Methodenartikel

Vorbereitung von in Agarperlen eingebettetem Mycobacterium abscessus zur intratrachealen Inokulation immunkompetenter Mäuse

DOI:

10.3791/67602

⸱

25. April 2025

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1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health, 2Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 3Department of Biological Sciences, College of Science, University of Tabuk, 4Emerging Bacterial Pathogens Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Medical Sciences, Hackensack Meridian School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Georgetown University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mäuse sind im Allgemeinen resistent gegen Infektionen mit Mycobacterium abscessus, was die Entdeckung und Entwicklung dringend benötigter Antibiotika gegen Lungeninfektionen erschwert. Hier beschreiben wir eine Methode der Inokulumvorbereitung und intratrachealen Infektion, die bei immunkompetenten Mäusen nachweislich eine anhaltende Infektion auslöst.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Robuste Mausmodelle für eine chronische Infektion mit Mycobacterium abscessus, einem Umweltpathogen, das bevorzugt die Lunge infiziert, werden dringend benötigt. Einjährige Multidrug-Therapien führen zu inakzeptabel schlechten Heilungsraten bei Patienten von etwa 50 %, weshalb präklinische Instrumente zur Entwicklung besserer Antibiotika erforderlich sind. Immunkompetente Mäuse sind jedoch im Allgemeinen resistent gegen eine Lungeninfektion durch M. abscessus. In der Literatur wurden zahlreiche Versuche berichtet, eine anhaltende Infektion mit M. abscessus bei immunkompetenten Mäusen zu etablieren. Unter diesen haben sich Methoden, die auf in Agarperlen eingebetteten Bakterien basieren, die über den intratrachealen Weg in C57BL/6-Mäuse inokuliert wurden, als am vielversprechendsten erwiesen. Die größte Einschränkung dieses Ansatzes ist die technische Herausforderung, die mit der Herstellung von Agarkügelchen mit reproduzierbarer Größe und Bakterienzahl verbunden ist, gefolgt von einer intratrachealen Inokulation. Hier liefern wir zunächst eine detaillierte Beschreibung eines optimierten Protokolls, das M . abscessus-beladene Agarkügelchen mit optimalem Durchmesser und reproduzierbarer bakterieller Belastung liefert. Als nächstes stellen wir ein detailliertes Protokoll der intratrachealen Inokulation zur Verfügung, das optimiert ist, um Verluste von Kügelchen und Bakterien aufgrund der Anhaftung an den Oberflächen der Impfgeräte zu vermeiden und eine reproduzierbare pulmonale Ablagerung von in Agar eingebetteten M. abscessus zu erreichen. Ziel ist es, eine einfache Implementierung und eine hervorragende Reproduzierbarkeit von Labor zu Labor zu gewährleisten.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Behandlungsmöglichkeiten für die Lungenerkrankung Mycobacterium abscessus (Mab) sind begrenzt und umfassen einjährige Multidrug-Therapien mit oralen, parenteralen und gelegentlich inhalativen Antibiotika, von denen die meisten keine optimale bakterizide Aktivität aufweisen und mit einer signifikanten Toxizität verbunden sind 1,2,3,4,5 . Kürzere, sicherere und effektivere Therapien sind dringend erforderlich. Mausmodelle mykobakterieller Infektionen haben maßgeblich zur Entdeckung und Optimierung wirksamer Medikamente und Medikamentenschemata beigetragen 6,7. Die präklinische Bewertung von Antibiotika gegen Mab-Infektionen hat sich jedoch als schwierig erwiesen, da es schwierig ist, progressive und anhaltende Lungeninfektionen bei Mäusen zu etablieren 8,9.

Die Infektion immunkompetenter Mausstämme mit Mab führt weitgehend zu einer vorübergehenden Besiedlung, gefolgt von einer schnellen Clearance des Erregers10,11. Um eine chronische Infektion zu erreichen, wie sie klinisch beobachtet wurde, wurden Immobilisierungsmittel wie Agarose oder Agar verwendet, um die Persistenz und immunpathologische Reaktionen auf opportunistische Krankheitserreger wie Pseudomonas aeruginosa oder Haemophilus influenza bei immunkompetenten Mäusen zu fördern 12,13,14. Dieses Modell wurde kürzlich angepasst, um eine chronische Atemwegsinfektion durch Mab ATCC 19977 in immunkompetenten C57BL/6N-Mäusen zu erreichen 15,16,17,18. Die Methode induzierte eine persistierende Infektion für bis zu 45 Tage nach intratrachealer Inokulation mit ~1 × 104 bis 1 × 106 koloniebildenden Einheiten (KBE), mit einer Inzidenz chronischer Infektionen bei infizierten Mäusen von 90%-100%19 und der Bildung von organisierten Granulomen um die zerfallende Agarkugel18. Es scheint, dass die Einbettung von Mab in Kügelchen vor einer schnellen Beseitigung durch das angeborene Immunsystem schützt und dass mit Bakterien beladene Kügelchen Herde für die Rekrutierung von Immunzellen darstellen, die zur Bildung von Granulomen und zur Etablierung chronischer Infektionen führen18. Agar/Agarose-Kügelchen stellen ein relativ inertes Biomaterial dar, das nur minimale Entzündungsreaktionen hervorruft. Darüber hinaus zersetzen sich die Kügelchen langsam, wodurch allergische Fremdkörperreaktionen oder induzierte Fibrose vermieden werden. Eine intratracheale Infektion mit oder ohne Mikrosprühvorrichtung gewährleistet eine effektive Ablagerung des Inokulums in die Lunge 8,20,21 und reproduziert die klinische Exposition und Infektion besser als eine intravenöse oder intranasale Inokulation.

Das Modell bietet also viele Vorteile. Es gibt jedoch auch einige technische Herausforderungen, nämlich (i) das Erreichen einer reproduzierbaren Bead-Größe, (ii) das Erreichen einer reproduzierbaren Bead-Bakterienlast und (iii) die Sicherstellung einer konsistenten intratrachealen Verabreichung des Inokulums. Hier stellen wir detaillierte Protokolle zur Verfügung, um diese Ziele zuverlässig zu erreichen und die Reproduzierbarkeit von Labor zu Labor zu gewährleisten.

Protokoll

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Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee des NIAID (NIH), Bethesda, MD, durchgeführt. Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Alle Studien mit M. abscessus wurden in einem Labor mit Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt.

1. Präparation des in Agarperlen eingebetteten M. abscessus-Inokulums

  1. Bereiten Sie eine Vorkultur von M. abscessus ATCC 19977 vor, indem Sie 1,5 ml Kultur mit optischer Dichte (OD600) 1 (unter Verwendung eines Spektralphotometers) in 200 ml Middlebrook 7H9-Medium inokulieren, das mit 0,05 % (v/v) Tween 80, 0,5 % (v/v) Glycerin und 10 % (v/v) Middlebrook-Albumin-Dextrose-Katalase-Anreicherung (ADC) ergänzt wird.
  2. Inkubieren Sie die Kulturen in einer Rollerflasche bei 37 °C für 24 Stunden bis zum Erreichen der Mid-Log-Phase (OD600 = 0,4-0,6).
  3. Suspendieren Sie 1,2 g tryptische Sojabrühe (TSB) in 40 ml Reinstwasser und fügen Sie 0,6 g Difco-Agar bis zu einer Endkonzentration von 1,5 % hinzu.
  4. 60 mL Schweröl in einen 500 mL Erlenmeyerkolben überführen und sowohl das Mineralöl als auch das Tryptische Soja-Agar (TSA) bei 121 °C für 15 min sterilisieren und anschließend bei 50 °C in einem Ofen äquilibrieren.
  5. Nehmen Sie eine Probe von 1 ml der Kultur und messen Sie den OD600.
  6. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 3700 g für 15 min bei 4 °C geerntet. Resuspendieren Sie die Zellen in 4 ml 1x Dulbecco's Phosphat-Buffered Saline (DPBS), um einen OD600 von ca. 30 zu erreichen.
  7. Mischen Sie 3 ml Bakteriensuspension mit 27 ml geschmolzenem TSA, das bei 50 °C in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen voräquilibriert wurde. Schnelles Mischen durch Vortexen oder Pipettieren.
  8. Gießen Sie das Bakterien-Agar-Gemisch (30 mL) vorsichtig in 60 mL Mineralöl und stellen Sie den Kolben in ein Sekundärgefäß. Stellen Sie die Mischung mit einem Magnetrührstab schnell auf mittlere Geschwindigkeit (420 U/min) auf einem auf 50 °C eingestellten Magnetrührer ein. Achten Sie darauf, dass sich in der Öl-Agar-Mischung ein sichtbarer Wirbel bildet. 6 min bei Raumtemperatur (RT) rühren.
  9. Kühlen Sie die Mischung ab, indem Sie Eis in den Sekundärbehälter geben und 35 Minuten lang weiterrühren.
  10. Stoppen Sie das Rühren und lassen Sie die Agar-Kügelchen-Aufschlämmung 20 Minuten ruhen (füllen Sie das Eis bei Bedarf auf).
  11. Füllen Sie die Güllemischung in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen um und waschen Sie sie 10 Mal mit einem Volumen DPBS, um Öl und freie Bakterien zu entfernen (3700 g, 6 min, 4 °C, für die ersten 5 Zyklen).
    1. Kombinieren Sie die Agarperlensuspensionen beim dritten Waschen in einem Röhrchen. Verwenden Sie während der ersten 5 Waschgänge eine serologische Pipette, um die Kügelchen vorsichtig wieder zu suspendieren.
    2. Für die folgenden 5 Waschgänge sind die folgenden Zentrifugationsparameter zu verwenden: 2000 g für 5 Minuten, gefolgt von 1000 g für 4, 3, 2 bzw. 2 Minuten.
  12. Resuspendieren Sie die Agarkügelchen in DPBS auf ein Endvolumen von 40 ml, geben Sie sie in eine sterile 125-ml-Flasche und verdünnen Sie sie 4x durch Zugabe von 120 mL DPBS.
  13. Die Suspension wird durch ein 200 μm Zellsieb geleitet.
    1. Befestigen Sie das Sieb an einem sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann Probenmaterial auf das Sieb und filtrieren Sie die Bead-Suspension.
    2. Um den Filtrationsprozess zu erleichtern, kombinieren Sie ein Zellsieb, einen Trichter, einen Verbindungsring und ein 50-ml-Röhrchen zu einer Einheit. Montieren Sie die Teile in der Reihenfolge Trichter, Zellsieb, Verbindungsring und 50-ml-Schlauch und ziehen Sie langsam den Kolben einer 30-ml-Spritze, die am Verbindungsring befestigt ist.
  14. Spülen Sie das Sieb bei Bedarf von der gegenüberliegenden Seite mit DPBS aus, um verbleibende größere Kügelchen abzuwaschen. Die verdünnte Suspension wird konzentriert, indem man sie 2 Minuten lang bei 1000 g schleudert oder die Kügelchen durch die Schwerkraft absetzen lässt. Lagern Sie die Agarkügelchen nach der Ernte bis zu 1 Woche bei 4 °C. Für jede Versuchscharge wird eine frische Zubereitung empfohlen.
  15. Pipettieren Sie 5 μl der Perlensuspension auf einen Objektträger, decken Sie ihn mit einem Deckglas ab und nehmen Sie Bilder an einigen zufälligen Positionen mit einem Licht- oder Fluoreszenzmikroskop mit einer 10×Objektiv auf. Speichern Sie die Bilder und messen Sie den Raupendurchmesser mit ImageJ (gewünschter Größenbereich: 200 ± 50 μm).

2. Titration des in Agarperlen eingebetteten M. abscessus-Inokulums

  1. 1 ml der Kügelchensuspension in ein M-Röhrchen geben und aseptisch homogenisieren, um in den Kügelchen eingebettete Bakterien mit einem Dissoziator freizusetzen, der auf das vordefinierte Programm RNA.02.01 eingestellt ist.
  2. Nehmen Sie 100 μl des Homogenats und verdünnen Sie es seriell 1:10 auf 1 × 10-5 Verdünnung. Verdünnungen auf 7H10-Agar verteilen, ergänzt mit 10 % Ölsäure-Albumin-Dextrose-Katalase (OADC) und 2 % Glycerin. Zählen Sie die KBE nach 3 bis 5 Tagen Inkubation auf.
  3. Passen Sie den Inokulumtiter nach Bedarf an. Wenn beispielsweise jede Maus 100 μl Bead-Suspension mit 1 × 105 KBE an 10 Mäuse erhält, wird insgesamt 2 ml-Suspension mit 1 × 106 KBE/ml plus ~25 % hergestellt, um Verluste in Spritzen auszugleichen.

3. Prüfung der Raupendosierung durch Spritze und Nadel

HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden aufgenommen, um sicherzustellen, dass die Kügelchen nicht an den Oberflächen der Spritze oder Nadel haften. Es wurde festgestellt, dass es wichtig ist, eine Glasspritze und eine 24-G-Metallzuführnadel zu verwenden, um den Verlust von Kügelchen durch Anhaftung an Kunststoffoberflächen zu verhindern.

  1. Bereiten Sie PBST vor, indem Sie 1,25 ml steriles Tween 80 bis 500 ml steriles PBS hinzufügen.
  2. Geben Sie 900 μl PBST in fünf M-Röhrchen zum Testen der Agarkügelchen, die durch die Zuführnadel gelangen, sowie 900 μl PBST in sterile 2-ml-Röhrchen, um -2 bis -6 Verdünnungen jeder Durchdrückprobe vorzubereiten.
  3. Mischen Sie den in Agarperlen eingebetteten M. abscessus , der zuvor hergestellt wurde, mit einer P1000-Pipette, um sicherzustellen, dass alle Kügelchen gleichmäßig verteilt sind.
  4. Befestigen Sie eine 24-G-Metall-Zuführnadel an der Glasspritze und saugen Sie die Agarperlensuspension ab, wobei Sie darauf achten, dass sich keine Luftblasen bilden.
  5. Sobald die Spritze voll ist und keine Luftblasen bilden, platzieren Sie Nylonclips oder Stopfen auf dem Kolben der Spritze, so dass zwischen den Clips kein Platz bleibt. Die Stopfen ermöglichen eine genaue Dosierung von 50-100 μL. Es ist möglich, bis zu 6 Clips entlang des Stößels anzubringen.
  6. Geben Sie 100 μL Kügelchen ("Push-Through") in der jeweiligen Reihenfolge in die M-Röhrchen.
  7. Sobald 5 Push-Throughs gesammelt wurden, homogenisieren Sie die Kügelchen mit dem Gewebedissoziator, der an die RNA.02.01-Einstellung angepasst ist, die für die RNA-Präparation aus gefrorenen Organen geeignet ist und bei der festgestellt wurde, dass er M. abscessus effektiv aus den Kügelchen freisetzt, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen.
  8. Führen Sie eine serielle Verdünnung für die Homogenate im Bereich von -1 bis -6 durch. Die Verdünnungen werden auf 7H11-Agarplatten plattiert, die mit OADC ergänzt sind. Zählen Sie die KBE nach 5 Tagen.

4. Intratracheale Inokulation von Mäusen

  1. Bereiten Sie 6 bis 8 Wochen alte CD-1-Mäuse vor.
  2. Sedatieren Sie die Mäuse mit einem Isofluran-Aerosol-Expositionssystem bei einer Flussrate von 1-5%, wie zuvor beschrieben1.
  3. Halten Sie die Mäuse mit einem dreidimensionalen (3D) gedruckten, geneigten Ständer (individuell entworfen und produziert) fest. Der Stab in der Mitte des Ständers hat eine Nahtschnur, die die Maus an ihren Schneidezähnen vertikal nach oben hält und die Maus mit erhobenem Kopf in eine ventral liegende Position bringt.
  4. Befestigen Sie eine 24-G-Fütterungsnadel aus Metall an einer Glasspritze, die mit M . abscessus gefüllt ist, in die Agarperlen eingebettet sind. Platzieren Sie Nylonklammern oder -stopfen auf dem Kolben der Spritze, um jede Maus mit 50 μl Inokulum zu infizieren.
  5. Sobald die sedierte Maus am Nahtstich festgehalten ist, bewegen Sie die Zunge mit einem Wattestäbchen-Applikator an die Seite des Mundes.
  6. Visualisieren Sie den hinteren Teil des Mundes der Maus, um den weißen Abschnitt im hinteren Teil des Mundes deutlich zu identifizieren und die Luftröhre der Maus zu erfassen.
  7. Winkeln Sie die Metallsondennadel senkrecht über der Maus an und führen Sie sie oben in der Luftröhre ein. Beim Passieren der Epiglottis kann es zu einem leichten Widerstand kommen.
  8. Schieben Sie die Sondennadel in die Luftröhre, entfernen Sie den Nylonclip oder -stopfen und geben Sie 50 μl M . abscessus ab, in die Agarperle eingebettet ist.
  9. Lassen Sie die Maus 5 min ruhen und wiederholen Sie die Schritte 4.2- 4.8 ein zweites Mal. Der Zweck eines zweistufigen Inokulationsverfahrens besteht darin, eine reproduzierbare und tiefe Ablagerung des vollständigen Inokulums in der Lunge zu gewährleisten.
  10. Lassen Sie die Infektion 24 Stunden lang fortschreiten, danach wird die Maus eingeschläfert, um die bakterielle Ablagerung in der Lunge aufzuzählen.

Ergebnisse

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Wulstgröße und Belastung
Um Agarkügelchen und ihre bakterielle Belastung sichtbar zu machen, wurde das mCherry-rot fluoreszierende Protein unter dem konstitutiven Hsp60-Promotor im Mab-Typstamm ATCC 19977 exprimiert und dieser Stamm wie oben beschrieben in Agarkügelchen eingebettet. Abbildung 1A zeigt den Bereich der Bead-Größe (Maßstabsleiste = 200 μm). Abbildung 1B zeigt die Belastung durch 6 unabhängige Bead-Präparationen, was die Reproduzierbarkeit des beschriebenen Verfahrens zeigt.

Plattierung des Spritzendurchsteckens und der bakteriellen Implantation nach intratrachealer Inokulation
Die intratracheale Inokulation wurde in zwei Schritten optimiert. KBE/ml wurden vor und nach dem Passieren der Glasspritze im Inokulum gezählt, um sicherzustellen, dass keine Kügelchen oder bakteriellen Verluste auftraten, wenn die Kügelchen die Spritze und den angeschlossenen Schlauch passierten. Tabelle 1 zeigt den anfänglichen bakteriellen Titer von zwei unabhängigen Kügelpräparaten (Versuche 1 und 2) und die Anzahl der pro 100 ml durchgedrückten Proben aus einer einzigen Spritzenladung zurückgewonnene KBE. Um Perl- und Bakterienverluste zu vermeiden, ist eine Glasspritze erforderlich, die mit einem Metallrohr verbunden ist. Agarkügelchen neigen dazu, an Kunststoffoberflächen zu haften.

Die KBE Enumeration im Laufe der Zeit in der Kügelchenpräparation zeigte, dass die bakterielle Belastung der Kügelchen 1 Woche lang stabil bei 4 °C blieb, mit einem ~2-fachen Verlust der bakteriellen Belastung pro 2 Wochen und einer unbeeinträchtigten Lungenablagerung. Als nächstes wurden Gruppen von 5 bis 8 Mäusen mit drei unabhängigen Bead-Präparaten infiziert, um die Reproduzierbarkeit des intratrachealen Impfverfahrens zu testen. Tabelle 2 zeigt die Anzahl der Lungen-KBE pro Maus, aufgezählt 24 Stunden nach der Infektion, wie beschrieben.

Schließlich wurde die Reproduzierbarkeit der Infektion zwischen den Operatoren durch die Infektion von drei Gruppen von 10 CD-1-Mäusen bewertet, die jeweils von einem anderen Operator durchgeführt wurden. Die Anzahl der Lungen-KBE 24 Stunden nach der Infektion ist in Abbildung 2 dargestellt.

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Abbildung 1: Pilotversuch zur Beurteilung der Kügelchengröße, Visualisierung und Quantifizierung der bakteriellen Belastung von M. abscessus . (A) Agarkügelchen, die den Stamm M . abscessus ATCC 19977 enthalten, konstruiert zur Expression des fluoreszierenden Proteins mCherry Red unter dem konstitutiven hsp60-Promotor. Fünf μl Kügelchensuspension wurden auf einen Objektträger aufgetragen und mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet, das mit einer Kamera (10x Objektiv) ausgestattet war. Jeder rote Punkt ist eine fluoreszierende Bakterienzelle, die in Agarkügelchen mit Durchmessern von ~70-250 μm eingeschlossen ist. (B) Bakterielle Belastung in KBE/ml von 6 einzelnen Kügelchenpräparaten, die die Reproduzierbarkeit der Methode zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Reproduzierbarkeit der Infektion zwischen den Bedienern. Gruppen von 10 weiblichen CD-1-Mäusen wurden intratracheal von drei unabhängigen Anwendern wie beschrieben unter Verwendung desselben Beadspräparats infiziert. Es werden Lungen-KBE gezeigt, die 24 Stunden nach der Infektion aufgezählt werden. O1, O2, O3: Operatoren 1, 2 und 3. Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

KBE/100 μL
Vorbereitung der RaupeVersuch 1Versuch 2
1,13E+052.40E+05
Spritzen-Durchsteckprobe
11.14E+055.10E+05
21,36E+054.10E+05
39.30E+04 Uhr3,90E+05
49.80E+043.60E+05
51.14E+05
Durchschnitt1.11E+054.18E+05
SD1,69E+04 (15%)6,50E+04 (16%)

Tabelle 1: Koloniebildende Einheiten (KBE) pro 100 μl Probe nach Passieren der Glasspritze und der Metallzuführnadel.

Versuch 1Versuch 2Versuch 3
Maus-IDLungen-KBE/MausMaus-IDLungen-KBE/MausMaus-IDLungen-KBE/Maus
M-16.50E+03 UhrM-62.20E+05 UhrM-116,80E+04
M-21.10E+04M-72,70E+05M-121,70E+05
M-31,40E+04M-88.10E+04 UhrM-132.10E+05
M-43.20E+03 UhrM-91,40E+05M-144.40E+04 Uhr
M-54.50E+03M-101.30E+05 UhrM-157.50E+04 Uhr
M-161.01E+05
M-177.00E+04 Uhr
M-185,80E+03
Durchschnitt7,84E+03Durchschnitt1,68E+05Durchschnitt9.30E+04 Uhr
SD4,54E+03 (58%)SD7,57E+04 (45%)SD6,67E+04 (72%)

Tabelle 2: Implantation von eingebetteten Agarkügelchen M. abscessus in die Lunge der Maus 24 Stunden nach der Inokulation

Diskussion

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Um eine gleichmäßige Verteilung der Bakterien in den Agarkügelchen zu gewährleisten, ist es wichtig, das geschmolzene Agar-Bakterien-Gemisch gleichmäßig zu suspendieren, bevor es der Ölphase zugesetzt wird. Das Volumenverhältnis von Öl zu Agar-Bakterien ist entscheidend für die Kontrolle der Perlengröße. Ein höheres Öl-Agar-Verhältnis führt zur Bildung kleinerer Agarkügelchen. Beim Mischen der Agar-Bakterien-Suspension mit der Ölphase ist die Temperaturkontrolle entscheidend. Das Öl-Agar-Gemisch muss warm genug sein, um eine Emulgierung und Tröpfchenbildung zu ermöglichen, aber kühl genug, um die Bakterien nicht zu schädigen. Durch ständiges Rühren beim Abkühlen der Mischung auf Raumtemperatur oder darunter können sich Agartröpfchen bilden und verfestigen.

Die richtige Kalibrierung der Rührplatte, die Größe des Rührstabs sowie die Form und Größe des Kolbens sind wichtige Determinanten eines gleichmäßigen Wirbels. Ein Rührstab in der Mitte des Kolbens erzeugt einen symmetrischen Wirbel, der eine gleichmäßige Durchmischung gewährleistet. Ein außermittiger Rührstab kann zu einem instabilen Wirbel führen, was zu unregelmäßig geformten Kügelchen und dem Einbringen von Luftblasen in die Kügelchen führt. Es wird empfohlen, die Position des Rührstabs in Echtzeit zu überwachen und anzupassen. Das Volumen des Kolbens muss proportional zum Volumen des Öl-Agar-Gemisches sein. Ein 500-ml-Kolben ist ideal zum Schleudern eines 90-ml-Öl-Agar-Gemisches, wodurch ein sichtbarer Wirbel entsteht. Bei der Verwendung größerer Kolben ist es wichtig, das Volumen des Öl-Agar-Gemisches, die Größe des Rührers und die Vortex-Geschwindigkeit anzupassen, um ein Gleichgewicht zwischen effektivem Mischen und stabilem Vortex zu erreichen. Die Aufrechterhaltung einer konstanten Vortex-Geschwindigkeit während des Prozesses und über die Bead-Präparationen hinweg ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge.

Der Herstellungsprozess der Agar-Kügelchen, insbesondere die Vortex-Geschwindigkeit und das Öl-Agar-Verhältnis, wurden von16,22 übernommen, mit geringfügigen Modifikationen. Scherkräfte innerhalb des Spinnwirbels erzeugen von Natur aus Perlen unterschiedlicher Größe. Um diese Größenvariabilität zu minimieren, wurde der Schritt der Raupenernte durch die Einführung mehrerer Waschschritte modifiziert, wobei ein Gradient aus abnehmender Zentrifugationsgeschwindigkeit und -zeit verwendet wurde, um die Entfernung kleiner Kügelchen (und freier Bakterien) zu gewährleisten. Ein Mikromaschenfilter wurde eingesetzt, um Kügelchen der gewünschten Größe anzureichern, wobei größere Kügelchen und solche, die sich möglicherweise durch zufällige Koaleszenz gebildet haben, effektiv herausgefiltert wurden. Um Bead- oder Bakterienverluste zu vermeiden, wenn die Bead-Aufschlämmung durch die Spritze und den angeschlossenen Schlauch für die intratracheale Inokulation der Maus fließt, ist es wichtig, eine Glasspritze, 24-G-Metall-Fütterungsnadeln und einen mit Metall verbundenen Schlauch zu verwenden.

Die Haupteinschränkung des Verfahrens ist die technische Komplexität der Kügelchenpräparation und der intratrachealen Inokulation, um eine reproduzierbare Kügelchenbelastung und Lungenimplantation zu erreichen. Liebe zum Detail und die Fähigkeit zur Fehlerbehebung sind erforderlich. Darüber hinaus wurde das Modell nicht vollständig validiert, indem die Wirksamkeit von Standardantibiotika und den häufigsten Antibiotikakombinationen, die Mab-Patienten verabreicht wurden, getestet wurde.

Derzeit ist kein Mausmodell der chronischen Mab-Infektion so weit validiert, dass die Wirksamkeit von Einzelwirkstoffen und Wirkstoffkombinationen bei Patienten mit Modell9 vernünftig vorhergesagt werden kann. Das in Agarkügelchen eingebettete C57BL/6-Maussystem wurde genutzt, um die Wirksamkeit antimikrobieller Behandlungen zu testen 15,19,23. Die nächstliegende Alternative zum in Agarkügelchen eingebetteten C57BL/6-Maussystem ist das C3HeB/FeJ-Mausmodell, das auf einer Dexamethason-Immunsuppression beruht, um eine dauerhafte chronische Infektion zu erreichen24,25. Die Vorteile des hier beschriebenen Protokolls bestehen darin, dass (i) vollständig immunkompetente und kostengünstigste C57BL/6-Mäuse verwendet werden können, (ii) eine produktive und chronische Infektion mit dem gut charakterisierten Typstamm ATCC 19977 erhalten werden kann und (iii) keine chemisch induzierte Immunsuppression erforderlich ist, wodurch die Notwendigkeit täglicher Dexamethason-Injektionen umgangen wird, wodurch potenzielle Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Auswirkungen auf die Lungenimmunpathologie vermieden werden.

Angesichts des Mangels an validierten Mausmodellen für chronische Mab-Infektionen zur Bewertung neuer Wirkstoffkandidaten und Medikamentenschemata 8,9 hat die hier beschriebene Technik das Potenzial, das Feld voranzubringen, den prädiktiven Wert präklinischer Wirksamkeitsdaten zu verbessern, die Priorisierung von Arzneimitteln mit dem höchsten Potenzial für eine dauerhafte Heilung zu unterstützen und die Arzneimittelforschung und -entwicklung für die Mab-Lungenerkrankung insgesamt zu beschleunigen. Die Methode kann auf andere Lungenpathogene angewendet werden und hat eine etablierte Erfolgsbilanz bei P. aeruginosa oder Haemophilus influenza. Das Hauptziel des hier beschriebenen Protokolls besteht darin, ausreichende Details und Empfehlungen bereitzustellen, um eine einfache Implementierung und eine hervorragende Reproduzierbarkeit von Labor zu Labor zu gewährleisten.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Cystic Fibrosis Foundation, Award DICK24XX0, an TD und VD und R01-AI132374 von NIH-NIAID an TD und VD finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
125-ml-FlascheCorning8388Steril
3 x 3 Tube HaltegestellFisher5972-0030PKVor Gebrauch desinfiziert
3D-gedruckter MausständerTransworld Marketingkundenspezifisch entwickelt und hergestelltVor Gebrauch desinfizierte
48-Well-VerdünnungsplatteCelltreat229192Sterile
50-mL-ZentrifugenröhrchenGreiner Bio-One227261Sterile
AnästhesiemaschineE-Z SystemsEZ-AF9000 SYSTEMn/a
Avanti J-15R Beckman Coulter  B99517
im Lift-off-Deckelgestell 1000GThermo Scientific ART 21-236-2ASteriler
Biohazard-BeutelFisherbrand22-044561
Verbindungsring pluriSelect41-50000-03
Applikatorenpuritanisch22-029-571Sterile
Einweg-Impfösen Gelb Steril 100 im DruckverschlussbeutelCole-Parmer Essentials 03-391-562Steriles
Einweg-Handtuchtuch mit Poly-FutterDynarex19-310-671Steriles
Dulbecco-Phosphat-gepuffertes KochsalzlösungThomas Scientific21-031-CMSteriler
TrichterpluriSelect42-50000Steriles
GE Ultrospec 10Sigma-AldrichGE80211630Spektralphotometer
Gentlemacs GewebedissoziatorMiltenyi Biotec130-096-427Nicht wärmeaktivierte
Hamilton Spritze Hamilton 80801Vor Gebrauch desinfiziert
Schweres MineralölSigma-Aldrich330760-1LSterile
Isofluranlösung 250 ml FlascheCovetrus29405Ätzung/Reizung der Haut: Kategorie 2, Schwere Augenschädigung/Augenreizung: Kategorie 2A, Spezifisches Zielorgan Systemische Toxizität (einmalige Exposition): Kategorie 3
Kann Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen, Verursacht schwere Augenreizungen, Verursacht Hautreizungen. Nicht einatmen, in gut belüfteten Räumen anwenden.
M Tubes (gentleMACS)Miltenyi Biotec130-096-335Steriler
Magnetrührer MR Hei-Connect Heidolph505-40000-13-1
MagnetrührstabThomas Scientific 1181L08Sterile
mechanische Pipette 100– 1000 &Mikro; L Gilson PIPETMAN L FA10006MVor Gebrauch desinfiziert
Mechanische Pipette 20– 200 & Mikro; L Gilson PIPETMAN L FA10003MGVor Gebrauch desinfiziert
Fütterungsnadel aus Metall 24 GBraintree ScientificN-VP 24G-1SMuss sterilisiert werden (autoklaviert)
Middlebrook 7H10 AgarSigma-AldrichM0303-500GSterilisiert (autoklaviert)
Middlebrook 7H11 AgarThermo FisherR4554002Sterilisiert (autoklaviert)
Middlebrook 7H9 mediumBeckton Dickinson271310Sterilisiert (autoklaviert)
Mausständer-ErsatzteileTriMech Solutions SRV-AMS-FDMVor Gebrauch desinfiziert
Nicht resorbierbares SeidennahtFisher Scientific18020-50n/a
OADC Flüssiganreicherung zur Verwendung mit Middlebrook Media 500 mlThermo Scientific RemelR450605Steril
PBS (10x), pH 7,4 Steril gefiltert 500 mLGibco70-011-044Sterile
Peroxiguard TücherPeroxigard29221n/a
Petrischalen mit durchsichtigem Deckel Rund 100mmx 15mmFisherbrandFB0875712Sterile
PluriStrainer 200 mmpluriSelect43-50200-03Steril; Zellsieb
RollenflaschenCorning430165Sterile
Serologische PipetteCorning4489Sterile
Spektralphotometer-Küvetten 1,5 mLFisher Scientific14955127Sterilisiert (autoklaviert)
Spritzenverschlüsse oder Clips (Nylon)Trimech SRV-AMS-MJFVor Gebrauch desinfiziert
Tryptische SojabrüheSigma-AldrichT8907-500GSterile
Tween 80 Fisher170793Filter sterilisiert 
Filtrierbares Pipettenspitzengestell mit breiter Bohrung und abnehmbarem Deckel 200G Thermo Scientific ART21-236-1ASteril
Zentrifugenbarriere-Pipettenspitzen mit Baumwollspitze

Referenzen

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