheinander in einer Datei zusammen. Fügen Sie das Startcodon (ATG) direkt nach der Kozak-Sequenz hinzu und entfernen Sie die internen Stoppcodons, um die Bildung naszierender Polypeptide zu vermeiden.
    7. Öffnen Sie die ExPASy-Website15 und fügen Sie die Nukleotidsequenz ein. Klicken Sie auf die Option Sequenz übersetzen . Wählen Sie 5'3' Frame 1 und entfernen Sie die Stoppcodons, die im Ergebnisbereich rot hervorgehoben werden.
      HINWEIS: Um festzustellen, ob die Nukleotidsequenz effektiv in die gewünschte Polypeptidsequenz übersetzt wird, kann ein Translationswerkzeug wie ExPASy verwendet werden. Dies gewährleistet die Vermeidung unerwünschter naszierender Polypeptide. Die Auswahl des pEGFP-N1-Vektors für die Expression des synthetischen Schaltkreises ist optimal, da der CMV-Promotor und das GFP-Gen innerhalb des Vektors bereits vorhanden waren. Alle genetischen Teile wurden unter Verwendung eines Klonierungsprotokolls (das ausgelagert wurde) zusammengesetzt. Die Restriktionsenzyme, die für die Klonierung der Inserts verwendet werden, sind NotI und XhoI. Diese Restriktionsenzymstellen befinden sich innerhalb der multiplen Klonierungsstelle des pEGFP-N1-Vektors.

4. Transformation des synthetischen Schaltkreises in Escherichia coli (E.coli) DH5α-Zellen

  1. Aufbereitung von E.coli DH5α-kompetenten Zellen
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Reagenzien autoklavieren. Reagenzien können bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert werden.
    1. 1 ml frisches Inokulum in 50 ml Luria-Bouillon (LB) bei 37 °C, 180 U/min kultivieren. Züchten Sie die Zellen für ca. 2 Stunden, bis eine optische Dichte (OD) von 0,4-0,6 bei 600 nm erreicht ist.
    2. Die Zellen bei 4.696 x g bei 4 °C 15 min zentrifugieren. Der Überstand wird manuell in den Verwerfkolben verworfen, indem das 50-ml-Zentrifugenröhrchen umgedreht und das Zellpellet entnommen wird.
    3. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 2 mL eiskaltem 0,1 M Magnesiumchlorid (MgCl2) mit einer 1 mL Pipette. Füllen Sie das Volumen mit eiskaltem MgCl 2 auf bis zu 20mL auf.
    4. Das Röhrchen bei 4.696 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette in 1 ml eiskaltem 0,1 M Calciumchlorid (CaCl2) und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang auf Eis. Nutzen Sie die frisch hergestellten kompetenten Zellen für die Transformation.
  2. Transformation kompetenter Zellen mit synthetischem Schaltungskonstrukt
    1. Messen Sie 50 μl kompetente Zellen und geben Sie die Zellen in ein 1,5 ml-Röhrchen. Lege das Rohr auf Eis. Geben Sie 10 ng synthetisches Schaltungskonstrukt zum Aliquot und halten Sie es 3 Minuten lang auf Eis.
    2. Hitzeschockzellen bei 42 °C für 3 min auf einem trockenen Heizblock. Sobald die Inkubation auf dem Trockenheizblock abgeschlossen ist, legen Sie die Zellen wieder für 3 Minuten auf Eis, geben Sie 1 ml LB zu den Zellen und inkubieren Sie bei 37 °C für 1 h bei 250 U/min.
    3. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 4.696 x g bei Raumtemperatur (RT) und verwerfen Sie den Überstand mit einer 1-ml-Pipette. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl LB und plattieren Sie es auf LB-Agar, der 50 μg/ml Kanamycin enthält. Die Platte umdrehen und 24 h bei 37 °C inkubieren.

5. Isolierung des Konstrukts eines synthetischen Schaltkreises

  1. Nehmen Sie in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen 10 ml LB-Medium und fügen Sie 50 μg/ml Kanamycin als Auswahlbrühe hinzu, um transformierte Zellen für die Plasmidisolierung zu kultivieren. Nehmen Sie eine transformierte Kolonie mit einer 200-μl-Spitze auf und geben Sie sie in die Auswahlbrühe.
  2. Mit einer Impfschlaufe wird eine andere einzelne Kolonie ausgewählt, eine Platte mit der fünfeckigen Technik gestreift und 24 h lang bei 37 °C inkubiert, um die Einzelkolonieisolate zu erhalten.
  3. Züchten Sie die Zellen über Nacht bei 180 U/min bei 37 °C. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Kultur bei 4.696 x g für 20 min bei 24 °C. Nach der Zentrifugation verwerfen Sie den Überstand, indem Sie das Röhrchen umdrehen, und geben Sie 1 ml Resuspensionspuffer (50 mM Tris (Hydroxymethyl) aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 100 μg/ ml RNase A (pH-8,0)) zum Pellet und resuspendieren Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren.
    HINWEIS: Um den Resuspensionspuffer zu resuspendieren, fügen Sie RNase A 5 Minuten hinzu, bevor Sie die Mischung zum Zellpellet hinzufügen.
  4. Inkubieren Sie die Mischung 5 Minuten lang bei RT. Geben Sie 1 ml Lysepuffer (0,2 N Natriumhydroxid (NaOH), 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS)) in die Zellen und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen 2 Minuten lang umdrehen. Inkubieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei RT.
  5. Geben Sie 1 ml Neutralisationspuffer (3 M Kaliumacetat (CH3CO2K)) in die Zellen und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 4.696 x g für 20 min bei RT und sammeln Sie den Überstand in einem 1,5-ml-Röhrchen.
  6. 500 μl Isopropanol in den Überstand geben und durch Invertieren gut mischen. Den Überstand 15 min auf Eis inkubieren und anschließend bei 12.000 x g 30 min bei 4 °C zentrifugieren.
    HINWEIS: Die Inkubation kann zwischen 5 Minuten und 1 Stunde dauern. Dabei wird empfohlen, den Inhalt vorsichtig zu mischen, indem Sie alle 5 Minuten umdrehen.
  7. Den Überstand verwerfen, 1 ml 70%iges Ethanol (gekühlt) zum Pellet geben und bei 12000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
  8. Trocknen Sie das Pellet an der Luft und resuspendieren Sie das erhaltene Plasmid in 20 μl sterilem nukleasefreiem Wasser (NFW). Messen Sie die Plasmidkonzentration mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260/280 nm.
    HINWEIS: Fügen Sie mehr NFW hinzu, wenn die Plasmidkonzentration sehr hoch ist, um durch Nanodrop geschätzt zu werden. Der Prozess der Plasmidverdünnung muss in einer laminaren Haube durchgeführt werden.

6. Agarose-Gelelektrophorese (AGE) des synthetischen Schaltkreises

  1. Vorbereitung der Plasmidprobe für AGE
    1. Messen Sie in einem 1,5-ml-Röhrchen 20 μl 1x Tris-Acetat-EDTA (TAE). 4 μl 6x Ladepuffer zugeben und durch Pipettieren gut mischen.
    2. Drehen Sie das Röhrchen kurz, fügen Sie 1 μg des Plasmidvektors des synthetischen Schaltkreises hinzu und mischen Sie es gut, indem Sie die Mischung pipettieren. Dieses Reaktionsgemisch kann auf Agarosegel geladen werden.
      HINWEIS: Vermeiden Sie rigoroses Pipettieren, da dies die Plasmidstruktur beschädigen kann. Drehen Sie sich stattdessen schnell beim Mischen der Reagenzien.
  2. Restriktionsaufschluss des Synthesekreislaufs
    1. In ein 1,5-ml-Röhrchen 2 μl 10x Restriktionspuffer, 1 μl NotI und 1 μl XhoI-Restriktionsenzym geben und gut mischen, indem der Inhalt kurz geschleudert wird. Fügen Sie 1 μg Plasmidvektor des synthetischen Schaltkreises hinzu und drehen Sie den Inhalt kurz.
    2. Erhöhen Sie das Volumen des Röhrchens auf 20 μl, indem Sie dem Inhalt NFW hinzufügen und das Röhrchen kurz drehen. Inkubieren Sie das Röhrchen 1 h lang bei 37 °C.
    3. Halten Sie das Röhrchen nach der Inkubation 15 Minuten lang bei 70 °C in einem trockenen Heizblock, um die Restriktionsenzyme zu deaktivieren. Kühlen Sie den Inhalt des Röhrchens ab und geben Sie 6 μl Ladepuffer in das Reaktionsgemisch. Mischen Sie den Inhalt, indem Sie die Tube kurz drehen. Dieses Reaktionsgemisch kann auf Agarosegel geladen werden.
    4. Richten Sie das Agarose-Gel ein und führen Sie das Gel unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Protokolls16 aus. Laden Sie kurz gesagt 20 μl Proben in jede Vertiefung, laden Sie 5 μl 1 Kb DNA-Leiter und lassen Sie das Gel bei 100 V laufen. Trennen Sie die Stromversorgung, nachdem die Elektrophorese abgeschlossen ist, erfassen Sie das Gel auf einem Gel-Imager und aktivieren Sie die Fluoreszenzoption, um die Banden anzuzeigen.

7. Transfektion eines synthetischen Schaltkreiskonstrukts in der RAW264.7-Zelllinie

  1. Vorbereitung der Proben
    1. Bereiten Sie Proben vor, um die parasiteneliminierende Wirkung durch induzierten Synthesekreislauf zu bestimmen. Die erste Probe besteht aus nicht transfizierten RAW264.7-Zellen (Kontrolle), die zweite sind RAW264.7-Zellen, die 6 h lang mit L. major-Promastigoten infiziert waren (6 h infiziert), die dritte Probe waren RAW264.7-Zellen, die mit einem synthetischen Schaltkreis transfiziert und mit Dox (IMT) induziert wurden, die Proben zum Infektionszeitpunkt sind RAW264.7-Zellen, die mit einem synthetischen Schaltkreis transfiziert und mit Dox induziert wurden, das mit L. major infiziert ist Promastigoten (IMTI) für verschiedene Zeitpunkte 6 h (6 h IMTI), 12 h (12 h IMTI), 18 h (18 h IMTI) und 24 h (24 h IMTI).
    2. Um alle Proben vorzubereiten, kratzen Sie die RAW264.7-Zellen aus einem 25cm 2 Kolben ab und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 5 min bei RT.
    3. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL DMEM-Komplettmedium. Nehmen Sie 10 μl der resuspendierten Zellen in ein 100 μl Röhrchen, geben Sie 10 μl 0,5% Trypanblau zu den Zellen und mischen Sie gut.
    4. Laden Sie 10 μl Zell- und Trypanblau-Mischung auf den Objektträger der Zellzählkammer und entnehmen Sie die Zellzahl aus 4 Kammern.
    5. Plattenzellen im Deckglasboden, 96-Well-Platten mit 2 x 10,4 Zellen pro Well und inkubieren Sie die Zellen für 24 h. Bei dieser Stichprobe handelt es sich um die Kontrollstichprobe. Dieser Schritt bleibt für die Vorbereitung anderer Proben konstant.
      HINWEIS: Erwärmen Sie das Medium vor der Verwendung auf 37 °C in einem Wasserbad.
    6. Zur Vorbereitung einer 6 h langen infizierten Probe zentrifugieren Sie 1 ml stationäre Phase L. major Promastigoten bei 7.273 x g für 10 min. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl DMEM-Komplettmedium und nehmen Sie die Zellzahl in einer Zellzählkammer vor, indem Sie die Schritte 7.1.3-7.1.4 befolgen.
    7. Geben Sie 2 x 105L. major Promastigoten in die Vertiefung und inkubieren Sie sie mit 5% CO2 bei 37 °C für 6 h. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation 3x mit PBS.
    8. Um die IMT-Probe vorzubereiten, säen Sie die Zellen aus, indem Sie die Schritte (7.1.2-7.1.5) befolgen und die Transfektionsschritte 7.2.1-7.2.6 durchführen.
    9. Um Proben von Zeitpunkten von IMTI vorzubereiten, befolgen Sie die Schritte 7.1.2-7.1.5 und führen Sie die Transfektionsschritte 7.2.1-7.2.6 durch. Entsorgen Sie das DMEM-Komplettmedium mit 500 μg/ml Geneticin (G418) und 1 μg/μl dox und waschen Sie die Zellen 3x mit 1x PBS.
    10. Geben Sie 2 x 105L. major Promastigoten in die Vertiefungen und inkubieren Sie sie für 6 h, 12 h, 18 h und 24 h. Nach der Infektion die Promastigoten, die DMEM-Komplettmedien enthalten, entsorgen und die Vertiefungen 3x mit 1x PBS waschen. Geben Sie 200 μl DMEM-Komplettmedium mit 500 μg/ml Geneticin (G418) und 1 μg/μl dox in die Zellen und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang.
  2. Transfektion eines synthetischen Schaltkreises
    1. Geben Sie in ein 1,5-ml-Röhrchen 24 μl Reduced Serum Medium, das ein verbessertes Minimal Essential Medium ist. Geben Sie 1 μg pEGFP-N1-Vektor, der mit einem Plasmid des synthetischen Schaltkreises kloniert wurde, auf das Medium.
    2. In ein frisches 1,5-ml-Röhrchen 24 μl Minimal Essential Medium geben und 1 μl Polyethylenimin (PEI; 1 μg /μl) hinzufügen. Mischen Sie gut, indem Sie die Mischung mindestens 10x pipettieren und 5 Minuten lang bei RT inkubieren.
    3. Übertragen Sie die PEI-Mischung in das 1,5-ml-Röhrchen mit der DNA-Mischung. Gut mischen, indem Sie mindestens 10x tropfenweise pipettieren. Inkubieren Sie die DNA: PEI-Mischung 10 Minuten lang bei RT.
    4. Entsorgen Sie das Medium aus den Vertiefungen auf den 96-Well-Deckglas-Bodenplatten und waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. Geben Sie mit einer Pipette das DNA:PEI vorsichtig tropfenweise in die Zellen und schütteln Sie die Platte vorsichtig. Inkubieren Sie die Zellen mit 5% CO2 bei 37 °C für 3 h.
    5. Nach der Inkubation geben Sie 200 μl frisches Minimal Essential Medium in die Zellen, schütteln Sie die Platte vorsichtig und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang mit 5 % CO2 bei 37 °C.
      HINWEIS: PEI ist zytotoxisch; Daher wird empfohlen, die Zellen nach der Transfektion nicht länger als 24 Stunden zu inkubieren.
    6. Am nächsten Tag entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen 2x mit PBS. Geben Sie DMEM-Komplettmedium mit 500 μg/ml Geneticin (G418) und 1 μg/μl dox in die Zellen und inkubieren Sie es 24 Stunden lang.
  3. Fixieren der Proben für die konfokale Mikroskopie
    1. Um alle Proben zu fixieren, waschen Sie die Zellen mit 1x PBS 3x, geben Sie 100 μl 4% Paraformaldehyd zu den Zellen und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT.
    2. Waschen Sie die Zellen mit PBS 3x. Nach Abschluss des Waschvorgangs 1 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in die Zellen geben und 15 Minuten im Dunkeln bei RT inkubieren.
    3. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation 3x mit PBS. Beobachten Sie die Zellen unter einem konfokalen Mikroskop auf GFP-Expression und DAPI-Färbung.

8. Gewinnung transfizierter Zellen durch konfokale Mikroskopie und Quantifizierung

  1. Reinigen Sie den Deckglasboden der Vertiefungen mit saugfähigem Tuch. Schalten Sie die Bedienelemente des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops ein. Schalten Sie als Nächstes den Kompressor und die Quecksilberlampe ein.
  2. Um das Gerät bedienen zu können, müssen die Mikroskopsteuerung, die Scankopfsteuerung, die Lasertaste, das Lasermodul, die Lampe, der Mikroskopcontroller und die CPU nacheinander eingeschaltet werden.
  3. Öffnen Sie auf dem Computer die Software (Table of Materials) und klicken Sie auf Enable XY Stage Control. Es öffnet sich ein Pop-up-Fenster, in dem Sie aufgefordert werden, die Reinigung für 7S3 auszuführen. Klicken Sie auf Nein. Schließen Sie das Live-Diagramm und passen Sie die Einstellungsbildschirme an.
  4. Fügen Sie dem 60-fach-Objektiv einen Tropfen Immersionsöl hinzu, platzieren Sie die Bodenplatte der 96-Well-Platte auf dem Tisch und bewegen Sie den Tisch in der X-Y-Ebene, um die Position des Objektivs auf dem Bohrloch anzupassen. Klicken Sie auf das Okular und wählen Sie Alexa-488-Kanal. Klicken Sie auf Shutter Off , um die Zellen auf dem Okular zu fokussieren. Justieren Sie das Okular nach Kern und Feinfokussierung.
  5. Klicken Sie auf Shutter On present auf dem Mikroskop-Schaltkasten und bewegen Sie das Objektiv, um seine Position anzupassen und den interessierenden Bereich zu fokussieren, um die Zellen im differentiellen Interferenzkontrast (DIC) zu beobachten. Wechseln Sie in den EPI-Modus an der Mikroskop-Steuerbox, um die Zellen im Alexa-488-Wellenlängenfilter für die GFP-Expression zu beobachten. Die Zellen sollten grün erscheinen.
  6. Klicken Sie auf Shutter Off, gehen Sie zu LSM imaging und wählen Sie die Auflösung für das Bild als 1.024 x 1.024. Klicken Sie auf Phase hinzufügen und ziehen Sie, um einen grünen Kanal als Phase hinzuzufügen.
  7. Klicken Sie im Olympus-Programm auf LSM und dann auf Live Button , um die Zellen im Phasenkontrast und Alexa 488nm Kanal zu beobachten. Drücken Sie die Strg-Taste und scrollen Sie, um die Zellen in der Software zum Aufnehmen von Bildern zu fokussieren.
  8. Passen Sie die Verstärkung und den Offset an, um die vom Detektor erfasste Fluoreszenzintensität anzupassen. Klicken Sie auf Erfassen, benennen Sie die Bilder und klicken Sie auf Speichern.
  9. Klicken Sie in der Imaging-Software auf Datei, wählen Sie alle Bilder mit der Erweiterung .oir aus und klicken Sie auf Öffnen.
  10. Klicken Sie auf Kachelansicht , um Bilder in allen Kanälen zu visualisieren. Um Bildern eine Maßstabsleiste hinzuzufügen, klicken Sie auf Ansicht und wählen Sie dann die Option Maßstabsleiste .
  11. Um Bilder von einzelnen Kanälen als 16-Bit-Graustufen zu speichern, klicken Sie auf Datei und wählen Sie Bild exportieren. Wählen Sie das Bild aus und aktivieren Sie die Teilstriche auf allen Kanälen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Rahmen auswählen" in der Option "Split View" die Option "Ja" aus. Wählen Sie auf der Registerkarte "Ausgabe" die 24-Bit-RGB-Farbe mit der Option "Burn-In-Info" und wählen Sie "tiff " als Dateityp für das Bild aus. Wählen Sie im Ordner "Exportieren nach" den entsprechenden Dateispeicherort aus, um die Bilder zu speichern, und klicken Sie dann auf OK.
  12. Um zusammengeführte Bilder zu speichern, führen Sie die gleichen Schritte aus, außer dass Sie in der Option "Geteilte Ansicht" die Option "Nein" und auf der Registerkarte "Ausgabe" die Option "Zusammengeführte Kanäle mit Brenninformationen" auswählen.
  13. Um die Expression von GFP in Zellen zu analysieren, öffnen Sie Fiji in Windows und exportieren Sie die TIFF-Datei. Wählen Sie die Farbe Grün aus, um den GFP-Ausdruck zu analysieren.
  14. Wählen Sie den Zellbereich mit der Option des Freihandwerkzeugs aus und klicken Sie auf Analysieren , um die Fluoreszenzintensität zu messen. Wiederholen Sie den Vorgang für 3 Bilder.
  15. Exportieren Sie die Daten in eine Analysesoftware und führen Sie statistische Tests mit den quantifizierten Daten durch.

9. Parasitenbelastungstest

  1. Während Sie die Zellen an einem konfokalen Mikroskop visualisieren, zählen Sie die Gesamtzahl der Parasiten, die in einzelnen Makrophagen vorhanden sind.
  2. Untersuchen Sie nach dem Zufallsprinzip 100 Makrophagen und notieren Sie sich die Anzahl der intrazellulären Parasiten. Führt einen statistischen Test zwischen infizierten und Zeitpunkten von IMTI-Proben durch, um den Einfluss der SDHA-Expression auf die Parasitenzahl zu untersuchen.

10. Quantifizierung von IL-10 und IL-12 durch Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)

  1. Bereiten Sie die Proben gemäß den Schritten 7.1 und 7.2 vor und sammeln Sie das Medium in einem 1,5-ml-Röhrchen. Bewahren Sie das Medium bis zur weiteren Verwendung auf Eis auf oder lagern Sie es bei -20 °C. Befolgen Sie die Anweisungen im Handbuch des Benutzerkits und führen Sie ELISA für IL-10 und IL-12 durch.

11. Erstellung von Zytokinprofilen mittels quantitativer real-time reverse-transkription-PCR (qRT-PCR)

  1. Bereiten Sie die Proben gemäß den Schritten 7.1 und 7.2 vor. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette und fügen Sie 500 μl TRIzol-Reagenz hinzu und inkubieren Sie die Zellen 2 Minuten lang bei RT.
    HINWEIS: Die Schritte zur RNA-Isolierung sind als Sicherheitsvorkehrung gegen RNase-Kontamination in einem Laminar-Flow-Schrank durchzuführen.
  2. Sammeln Sie die Proben in einem 1,5-ml-Röhrchen, fügen Sie 100 μl Chloroform hinzu und mischen Sie, indem Sie die Röhrchen 5x-8x umdrehen. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei RT. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 15 Minuten bei 4 °C.
  3. Es werden drei Schichten beobachtet, die klare wässrige Deckschicht wird in einem frischen 1,5 mL Röhrchen gesammelt. Geben Sie 500 μl Isopropanol in die wässrige Schicht, mischen Sie gut, indem Sie 10x invertieren, und inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei RT. Alle 5 Minuten mischen Sie die Proben erneut, indem Sie die Röhrchen umdrehen.
  4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet 2x mit 75 % Ethanol aus 0,1 % Diethylpyrocarbonat (DEPC), das Wasser enthält, für 5 min und zentrifugieren Sie es bei 8.000 x g bei 4 °C.
    HINWEIS: DEPC, das Wasser enthält, baut RNasen ab, daher wird empfohlen, es für die RNA-Isolierung zu verwenden.
  5. Zum Schluss trocknen Sie das Pellet 5 Minuten lang bei RT an der Luft, lösen Sie es in 20 μl DEPC-haltigem Wasser auf und messen Sie die Konzentration der isolierten RNA im Verhältnis 260/280 und 260/230 mit einem Spektralphotometer.
    HINWEIS: Das Verhältnis 260/280 sollte ungefähr 2,0 betragen, was im Allgemeinen auf eine reine Form von RNA hinweist, und das Verhältnis 260/230 sollte zwischen 2,0 und 2,2 liegen, um davon auszugehen, dass die isolierte RNA frei von unerwünschten chemischen Verbindungen wie TRIzol ist.
  6. Für die Vorbereitung von 20 μl jeder cDNA-Probe tauen Sie die Reagenzien auf Eis auf und drehen Sie sie 15 s lang bei RT. Drehen Sie alle Reagenzien und sogar die RNA-Proben vor der Verwendung kurz.
  7. In einem autoklavierten 100-μl-Röhrchen werden 0,8 μl 25x dNTP, 2 μl 10x Primer und 2 μl 10x Puffer entnommen. Fügen Sie eine Konzentration von 1 μg/μl RNA hinzu und fügen Sie 0,5 μl Reverse-Transkriptase-Enzym hinzu. Füllen Sie das Volumen mit DEPC-haltigem Wasser auf 20 μl auf.
  8. Drehen Sie die cDNA-Proben 1 Minute lang kurz bei RT. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.
  9. Schalten Sie den Thermocycler ein, schrauben Sie die obere Platte ab, um den Halter zu lösen, und legen Sie die Proben auf den Block. Nachdem Sie die Proben platziert haben, schrauben Sie den Deckel fest.
  10. Sobald das System eingeschaltet ist, klicken Sie auf Ausführen. Wählen Sie die Option Haupt aus, rufen Sie dann das Menü Programme auf und wählen Sie die Option CDNA aus. Definieren Sie das Probenvolumen als 20 μL und klicken Sie auf RUN. Der Thermocycler führt das Programm in vier Schritten aus. Der erste Schritt beträgt 25 °C für 10 Minuten, der zweite 37 °C für 2 Stunden, der dritte 85 °C für 5 Minuten und der letzte Schritt 4 °C für immer.
  11. Sobald der Zyklus in den vierten Schritt eintritt, klicken Sie auf Enter und beenden Sie den Zyklus. Entnehmen Sie die Proben und fahren Sie mit der qRT-PCR fort. Lagern Sie RNA-Proben bei -80 °C und cDNA-Proben bei -20 °C.
  12. Für den Nachweis von Zytokinen tauen Sie die erforderlichen Reagenzien 2x PCR-Mastermix, cDNA und Sonden für TNF-α, IFN-γ, TGF-β und NFW auf Eis auf.
    HINWEIS: Alle Reagenzien, Reaktionsgemische und Proben müssen auf Eis aufbewahrt werden.
  13. Bereiten Sie in einem 100-μl-Röhrchen eine cDNA-Probe vor, indem Sie 1 μl cDNA und 3,5 μl NFW hinzufügen. Um den Mastermix zuzubereiten, nehmen Sie 5 μl Mastermix und geben Sie 0,5 μl Sonde in ein 100-μl-Röhrchen. Mischen Sie den Inhalt, indem Sie ihn kurz drehen. Berechnen Sie die Anzahl der Proben und Zielgene und bereiten Sie das Reaktionsgemisch entsprechend vor.
    HINWEIS: Geben Sie NFW und Mastermix auf den Boden des 100-μl-Röhrchens. Geben Sie cDNA und Sonde vorsichtshalber an die Wand des Zentrifugenröhrchens, um sicherzustellen, dass das Volumen hinzugefügt wird, und um eine Kreuzvermischung von Reagenz zu vermeiden.
  14. Legen Sie die 8-Well-Streifen in den PCR-Kühler. Übertragen Sie 5,5 μl Mastermix und Sondenfläschchen in den 8-Well-Streifen auf den Boden jeder Vertiefung. Wiederholen Sie den Schritt daher für alle Zielgene.
  15. Übertragen Sie 4,5 μl der cDNA- und NFW-Mischung in 8-Well-Streifen an die Wand der Vertiefung. Wiederholen Sie den Schritt daher für alle Proben.
  16. Verschließen Sie die Streifen mit den Deckeln und drehen Sie sie kurz 10 s, um die Gene und Proben in der Vertiefung zu vermischen. Legen Sie den Streifen in den qRT-PCR-Probenschlitz und schließen Sie den Schlitz.
  17. Starten Sie auf dem Desktop die Software und melden Sie sich als Gast an. Auf dem Bildschirm erscheint ein Pop-up-Fenster. Klicken Sie auf Weiter ohne Verbindung.
  18. Klicken Sie im Setup-Menü auf Erweitertes Setup. Geben Sie in den Experimenteigenschaften den Namen des Experiments auf die Registerkarte Experimentname ein. Für welche Art von Experiment möchten Sie diese Option einrichten, wählen Sie Quantitation-Comparative CT (ΔΔ CT).
  19. In welcher Rampengeschwindigkeit möchten Sie das Gerät verwenden? und klicken Sie auf Schnell (~ 40 Minuten, um einen Lauf abzuschließen). Definieren Sie im Menü zum Einrichten der Platte Gennamen in der Option Ziele definieren und geben Sie die Probennamen in Proben definieren ein.
  20. Geben Sie auf der Registerkarte Laufmethode 10 μl in Reaktionsvolumen pro Vertiefung ein. Klicken Sie kurz vor dem Halten der Phase auf Phase hinzufügen und wählen Sie Phase halten. Ändern Sie die Temperatur auf 50 °C und die Zeit auf 2 min. Nehmen Sie in der zweiten Haltestufe keine Änderungen vor, die 1 s lang 95 °C betragen.
  21. Ändern Sie in der Radphase Schritt 1 die Temperatur auf 95 °C und die Zeit auf 3 s. Ändern Sie in Schritt 2 die Temperatur auf 60 °C und die Zeit auf 30 s. Klicken Sie auf Ausführen , um den qRT-PCR-Zyklus zu starten.

12. Statistische Analyse

HINWEIS: Für alle Daten wird der Mittelwert als Balken dargestellt, und die Standardabweichung stellt den Fehlerbalken in einem Balkendiagramm dar (p-Wert< 0,05 wird als signifikant angesehen).

  1. Öffnen Sie die Datenanalysesoftware und fügen Sie die erhaltenen Daten aus dem konfokalen Experiment ein.
  2. Für die konfokale Mikroskopie wenden Sie die gewöhnliche unidirektionale ANOVA mit dem Tukey-Korrekturtest für den Mehrfachgruppenvergleich für die GFP-Expression an. Betrachten Sie die Daten mit p < 0,05 als statistisch signifikant. Bereiten Sie eine grafische Darstellung der Daten vor, wobei der Mittelwert als Balken und die Standardabweichung als Fehlerbalken dargestellt wird.
  3. Erstellen Sie für den Parasitenlast-Assay ein neues Blatt und geben Sie die Parasitenzahldaten für 100 Makrophagen ein. Wenden Sie eine gewöhnliche One-Way-ANOVA mit Tukey-Korrektur zwischen allen Samples an. Betrachten Sie die Daten mit dem p-Wert< 0,05 als statistisch signifikant.
  4. Führen Sie für ELISA eine bidirektionale ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey durch. Führen Sie für die qRT-PCR eine One-Way-ANOVA mit dem Tukey-Korrekturtest durch.

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Ergebnisse

Die Anordnung der genetischen Teile, die den synthetischen Schaltkreis bilden, um den synthetischen Schaltkreis zu exprimieren, ist in (Abbildung 1A) dargestellt. Die entsprechenden Teile wurden in einem pEGFP-N1-Vektor orthogonal und modular kloniert, was in Abbildung 1B dargestellt ist. Die Simulation des synthetischen Schaltkreises zeigte die oszillatorische Dynamik sowohl in SDHA als auch im Tetracyclin-Repressor. Diese Beobachtung deutet auf ein reziprokes ...

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Diskussion

Die erzielten Ergebnisse unterstreichen die Effizienz der Pipeline, die für das Design und die Implementierung eines synthetischen Kreislaufs kanalisiert wurde. Der Aufbau dieses synthetischen Schaltkreises war ein Schritt zur Entwicklung der Präzisionsmedizin für Infektionskrankheiten wie Leishmaniose. Durch die in silico Assemblierung genetischer Teile und deterministische Simulation wurde die ausgeprägte modulatorische Wirkung des TetON-Systems überwacht. Der Effekt der Schaltung könnte insbesondere zur rezip...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken dem Direktor des Biotechnology Research and Innovation Council - National Centre for Cell Science (BRIC-NCCS) in Pune für die Unterstützung unserer Forschung und der BRIC-NCCS Bioinformatics Facility.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 μ L-SpitzenTarson521050
10X RestriktionspufferBioLabsR0146SRestriktionsaufschluss
1mL-SpitzenTarson521016
1mL-RöhrchenEppendorf30121023
200 μ L-SpitzenTarson521010
25cm2 KolbenCorning430639Für die Zellkultur
4',6-Diamidino-2-phenylindolThermoFischer ScientificD1306Kernfärbung
50mL RöhrchenCorning352070
60mmPlatten Falcon353002
6X TrackIt Cyan/Orange LadepufferThermoFischer Scientific10488085Laden von Proben für AGE
96 Well Deckglas BodenplatteThermoFischer Scientific160376Für die konfokale Bildgebung und Transfektion
96 Well Mikrotestplatte mit flachem Boden WellsTarson941196
AgaroseSigmaA9539Für AGE
Agarose GelelektrophoreseBaugruppe GeNei93Für AGE
Bakterielle laminare StrömungESCO Lifesciences2120765Für die Transformation
CalciumchloridMerckC4901Puffer-/Reagenzienvorbereitung
Laminare Luftströmung für ZellkulturenThermoFischer Scientific1323TSFür Zellkultur
ZellschaberGenetix90020Für Zellkultur
ZellverteilerFischer Scientific12822775
Zentrifuge für 1,5 mL RöhrchenEppendorfEP5404000537
Zentrifuge für 50 mL falconThermoFischer Scientific75004210
ChlorofromFischer Scientific67-66-3Für die RNA-Isolierung
CO2-InkubatorThermoFischer Scientific3110Für Zellkulturküvetten
Eppendorf6138000018Schätzung der Plasmidkonzentration
CYTIVA IQ 500 Gel ImagerCytiva29655893Für AGE
DEPC TREATED H2O 1000 MLThermoFischer Scientific750023Für die RNA-Isolierung
DoxycyclinMerck33429Für die Induktion transfizierter
Zellen Trockener HeizblockLabnetZur Transformation und Inaktivierung von Restriktionsenzymen
Dulbecco's Modified Eagle MediumNationales Zentrum für ZellforschungFür Zellkulturen
EthanolSigma-Aldrich1.00983Puffer / Reagenzienzubereitung
EthidiumbromidSigmaE7637Für AGE
Ethylendiamin TetraessigsäureFischer Scientific12635Puffer / Reagenzienvorbereitung
Evos HellfeldmikroskopThermoFischer ScientificAMEX1000
ExPasyhttps://web.expasy.org/translate/für die Konstruktion eines synthetischen Schaltkreises
Fötales RinderserumGibco16000-044Für Zellkulturen
FV31S-SW SoftwareOlypmusBilderfassung
GeneticinGibco1563411für die Transfektion
Gibson-Assemblierungsmethode für die KlonierungBIOMATIKAufbau eines synthetischen Schaltkreises
Graphpad-PrismaGraphpadStatistische Analyse
Reverse-Transkriptionskit für cDNA mit hoher KapazitätThermoFischer Scientificfür die cDNA-Synthese
IsopropanolFischer Scientific13825Puffer-/Reagenzienvorbereitung
KanamycinSigma60615Für die Transformation und Kolonieauswahl
Luria Bertini BouillonHimediaM1245Für die Kultivierung von E.coli
MagnesiumchloridFischer ScientificBP214Puffer-/Reagenzienvorbereitung
Micro Filt Vertical Laminar Air FlowMicrofilt
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0,1 mLThermoFischer Scientific4358293Für qRT-PCR
MicroAmp Optische 8-Cap StripsThermoFischer Scientific4323032Für qRT-PCR
MikrowellenherdLGMC-7649DWFür AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)ThermoFischer Scientific4331182Taqman Sonden
Mm00443258_m1 (TNF)ThermoFischer Scientific4331182Taqman Sonden
Mm01321739_m1 (TGFB)ThermoFischer Scientific4331182Taqman Sonden
Maus ELISA Kit IL-10ThermoFischer ScientificBMS614Für ELISA
Maus ELISA Kit IL-12ThermoFischer ScientificBMS616für ELISA
Multiskan Sky mit Touchscreen + μ TropfplatteThermoFischer Scientific51119600DPfür ELISA
MX-M Mikrotiterplattenmischer 96-Well-Zellkulturplattenmischer Einstellbar 0-1500 U/min Laborschüttler RührwerkDIAB
Nationales Zentrum für Biotechnologie Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.govfür den Bau eines synthetischen Kreislaufs
Neubauer's KammerMarienfeld superior640010Für die Zellzahl
Nicht belüfteter 25cm2 KolbenCorning353014Für die Kultivierung von Parasiten
NotIBioLabsR3189MRestriktionsenzym
Nukleasefreies WasserBiodesign1QIAReagenzienvorbereitung
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 SoftwareOlypmusBildverarbeitung
Olympus FV 3000OlympusFür die konfokale Bildgebung
OPTI-MEM-MedienGibco31985070Medien für die Transfektion
pEGFP-N1-Vektor, kloniert mit synthetischem SchaltkreisBiomatik
, Penicillin, ThermoFischer, Scientific15070063Für Zellkulturen
: Polyethylenimin,MERCK764965 fürdie Transfektion
, KaliumacetatFischer ScientificYBP364500Puffer-/Reagenzpräparation
KaliumchloridFischer ScientificBP366Puffer-/Reagenzpräparation
Kaliumphosphat MonobasicSigmaP5655Puffer-/Reagenzienvorbereitung
NetzteilBIORAD1645070Für AGE
Register of Standard Biological partshttps://parts.igem.org/Main_Pagefür den Aufbau eines synthetischen Schaltkreises
RNAiso PlusTakara38220090Für die RNA-Isolierung
RNase AThermoFischer Scientific12091021Vorbereitung von Puffern / Reagenzien
Roswell Park Memorial Institute MediumNationales Zentrum für ZellwissenschaftenFür die Kultivierung von Parasiten
Shaker-InkubatorREMICIS 24 plusFür die Kultivierung von E.coli
NatriumchloridQualigensQ27605Puffer / Reagenzienzubereitung
NatriumdodecylsulfatSigma-AldrichL3771Puffer / Reagenzienzubereitung
NatriumhydroxidFischer Scientific15895Puffer / Reagenzpräparat
Natriumphosphat DibasicSigmaS5136Puffer / Reagenz Vorbereitung
SpektralphotometerEppendorfSchätzung der Plasmidkonzentration
Spin winTrason1020
StepOne plus Real Time PCR SystemLife technologies272006777Für qRT-PCR
StepOne Software Version 2.3Life technologiesFür qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), kein AmpErase UNGThermoFischer Scientific4366072
Tinkercell Konstruktion und Simulation von synthetischen Schaltkreisen
TrackIt 1 Kb Plus DNA-LeiterThermoFischer Scientific10488085Für AGE
Tris (Hydroxymethyl) AminomethanhydrochloridHimediaMB029Puffer-/Reagenzienvorbereitung
Tris-Acetat-EDTASERVA42549.1Puffer-/Reagenzienvorbereitung
TrypanblauSigmaT8154Für die Zellzählung
XhoIBioLabsR0146SRestriktionsenzym
4368814 , , ,

Referenzen

  1. Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity. Front Immunol. 12, 661241(2021).
  2. Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R. Immune-metabolic interactions between Leishmania and macrophage host. Curr Opin Microbiol. 63, 231-237 (2021).
  3. Ty, M. C., Loke, P., Alberola, J., Rodriguez, A., Rodriguez-Cortes, A. Immuno-metabolic profile of human macrophages after Leishmania and Trypanosoma cruzi infection. PloS one. 14 (12), e0225588(2019).
  4. Horácio, E. C. A., Hickson, J., Murta, S. M. F., Ruiz, J. C., Nahum, L. A. Perspectives From systems biology to improve knowledge of Leishmania drug resistance. Front Cell Infection Microbiol. 11, 653670(2021).
  5. Khandibharad, S., Singh, S. Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling. Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125(2023).
  6. Mandlik, V., Limbachiya, D., Shinde, S., Mol, M., Singh, S. Synthetic circuit of inositol phosphorylceramide synthase in Leishmania a chemical biology approach. J Chem Biol. 6 (2), 51-62 (2013).
  7. Khandibharad, S., Singh, S. Synthetic biology for combating leishmaniasis. Front Microbiol. 15, 1338749(2024).
  8. Volpedo, G., et al. The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates. Pathogens. 11 (4), 431(2022).
  9. Almeida, F. S., et al. Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization. Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276(2023).
  10. Duarte, M., et al. Leishmania type II dehydrogenase is essential for parasite viability irrespective of the presence of an active complex I. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (42), e2103803118(2021).
  11. Verma, A., et al. Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).
  12. Bolintineanu, D. S., et al. Investigation of changes in tetracycline repressor binding upon mutations in the tetracycline operator. J Chem Eng Data. 59 (10), 3167-3176 (2014).
  13. Yang, J., et al. A synthetic circuit for buffering gene dosage variation between individual mammalian cells. Nat Comm. 12 (1), 4132(2021).
  14. Verbič, A., Praznik, A., Jerala, R. A guide to the design of synthetic gene networks in mammalian cells. FEBS J. 288 (18), 5265-5288 (2021).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  17. Rabhi, I., et al. Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view. PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763(2012).
  18. Renkema, G. H., et al. SDHA mutations causing a multisystem mitochondrial disease: novel mutations and genetic overlap with hereditary tumors. Eur J Human Gene. 23 (2), 202-209 (2015).
  19. Khandibharad, S., Singh, S. Artificial intelligence channelizing protein-peptide interactions pipeline for host-parasite paradigm in IL-10 and IL-12 reciprocity by SHP-1. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (10), 166466(2022).
  20. Khandibharad, S., Singh, S. Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection. Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823(2024).
  21. Costello, A., Badran, A. H. Synthetic biological circuits within an orthogonal central dogma. Trend Biotechnol. 39 (1), 59-71 (2021).
  22. Cooling, M. T., et al. Standard virtual biological parts: a repository of modular modeling components for synthetic biology. Bioinformatics. 26 (7), 925-931 (2010).
  23. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).
  24. Chan, V. W., Dreolini, L. F., Flintoff, K. A., Lloyd, S. J., Mattenley, A. A. The effect of increasing plasmid size on transformation efficiency in Escherichia coli. , (2002).
  25. Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. A plasmid system with tunable copy number. Nat Comm. 13 (1), 3908(2022).
  26. Li, P., He, Y., Zhang, J., Fang, C. Zinc-dependent metalloprotease 1 promotes apoptosis of RAW264.7 macrophages. Chinese J Cell Mol Immunol. 31 (12), 1585-1587 (2015).
  27. Stein, S. C., Falck-Pedersen, E. Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells. J Virol. 86 (8), 4527-4537 (2012).
  28. Cheung, S. T., Shakibakho, S., So, E. Y., Mui, A. L. F. Transfecting RAW264.7 cells with a luciferase reporter gene. J Vis Exp. (100), (2015).
  29. Fus-Kujawa, A., et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Front Bioeng Biotechnol. 9, 701031(2021).
  30. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Curr Gene Ther. 16 (3), 156-167 (2016).
  31. De Boeck, J., Verfaillie, C. Doxycycline inducible overexpression systems: how to induce your gene of interest without inducing misinterpretations. Mol Biol Cell. 32 (17), 1517-1522 (2021).
  32. Wu, L., et al. 5-Methoxyl Aesculetin abrogates lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing MAPK and AP-1 pathways in RAW 264.7 Cells. Int J Mol Sci. 17 (3), 315(2016).
  33. Tomiotto-Pellissier, F., et al. Macrophage polarization in Leishmaniasis: Broadening horizons. Front Immunol. 9, 2529(2018).

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