Methodenartikel

Extraktion und Nachweis von Geosmin und 2-Methylisoborneol in Wasser und Fischen mit Hilfe von sorptiven Extraktionssonden mit hoher Kapazität und GC-MS

DOI:

10.3791/67280

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3. Juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aquaculture Research Institute, University of Maine, 2Markes International Ltd, 3Markes International GmbH, 4USDA-ARS-National Cold Water Marine Aquaculture Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll stellt einen vollautomatischen Arbeitsablauf für die Extraktion von Geosmin und 2-Methylisoborneol aus Wasser und lipidreichem Fischgewebe dar. Die Methode ermöglicht es, diese Moleküle frühzeitig zu erkennen, bevor sie Geruchsschwellen erreichen. Es werden repräsentative Daten aus einer Aquakultur zur Verfügung gestellt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geosmin und 2-Methylisoborneol sind flüchtige organische Verbindungen mikrobiellen Ursprungs, die häufig in rezirkulierenden Aquakultursystemen vorkommen und den darin enthaltenen Fischen selbst in extrem niedrigen Konzentrationen unangenehme Gerüche und Aromen verleihen. Bestehende Analysemethoden für diese Verbindungen in Fischen haben Schwierigkeiten, einen ausreichenden Probendurchsatz zu erreichen, und sind oft nicht automatisiert, was eine umfangreiche praktische Vorbereitung erfordert. Wir haben Methoden zur Analyse von Geosmin und 2-Methylisoborneol aus Wasser- bzw. Fischgeweben entwickelt, wobei eine Metallsonde mit einer sorptiven Extraktionsphase mit hoher Kapazität verwendet wird. Es wurde ein robuster und quantitativer Nachweis sowohl aus Wasser- als auch aus Fischgeweben erreicht, mit minimalen Nachweisgrenzen von 1,2 ng/l für Geosmin und 1,1 ng/l für 2-Methylisoborneol aus Wasser und 18,1 ng/kg bzw. 13,6 ng/kg aus Fischgewebe. Diese Konzentrationen lagen deutlich unter den Nachweisschwellen beim Menschen. Daraus schlossen wir, dass diese Methoden Geosmin und 2-Methylisoborneol nachweisen können, bevor sie für den Menschen wahrnehmbar werden. Im Gegensatz zu anderen sorptiven Extraktionstechniken mit hoher Kapazität, wie z. B. der sorptiven Rührstabextraktion, ist diese Technik vollständig automatisierbar, was den Durchsatz drastisch verbessert und manuelle Handhabungsfehler ausschließt, während das robuste Design der Sonde einen Bruch ausschließt, wie er bei Festphasen-Mikroextraktionsfasern (SPME) üblich ist. Diese Methode eignet sich für die Odormittelüberwachung in allen Wasserqualitätseinstellungen sowie für den Nachweis von Fehlgeschmacksstoffen in festen und halbfesten Matrices.

Einleitung

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Geosmin (GSM) und 2-Methylisoborneol (MIB) kommen natürlicherweise in Wasser und Böden als Nebenprodukte des mikrobiellen Stoffwechsels vor 1,2. Obwohl sie im Allgemeinen nicht gefährlich für die Umwelt oder die menschliche Gesundheit sind, verleihen sie dem Wasser unangenehme "erdige" und "schlammige" Gerüche und Aromen, die selbst bei extrem niedrigen Konzentrationen von nur 10 bzw. 20 ng/L für GSM bzw.MIB 3,4 wahrnehmbar sind. Daher verringert das Vorhandensein dieser Geruchsstoffe die wahrgenommene Qualität des Wassers und ist in den meisten Fällen höchst unerwünscht. In der Binnenschifffahrt verringern Geruchsstoffe die Attraktivität für Besucher und können Beschwerden bei Umweltbehörden hervorrufen5, während Geruchsstoffe im Trinkwasser einen unangenehmen Geruch und Geschmack vermitteln, den die Verbraucher als inakzeptabel empfinden6. In der Tat haben viele Länder gesetzliche Grenzwerte für den Gehalt an Odorstoffen im Trinkwasser festgelegt, wobei China 10 ng/L als maximal zulässige GSM-Konzentrationvorschreibt 7.

Aquakultur-Zirkulationssysteme (RAS) gewinnen in der Aquakulturindustrie als Mittel zur Fischproduktion immer mehr an Bedeutung. Diese Systeme arbeiten an Land und verwenden Wasser kontinuierlich wieder, wodurch die Umweltbelastung reduziert wird, aber eine umfangreiche Filterung des RAS-Wassers ist erforderlich, um optimale Bedingungen für die Fischzucht zu gewährleisten. Bewegungsbett-Biofilter werden aufgrund des Überflusses an Nährstoffen im Fischkot und im nicht gefressenen Futter von Mikroben besiedelt8. Diese Mikroben sind vorteilhaft für die Entfernung von stickstoffhaltigen Abfällen und überschüssigen Nährstoffen; Einige Spezies können jedoch GSM, MIB und andere Geruchsstoffeproduzieren 4. Diese Geruchsstoffe werden dann in das Wasser ausgelaugt und in das Fleisch des Fisches aufgenommen, wo sie unangenehme Geruchs- und Geschmackseigenschaften verleihen können, die die Verbraucher als anstößig empfinden. Die Geruchsgrenzwerte in Fischfleisch sind artabhängig, aber die Werte für Atlantischen Lachs, eine häufige Art in RASs, liegen bei 44 - 500 ng/kg für GSM und >900 ng/kg für MIB4. Daher sollten RAS-Betreiber die GSM- und MIB-Konzentrationen in ihren Systemen regelmäßig überwachen, um sicherzustellen, dass diese nicht problematische Werteerreichen 4. Betroffene Fische können vor der Ernte von geschmacksfremden Verbindungen befreit werden, um die Qualität des Filets wiederherzustellen. Dies ist jedoch ein teurer Prozess, bei dem die Anlage die Wasserzirkulation stoppen und stattdessen 10 bis 14 Tage lang neues Wasser durch das System fließenlassen muss 9. Angesichts der Tatsache, dass GSM und MIB in einer Vielzahl von Branchen ein anhaltendes und wirtschaftlich kostspieliges Problem darstellen, ist es sinnvoll, die Analysemethoden für den Nachweis neu zu bewerten und zu verbessern. Im Idealfall sollten RAS-Betreiber in der Lage sein, sowohl das RAS-Wasser zu überwachen, um steigende GSM- und MIB-Konzentrationen zu erkennen, bevor sie problematisch werden, als auch das Fischgewebe, um festzustellen, ob und in welchem Ausmaß GSM- und MIB-Konzentrationen die Produktqualität beeinträchtigt haben.

Die meisten Methoden zum Nachweis von GSM und MIB verwenden Gaschromatographie (GC) entweder mit einem Massenspektrometer (MS) oder einem Flammenionisationsdetektor (FID) zur Trennung und Detektion, aber die Art und Weise, wie Geruchsstoffe ursprünglich aus der Wassermatrix extrahiert werden, ist sehr unterschiedlich, wobei viele Methoden veröffentlichtwurden 10. Dass eine solche Vielfalt von Methoden erprobt wurde und tatsächlich immer noch routinemäßig angewendet wird, spricht für die Tatsache, dass jede von ihnen erhebliche Nachteile hat. Zu diesen Nachteilen gehören die Anforderung einer großen Probengröße und großer Lösungsmittelmengen wie bei der Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE), eine geringe Empfindlichkeit und Wasserinterferenz wie bei Headspace-basierten Methoden oder umfangreiche Probleme mit Verschleppung und Systemkontamination wie bei Purge and Trap (P und T).

Die sorptive Extraktion umfasst eine Reihe von Extraktionstechniken, bei denen eine feste sorptive Phase verwendet werden kann, um Odorstoffe aus dem Kopfraum über einer Probe oder aus der Probe selbst durch direktes Eintauchen10 zu extrahieren. Diese Techniken sind mit kleineren Probenvolumina als andere Techniken kompatibel, benötigen keine Lösungsmittel und werden in der Regel nicht stark durch Wasserinterferenzen beeinträchtigt. Die gebräuchlichste Form der sorptiven Extraktion, die Festphasen-Mikroextraktion (SPME), verwendet jedoch nur ein kleines Volumen an sorptiven Phasen mit geringer Kapazität für Analyten, was die Extraktionseffizienz einschränkt. Darüber hinaus können die beteiligten spröden Fasern beschädigt oder gebrochen werden11 und Arbeitsabläufe unterbrechen. Die sorptive Rührstab-Extraktion (SBSE) überwindet diese Schwierigkeiten mit einem größeren Phasenvolumen und einer haltbareren Konstruktion, ist aber nicht ohne weiteres automatisierbar und erfordert einen manuellen Transfer von Rührstäben in Proben und von Proben in thermische Desorptionsröhrchen12. Im Zusammenhang mit der routinemäßigen Wassersiebung, bei der ein hoher Durchsatz entscheidend ist, ist dieser Mangel an Automatisierung ein erhebliches Hindernis.

Das Ziel unserer Methode ist es, die oben genannten Methoden in Bezug auf den Probendurchsatz und die sorptive Extraktionskapazität insgesamt zu verbessern. Aus diesem Grund haben wir eine Technik entwickelt, bei der sorptive Extraktionssonden mit hoher Kapazität (HCSE) verwendet werden, die die hohe Analytkapazität und Robustheit von SBSE mit der Phasenauswahl und Automatisierung von SPME für die quantitative Hochdurchsatzanalyse von GSM und MIB kombiniert. Mit einigen Modifikationen kann die Technik sowohl auf Wasserproben als auch auf Proben von homogenisiertem Fischgewebe angewendet werden. Hier beschreiben wir das Protokoll vollständig und präsentieren Validierungsdaten, die zeigen, dass es reproduzierbar, linear und hochempfindlich ist. Obwohl hier Aquakulturproben zu Demonstrationszwecken verwendet werden, eignet sich das Protokoll für die Überwachung von Odorstoffen in einer Vielzahl von Probentypen, einschließlich Gewässern, Böden und verschiedenen Lebensmitteln. Dank der vollständigen Automatisierung ist das Protokoll besonders vorteilhaft, wenn hohe Probenzahlen zu erwarten sind.

Protokoll

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Die Fischproben wurden von Tieren entnommen, die bereits für den menschlichen Verzehr geschlachtet wurden. Daher war keine ethische Freigabe erforderlich.

1. Erstellung der Kalibrierung und der internen Standards

  1. Vorbereitung des Kalibrierstandards
    1. Bereiten Sie die Stammlösung C1 vor, indem Sie 10 μl Geosmin und 2-Methylisoborneol-Lösung (100 μg/ml) in einen 100-ml-Messkolben geben und mit Methanol der LC-MS-Qualität auffüllen. Die resultierende Lösung enthält jeden Analyten mit 10 μg/l (ppb).
    2. Kalibrierstandards werden durch Zugabe der C1-Stammlösung in dem in Tabelle 1 angegebenen Volumen in einen 100-ml-Messkolben und durch Auffüllen des Volumens mit deionisiertem Wasser hergestellt.
    3. Stellen Sie täglich frische Kalibrierstandards her, da diese extrem verderblich sind.
      HINWEIS: Es ist wichtig, diese Stammlösungen jeden Tag frisch zuzubereiten.
  2. Interne Normvorbereitung
    1. Bereiten Sie die Stammlösung (I1) vor, indem Sie 10 mg 2-Isopropyl-3-methoxypyrazin (IPMP) (>98 % rein) in einen 1-l-Messkolben geben, der volumenmäßig mit Methanol der Klasse LC-MS gefüllt ist, so dass eine Brühe von 10 mg/l entsteht.
    2. Pipettieren Sie 100 μl Lösung I1 in einen 100-ml-Messkolben und füllen Sie das Volumen mit deionisiertem Wasser, um Lösung I2 (10 μg/l) zu erhalten. Geben Sie 50 μl in jedes Probengefäß, um eine Endkonzentration von 100 ng/l zu erreichen.

2. Wasseranalytik

  1. Probenvorbereitung
    1. Legen Sie ein 20-ml-Fläschchen für jede zu analysierende Wasserprobe in das Probentablett.
    2. Wiegen Sie mit einer kalibrierten Waage 2,5 g NaCl ab und geben Sie es in jedes 20-ml-Probenfläschchen mit Bördelverschluss.
      HINWEIS: Die Zugabe von Salz verbessert die Übertragung von MIB und Geosmin vom Wasser in den Kopfraum.
    3. Geben Sie mit einer Pipette oder einem Flaschenaufsatzspender 5 ml des Probenwassers in jedes 20-ml-Probenfläschchen mit Bördelverschluss.
    4. Pipettieren Sie 50 μl der internen Standardlösung I2 in jede Probe, jeden Kalibrierstandard und alle QA/QC-Proben, einschließlich Leerproben.
    5. Setzen Sie die Kappe auf das Fläschchen und verschließen Sie es mit einem Bördelwerkzeug für Fläschchen, um den Analytverlust zu minimieren.
    6. Verarbeiten Sie jeweils nur 1-2 Proben und verschließen Sie jedes Fläschchen schnell, sobald es fertig ist, um den Analytverlust flüchtiger Analyten zu minimieren.
  2. Analytextraktion (Wasser)
    1. Setzen Sie das Probentablett auf den Halter des Autosampler-Fachs.
    2. Um eine Instrumentenmethode vorzubereiten, öffnen Sie das Instrumentenprogramm und klicken Sie auf den Methodeneditor.
      1. Erstellen Sie eine neue Methode, indem Sie die folgenden Parameter in den Methodeneditor eingeben (wobei die anderen Parameter auf ihren Standardwerten belassen werden):
      2. Stellen Sie unter "Vorprobenahme" die Rührzeit des Fläschchens auf 10 Minuten ein, damit sich die Analyten vom Wasser in den Kopfraum absetzen können.
      3. Stellen Sie unter "Probenahme" die Inkubationstemperatur auf 65 °C, die Inkubationszeit auf 30 min und die Rührwerksdrehzahl auf 400 U/min ein.
      4. Stellen Sie sicher, dass "HiSorb-Sonde waschen" aktiviert ist. Andernfalls kann die restliche Probenmatrix das System verunreinigen.
      5. Stellen Sie unter "Sondendesorption" die Desorptionszeit auf 15 min und dieD-Absorptionstemperatur auf 270 °C ein.
      6. Stellen Sie in den Trap-Einstellungen die niedrige Temperatur des Traps auf 25 °C und den "Split Flow" auf 8 mL/min ein.
    3. Führen Sie die Autosampler-Methode in Verbindung mit der GC-MS-Methode aus, indem Sie die Start-Taste in jedem der jeweiligen Programme drücken.

3. Analyse des Fischgewebes

  1. Probenvorbereitung
    1. Legen Sie ein 20-ml-Fläschchen für jede zu analysierende Fischprobe in das Probentablett.
    2. Homogenisieren Sie das Fischgewebe mit einer handelsüblichen Küchenmaschine.
    3. Wiegen Sie mit einer kalibrierten Waage 1,00 g homogenisiertes Fischgewebe in jede Durchstechflasche.
    4. Pipettieren Sie 5 ml gesättigte NaCl-Lösung in jedes Fläschchen.
    5. Pipettieren Sie 100 μl der internen Standardlösung I2 in jede Probe, Kalibrierprobe und alle QA/QC-Proben.
    6. Setzen Sie eine Kappe auf das Fläschchen und verschließen Sie es mit dem Bördelwerkzeug des Fläschchens.
    7. Bereiten Sie jeweils nur 1-2 Proben vor, um den Verlust von halbflüchtigen und flüchtigen Verbindungen zu reduzieren.
  2. Analytextraktion (Fisch)
    1. Setzen Sie das Probentablett auf den Halter des Autosampler-Fachs.
    2. Bereiten Sie eine Instrumentenmethode wie folgt vor (lassen Sie die anderen Parameter auf ihren Standardwerten).
      HINWEIS: Die Rührzeit der Fläschchen vor der Probenahme und die Inkubationstemperatur weichen von Abschnitt 2.2.2 ab.
      1. Stellen Sie unter "Vorprobenahme" die Rührzeit des Fläschchens auf 20 Minuten ein.
      2. Stellen Sie unter "Probenahme" die Inkubationstemperatur auf 80 °C, die Inkubationszeit auf 30 min und die Rührwerksdrehzahl auf 400 U/min ein.
      3. Stellen Sie sicher, dass die Option "HiSorb-Sonde waschen" aktiviert ist, da sonst die verbleibende Probenmatrix das System verunreinigen kann.
      4. Stellen Sie unter "Sondendesorption" die Desorptionszeit auf 15 min und die Desorptionstemperatur auf 270 °C ein.
      5. Stellen Sie in den Trap-Einstellungen die niedrige Temperatur der Trap auf 25 °C und den geteilten Durchfluss auf 8 mL/min ein.
        HINWEIS: Hier ist aufgrund der höheren Affinität von MIB und GSM für lipidreiches Fischgewebe im Vergleich zu Wasser ein längerer, heißerer Vorprobenahmeschritt erforderlich.
    3. Führen Sie die Autosampler-Methode in Verbindung mit der GC-MS-Methode aus, indem Sie die Start-Taste in jedem der jeweiligen Programme drücken.

4. Trennung und Detektion mittels GC-MS

  1. Verwenden Sie die gleichen GC-MS-Parameter für Wasser- und Fischgewebemethoden.
  2. Stellen Sie sicher, dass der GC mit einer 5MS-Säule von 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm ausgestattet ist und mit hochreinem Helium-Trägergas versorgt wird. Stellen Sie die Trägerflussrate auf 2 mL/min ein.
  3. Bereiten Sie ein GC-Ofenprogramm wie folgt vor: Eine Anfangstemperatur von 60 °C, gehalten für 3 Minuten, dann eine Temperaturrampe von 10 °C/min auf 100 °C, dann 20 °C/min auf 190 °C, dann 30 °C/min auf 280 °C, mit einer abschließenden Haltezeit von 2 Minuten. Die Gesamtlaufzeit ist auf 16,5 min festgelegt.
  4. Stellen Sie die Transferleitung zwischen GC und MS auf 280 °C und die Ionenquelle und das Vierfache auf 250 °C bzw. 200 °C ein.
  5. Verwenden Sie für die MS-Erkennung im Scan-Modus einen Scanbereich von m/z 50-350.
  6. Für den ausgewählten Ionenüberwachungsbetrieb (SIM) ist die Quantifizierung und Bestätigung von Ionen von m/z 95 bzw. 107 für MIB, m/z 137 und 152 für IPMP und m/z 112 und 55 für GSM zu verwenden.
    HINWEIS: Viele Chromatographie-Softwarepakete verfügen über eine automatische Peakauswahl, es wird jedoch dringend empfohlen, die Peakauswahl manuell auf Fehler zu überprüfen.

Ergebnisse

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Methodenoptimierung

Um sicherzustellen, dass die Methode optimiert ist, wurden verschiedene Experimente durchgeführt, darunter eine Verschleppungsbewertung, eine Optimierung der Sondendesorptionszeit, eine interne Standardbewertung, eine Sondenphasenbewertung, eine Bewertung der Linearität und Wiederholbarkeit sowie die Berechnung der Nachweisgrenze der Methode.

Bewertung des Übertrags

Wir begannen unser Experiment mit einer Sondendesorptionstemperatur von 250 °C. Es wurden Kalibrierstandards erstellt, wie in Tabelle 1 dargestellt. Um die Verschleppung zu bewerten, analysierten wir GSM- und MIB-Standards bei 20 ng/L und fuhren dann fort mit einem Lauf der GC-MS-Parameter, ohne etwas in die Säule zu injizieren (Säulenleer), einer Desorption der Fokussierfalle ohne Übertragung von etwas aus dem Injektor (Trap-Rohling), einer Erwärmung des Injektors ohne Einführen einer Sonde (Injektorrohling), und eine Desorption der Sonde ohne vorherige Probenahme (Sonde blank). Weniger als 1 % Verschleppung wurde in den Spalten Blind, Trap Blank und Injektor-Blank beobachtet, aber im Sonden-Blank lag der Carryover bei 9,35 % bzw. 3,77 % für GSM und MIB (Tabelle 2). Daher stellten wir fest, dass es unter den verwendeten Bedingungen eine signifikante Verschleppung von GSM auf der PDMS-Sonde gab.

Optimierung der Desorptionszeit

Nachdem wir eine Verschleppung auf der PDMS-Sonde festgestellt hatten, versuchten wir, dies durch Anpassung der Desorptionstemperatur der Sonde zu beheben. Es wäre zu erwarten, dass eine höhere Sondendesorptionstemperatur die Geschwindigkeit der Analytdesorption von der Sonde erhöht, so dass die Desorption am Ende der 15-minütigen Sondendesorptionszeit vollständiger wäre. Eine höhere Temperatur kann jedoch auch den Abbau des Analyten fördern und sich somit negativ auf die Empfindlichkeit auswirken. Höhere Temperaturen können auch sorptive Materialien beschädigen, so dass Temperaturen über 280 °C vermieden werden müssen. Die Verschleppung von GSM war bei einer Sondendesorptionstemperatur von 250 °C signifikant, reduzierte sich jedoch erheblich auf deutlich unter die akzeptable Schwelle von 5 %, wenn stattdessen 270 °C verwendet wurden (Abbildung 1). Diese Verbesserung wurde ohne Verlust der Sensitivität erreicht, wobei die für die Erstanalyse erzeugten Peakbereiche bei 270 °C nicht kleiner waren als bei niedrigeren Sondendesorptionstemperaturen (Abbildung 1). Dies deutet darauf hin, dass eine Zunahme des Analytabbaus vernachlässigbar ist.

Verwendung des internen Standards

Die Verbindung 2-Isopropyl-3-methoxypyrozin wurde häufig als interner Standard bei der Detektion von GSM und MIB13 eingesetzt. Wir verglichen die berechneten Konzentrationen von GSM und MIB mit den bekannten Spike-Konzentrationen, sowohl mit als auch ohne interne Standardkorrektur. Die Wiederfindung ohne interne Standardkorrektur war gering, mit berechneten Konzentrationen bei 60 % der bekannten Spike-Konzentrationen (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu fiel die Wiederfindung bei Anwendung der internen Standardkorrektur sehr gut aus und lag bei rund 100 %. Daher haben wir bei allen zukünftigen Analysen eine interne Standardkorrektur vorgenommen.

Phasenauswahl

Bei SPME-Analysen werden PDMS häufig Kohlenstoff-Weitbereichs- (CWR) und/oder Divylbenzol (DVB) zugesetzt, um die Empfindlichkeit zu verbessern, was jedoch die Kosten erhöht. Wir haben versucht, reine PDMS-Sonden mit dreiphasigen (DVB/CWR/PDMS) Sonden zu vergleichen, da das erhöhte Phasenvolumen der Sonde wahrscheinlich die Empfindlichkeit gegenüber SPME-Fasern verbessert. Die Wiederfindungsdaten für PDMS und dreiphasige Sonden (Abbildung 3) zeigen eine weitgehend ähnliche Leistung zwischen den beiden Sondentypen, wobei die Wiederfindungen mit den PDMS-Sonden etwas näher an 100 % liegen. Angesichts der leicht überlegenen Leistung und der reduzierten Kosten führten wir daher alle zukünftigen Analysen mit PDMS-Sonden durch. Es sollte beachtet werden, dass, da die Sonde Analyten aus dem Kopfraum und nicht über direkten Kontakt mit der Probenmatrix sammelt, die Kinetik der GSM/MIB-Partitionierung zum Phasenmaterial sich nicht zwischen Wasser- und Fischproben unterscheiden sollte.

Validierung der Methode

Es wurde eine Kalibrierreihe analysiert, die sechs Konzentrationen von Analyten in Wasser von 1 bis 100 ng/L abdeckte (Abbildung 4). Es wurde eine hervorragende Linearität mit r2 von 0,9999 für GSM und 0,9999 für MIB erreicht. Der Standardfehler der Regression betrug 0,43 bzw. 0,37 für GSM und MIB. Dies deutet darauf hin, dass die Methode für quantitative Analysen über den bewerteten Bereich geeignet ist. Wir bestimmten die Wiederholbarkeit anhand von acht Replikaten von Laborstandards, die GSM und MIB bei 40 ng/L in Wasser enthielten. Die RSD-Werte betrugen 6,3 % für GSM und 4,8 % für MIB, was eine bemerkenswerte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zeigt. Diese Replikate wurden in drei separaten Chargen an verschiedenen Tagen analysiert, was die Präzision der Methode weiter demonstriert. Daher ist HCSE mit GC-MS-Analyse eine quantitative und zuverlässige Methode.

Minimale Nachweisgrenzen (MDL)

Die MDL wurde gemäß dem US-amerikanischen EPA-Protokoll14 unter Verwendung von Proben aus Spike-Wasser (n = 10) oder Spike-Fischproben (n = 11) berechnet. Das Verfahren zur Extraktion und Detektion von GSM und MIB in Wasser ergab Nachweisgrenzen von 1,2 ng/L für GSM und 1,1 ng/L für MIB. Diese MDLs lagen weit unter den Grenzwerten für menschliche Gerüche von etwa 10 bzw. 20 ng/L. Auf diese Weise kann das vorgeschlagene Verfahren die Akkumulation dieser Geruchsmoleküle sicher und quantitativ nachweisen, bevor sie die sensorischen Schwellenwerte des Menschen erreichen. Die Nachweisgrenzen für die Extraktion und den Nachweis von GSM und MIB aus Fischen betragen 18,1 ng/kg für GSM und 13,6 ng/kg für MIB.

Analyse von Wasserproben aus Aquakulturen

Wir analysierten Wasserproben aus sieben rezirkulierenden Aquakultursystemen, wobei jeweils fünf Replikate (System 3) oder drei Replikate (alle anderen Systeme) bewertet wurden. Bis auf eines enthielten alle analysierten rezirkulierenden Aquakultursysteme Geosmin und MIB in Konzentrationen über unserem MDL (Abbildung 5), was auf ein mögliches Problem mit der Wasserqualität hindeutet. Wir stellten jedoch fest, dass MIB in allen Fällen deutlich unter der menschlichen Geruchsschwelle von 20 ng/L lag, während nur ein System die GSM-Geruchsschwelle von 10 ng/L überschritt (System 1, GSM-Konzentration = 12,69 ng/L). Obwohl wir GSM und MIB in System 3 nachgewiesen haben, stellen wir fest, dass die Konzentration für MIB unter unsere berechneten MDLs fällt und daher nicht sicher quantifiziert werden kann. Die Methode zeigte trotz der Verwendung von Wasserproben aus der realen Welt eine beeindruckende Präzision in allen Systemen mit sehr geringen Schwankungen in der berechneten Konzentration zwischen den Replikatproben in jedem System (Abbildung 5).

Analyse von Fischgeweben

Fischgewebe, das reich an Lipiden ist, verleiht einen starken Matrixeffekt, der die Extraktion von GSM und MIB während dieser Methode erschwert. Aus diesem Grund werden subtile Änderungen an der Methode vorgenommen, um die Extraktionseffizienz zu erhöhen, einschließlich einer höheren Inkubationstemperatur (80 °C) und einer längeren Inkubationszeit (20 Minuten) im Vergleich zur Wasserextraktionsmethode. Zuvor wurden Fischgewebe analysiert, um die Hintergrundkonzentrationen GSM und MIB zu bestimmen. Dieselben Proben wurden dann mit einer bekannten Menge an GSM und MIB versetzt und in dreifacher Ausfertigung analysiert, um die prozentuale Wiederfindung und Präzision zu bestimmen (Abbildung 6).

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Abbildung 1: Einfluss der Sondendesorptionstemperatur auf die Verschleppung. (A) Ein Labornormal mit GSM und MIB bei 20 ng/L wurde bei einer von drei Sondendesorptionstemperaturen in dreifacher Ausfertigung mit mittleren Peakbereichen analysiert. Jede Sonde wurde anschließend noch zweimal bei der Anfangstemperatur desorbiert, um die Verschleppung zu bewerten, mit Ergebnissen in (B) (GSM) und (C) (MIB). Der Übertrag wird als Peakfläche in Prozent der anfänglichen Peakfläche ausgedrückt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung über drei Replikate dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Interne Standardnutzung. Vergleich von korrigierten und unkorrigierten Datenwiederherstellungsdaten für analytische Standards bei 15 oder 40 ng/L, wobei die Extraktion nur mit PDMS-Sonden erfolgte. Die Probenkonzentrationen wurden unter Verwendung von IPMP als internem Standard korrigiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

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Abbildung 3: Analyt-Rückgewinnung. Wiederfindungsdaten für analytische Standards von GSM (links) und MIB (rechts) bei 15 ng/L, mit Extraktion mit reinen PDMS- oder dreiphasigen (PDMS, DVB, CWR) Sonden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Analytische Kalibrierkurven. Lineare Regressionen von Kalibrierkurven für GSM (durchgezogene Linie, r2 von 0,9999; S=0,37) und MIB (gestrichelte Linie, r2 von 0,9999; S = 0,37). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 5: Anwendung von Aquakulturwasser. Konzentrationen von (A) GSM und (B) MIB in Wasserproben aus sieben Aquakultursystemen (n ≥ 3 für jedes System). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

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Abbildung 6:  Anwendung von Fischgewebe. Konzentrationen von GSM und MIB aus zwei Fischproben, die mit GSM und MIB (F1 und F2) versetzt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Name der LösungBestand C1 Volumen hinzugefügtGesamtvolumenResultierende Konzentration
Bestand C110ul100 ml10 μg/ml
Cal 110 ULca. 100 ml1 ng/L
Cal 220 ULca. 100 ml2ng/L
Kaliber 550 ULca. 100 ml5 ng/L
Cal 10100 ULca. 100 ml10 ng/l
Cal 20200 ULca. 100 ml20 ng/L
Kaliber 50500 ulca. 100 ml50 ng/L
Kaliber 1001000 ulca. 100 ml100 ng/L
Kaliber 2002000 ul100 ml200 ng/L

Tabelle 1: Kalibrierstandards. Geosmin- und 2-MIB-Standards bestehen alle aus CRM47525 Geosmin- und 2-Methylisoborneol-Lösung (100 μg/ml) in Methanol, die in Methanol zu einer Stammlösung C1 (10 μg/ml) verdünnt wurde.

AnalyseÜbertragungen (%)
GSMMIB
GC-Lauf0.040.08
Trap-Desorption0.090
Einlass-Desorption00
Redesorption der Sonde9.353.77

Tabelle 2: Bewertung der Sondenverschleppung. Verschleppung nach Extraktion, Desorption und GC-MS-Analyse eines Laborstandards mit GSM und MIB bei 20 ng/L und internem Standard-IPMP bei 30 ng/L. Beschreibungen der Analysen sind in Abschnitt 2.2.1 enthalten.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GSM und MIB sind geschmacksfremde Verbindungen, die in einer Vielzahl von Wasserüberwachungsumgebungen vorkommen, und die Nachfrage nach Testkapazitäten ist hoch. Darüber hinaus sind GSM und MIB für den Menschen im Spurenbereich wahrnehmbar. Ein ideales Analysesystem muss daher eine hohe Empfindlichkeit mit einem hohen Durchsatz kombinieren, um große Mengen an qualitativ hochwertigen Daten zu erzeugen. Wir haben in den vorangegangenen Abschnitten gezeigt, dass die Extraktion mit HCSE-Sonden eine Sensitivität bietet, die über das hinausgeht, was erforderlich ist.

Das robuste Design der HCSE-Sonden schließt Brüche aus, ein Problem, das SPME-Arbeitsabläufe unterbrechen kann. Nach der Methodenoptimierung hatten wir keine Schwierigkeiten mit Systemkontamination oder -verschleppung, die bei P- und T-Methoden häufig auftreten. Den größten Beitrag zum hohen Durchsatz dieser Methode leistete jedoch zweifelsohne die eingesetzte Autosampler-Plattform. Mit diesem System wurde die Analyse rund um die Uhr fortgesetzt, wobei manuelle Eingriffe erforderlich waren, um die Proben nur dem Probentablett zuzuführen. Dies steht im Gegensatz zu anderen sorptiven Extraktionsmethoden mit hoher Kapazität, wie z. B. SBSE, die eine manuelle Bedienung erfordern. Während SPME in der Regel vollständig automatisiert ist, ist der Durchsatz insofern begrenzt, als die Inkubation der nächsten Probe in der Regel erst beginnen kann, wenn die vorherige Probe in die GC-Säule injiziert wurde. Unter der Annahme, dass die GC-Zykluszeit kurz ist, kann es daher sein, dass der GC im Leerlauf bleibt, während die nächste Probe die Extraktion abschließt. Mit unserer Methode können mehrere Proben gleichzeitig einer Vorprobenahme und einer Extraktion unterzogen werden, so dass die Ausfallzeiten der GC minimiert werden. So waren wir in der Lage, 1,8 Proben pro Stunde und System zu verarbeiten.

Wir haben MDLs von 1,2 bzw. 1,1 ng/L für GSM bzw. MIB nachgewiesen, die die erforderliche Empfindlichkeit weit übertreffen. Während andere Techniken wie P und T, LLE, SBSE und SPME unter bestimmten Umständen niedrigere MDLs erreichen können11, sind diese Empfindlichkeitssteigerungen von begrenztem praktischem Wert und rechtfertigen nicht den Verlust der oben beschriebenen Vorteile von HCSE-Sonden. Darüber hinaus erfordern einige dieser Techniken große Probenmengen, was zu einem Anstieg des Abfallaufkommens und der Transportkosten führt. Für LLE liegen die Probenvolumina typischerweise im Bereich von 200 - 500 mL 15,16,17, während für SPME, SBSE und P und T typische Werte 10 - 100 mL 18,19,20,21,22 liegen. Eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit wurde mit RSD-Werten von 6,34 % bzw. 4,82 % für GSM und MIB beobachtet. Diese Werte ähneln im Großen und Ganzen denen, die in anderen Methodengefunden wurden 11, und übertreffen insbesondere die RSDs in den veröffentlichten SPME-Methoden23,24. Auch hier wurden unsere niedrigen RSD-Werte mit Probenvolumina von nur 5 ml erreicht, was niedriger ist als bei der überwiegenden Mehrheit der veröffentlichten Extraktionstechniken. Daher sind wir zuversichtlich, dass HCSE-Sonden eine ausreichende Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit sowie eine breite Palette von Vorteilen bieten, die die besten Aspekte aller bekannten Alternativen in einer einzigen, einfachen, vollautomatischen und nachhaltigen Methode vereinen.

Geosmin und 2-Methylisoborneol sind lipophile Verbindungen, was eine Herausforderung für Wissenschaftler darstellt, die versuchen, diese Verbindungen aus dem lipidreichen Gewebe für die Analyse zu extrahieren. Wir haben daher unsere Pre-Sampling-Bedingungen angepasst, indem wir ein längeres und heißeres Pre-Sampling-Verfahren verwendet haben, um mehr Analyten von der Probenmatrix in den Headspace zu treiben. Nachdem wir diese Anpassungen vorgenommen hatten, stellten wir fest, dass die Methode gut für die Analyse von GSM und MIB in Fischgewebe funktionierte. Es ist zu beachten, dass es bei Proben mit einem sehr hohen Lipidgehalt erforderlich sein kann, die Masse der verwendeten Probe zu reduzieren, z. B. auf 0,50 g. Dadurch soll vermieden werden, dass Lipide eine vollständige Abdichtung auf dem Wasser bilden, die verhindert, dass Analyten den Kopfraum erreichen.

Diese Methode nutzt Gleichgewichtsprinzipien, um Analyten aus dem Kopfraum einer Probe zu extrahieren. Obwohl wir hier Wasser- und Fischproben aus Aquakulturen verwenden, glauben wir, dass die Methode für die Odorstoffextraktion aus jeder festen oder flüssigen Matrix anwendbar ist, die homogenisiert und in einem 20-ml-Probengefäß untergebracht werden kann. Beispiele für Anwendungen sind die Überwachung von Gewässern und Böden in der Umwelt, die Prüfung von Trinkwasser und die Prüfung von Lebensmitteln wie Obst und Gemüse oder nicht landwirtschaftlich genutzten Wasserlebewesen. In der Landwirtschaft sind GSM und MIB häufig in feuchten Böden zu finden und können den dort angebauten Pflanzen Fehlaromen verleihen2, daher könnten sowohl Böden als auch Kulturpflanzen mit unserer Methode zur Überwachung des Geruchsgehalts als eine Form der Qualitätskontrolle und/oder zur Diagnose der Quelle von übelriechenden Beschwerden getestet werden. In vielen Umweltgewässern wie Flüssen und Seen kommt es aufgrund von Algenblüten zu saisonalen Spitzen in der Geruchsstoffkonzentration25, und diese Methode bietet ein hochempfindliches Mittel mit hohem Durchsatz, um das Ausmaß dieser Spitzen zu überwachen. Diese Methode eignet sich auch für die akademische Forschung, um beispielsweise die Geschwindigkeit der Odorstoffproduktion durch Mikroorganismenzu messen 26 oder um den Zusammenhang zwischen Odorstoffkonzentrationen in Wasser und in tierischen Gewebenzu untersuchen 27. Andere Forschungsgruppen haben das HCSE-Verfahren verwendet, um aus einer Reihe von Probentypen wie alkoholischen Getränken28, Hammelfleisch29, Olivenöl30, humanen Zellkulturmedien31 und Pistazien32 zu extrahieren. Diese Studien zielten auf andere Analyten ab oder sind nicht-zielgerichtete Profiling-Studien und wurden daher nicht für die Analyse von GSM und MIB optimiert, sondern werden hier vorgestellt, da sie allgemeine Einblicke in die Vorbereitung verschiedener Probentypen für die HCSE-Sondenextraktion bieten.

Während die beschriebene Wassermethode wahrscheinlich mit minimalen Modifikationen auf alle wasser- oder wasserbasierten Proben anwendbar ist, kann die Anwendung auf andere feste oder halbfeste Proben einige matrixspezifische Änderungen bei der Probenvorbereitung (Abschnitt 3.1) und der Analytextraktion (Abschnitt 3.2) erfordern. Obwohl es hier nicht möglich wäre, jedes Sampling-Szenario abzudecken, bieten wir die folgenden Überlegungen an. (1) Feste Proben sollten durch Reiben, Mahlen oder Mischen zu einem feinen Pulver homogenisiert werden, um die Repräsentativität zu gewährleisten und die größtmögliche Oberfläche für den Austritt von Analyten zu schaffen. (2) Bei festen Proben mit niedrigem Lipidgehalt darf keine Zugabe von Wasser oder Salz erforderlich sein, d. h. es kann ausreichen, 1,00 g in ein Fläschchen und einen Verschluss einzuwiegen. Dies ermöglicht einen direkteren Transfer von Analyten von der Probe in den Kopfraum, ohne einen Zwischentransfer von der Probenmatrix auf das zugesetzte Wasser. Dies verringert jedoch die Wirksamkeit des Rührens. Analytiker sollten Experimente durchführen, um die optimale Probenvorbereitungstechnik für ihre Probenmatrix zu bestimmen. (3) Unterschiedliche Matrizen haben unterschiedliche Affinitäten für GSM und MIB. Daher sind unterschiedliche Inkubationstemperaturen erforderlich, um rechtzeitig ein Analytgleichgewicht zu erreichen. Einige Matrizen können jedoch durch Hitze chemisch verändert werden, so dass durch chemische Reaktionen bei hohen Temperaturen Interferenzen erzeugt werden. Auch hier sind Versuche erforderlich, um die optimale Inkubationstemperatur für einen bestimmten Probentyp zu bestimmen (Hinweis: Proben mit einem hohen Feuchtigkeitsgehalt sollten niemals über 90 °C inkubiert werden, um zu vermeiden, dass die Fläschchen durch den Dampfdruck von kochendem Wasser zerbrechen).

Wir haben Methoden zum Nachweis von Geosmin und 2-Methylisoborneol in Wasser und Fischgewebe entwickelt. Tests an Laborstandards bestätigen, dass die Methoden quantitativ und reproduzierbar sind, während die Anwendung auf reale Proben (Wasser aus zirkulierenden Aquakultursystemen, Fischgewebe aus solchen Systemen) auch im Zusammenhang mit komplexen, schmutzigen Proben ihre Leistungsfähigkeit zeigt. Obwohl wir unsere Methoden auf Proben aus Aquakulturen angewendet haben, gehen wir davon aus, dass sie für die GSM- und MIB-Überwachung in einer Vielzahl von Probentypen geeignet sind, einschließlich Wasser und festen oder halbfesten Materialien.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoren dieser Veröffentlichung, die bei Markes International Ltd oder Markes International GmbH angestellt sind, halfen bei Systemschulungen, Systemprotokollen, experimentellen Designs und Schreiben. Um Verzerrungen oder wahrgenommene Verzerrungen in unserer Forschung zu vermeiden, wurden alle Laboruntersuchungen und Datenanalysen an der University of Maine unter der direkten Aufsicht des United States Department of Agriculture-Agriculture Research Service (USDA-ARS) und des Aquaculture Research Institute der University of Maine durchgeführt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken dem Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten, dem Agricultural Research Service (USDA-ARS) für die Finanzierung für den Erwerb der verwendeten Geräte und die weitere Finanzierung, um all diese Forschungen abzuschließen. Wir möchten uns auch bei Dr. Heather Hamlin, Dr. Amalia Harrington, Dr. Deborah Bouchard, Dr. Sarah Turner, Gareth Dobson, Cameron Coulombe und Abriah James für ihre Hilfe und Unterstützung während dieser Forschung bedanken.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5-10uL PipetteNichipet AirA21405581
1000uL PipettenspitzenVWR76322-154
100-1000uL Pipetteeppendorf285612
100mL GlaskolbenVWR76008-704
10-100uL PipetteNichipet AirA20814031
10-100uL Pipettenspitzenmega24502-18
10xL PipettenspitzenVWR76322-132
20mL GlasbecherVWR10754-698
2-Isopropyl-3-methoxypyrazinTCII0577Interner Standard
40 ml Bernstein Typ-1 (Borosilikat) GlasfläschchenUmweltprobenahmeUnternehmen 0040-0400-QCWasserprobenahmefläschchen
5mL PipettenspitzeVistaLab technologies4058-5102
BalanceVWRVWR-124B2
Centri 360MarkesU-CENTRI-1691Autosampler
Chromeleon Version 7.3Thermo ScientificGC-MS Software
FokussierfalleMarkesU-T12ME-2S
Gaschromatograph, Trace 1310Thermo Scientific14800403
GC-SäuleThermo Scientific26098-1420TG-5MS
Geosmin und 2-Methylisoborneol-LösungSIGMA-ALDRICH oder MilliporeSigmaCRM47525
, 20 mLMarkesC-VCC20
HiSorb GriffMarkesC-HH-6
HiSorb InjektorkappeMarkesC-HSPCCS
HiSorb InjektorauskleidungMarkesU-LINER-HISORB
HiSorb Sonde, PDMS, kurze VersionMarkesH1-XXABC
HiSorb FläschchenkappenMarkesC-HSPCCS
Labor Metallschaufel
Massenspektrometer, ISQ 7000Thermo ScientificISQ7K-NOVPI
MethanolVWR ChemikalienBDH1135-4LP
Methanol, Optima LC-MS QualitätFisher-scientificA456-4
O-Ringe Größe 201MarkenU-COV201Für HiSorb Injektorkappe und HiSorb Lagerung
Ovation automatische Pipettierung (100-5000uL)VistaLab Technologien213626
Lila Nitril-Xtra Puderfreie UntersuchungshandschuheKimtech50602-54
Natriumchlorid ( salt)VWR chemicalsBDH9286-2.5K
Schaltadapter (automatische Pipette)CUI INCSMI10-5
Fläschchen-BördelwerkzeugMarkesU-HSVCR
Fläschchen-DecapperMarkesU-HSVDC
WägeschiffchenGrainger8AG69
Headspace-Fläschchen

Referenzen

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Geosmin Nachweis2 Methylisoborneol NachweisGC MS Analyseberwachung der Wasserqualit tFischgewebeanalysefl chtige organische VerbindungenInternstandard KalibrierungSondendesorptionAquakultursysteme

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