Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Glukosestimulierte Insulinsekretion über Perfusion durch das Gefäßsystem der Maus mit intakter Bauchspeicheldrüse

1.4K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/67701

⸱

25. Juli 2025

 ,  , 
1Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier geben wir Details zur Durchführung der glukosestimulierten Insulinsekretion (GSIS) durch Perfusion durch das Gefäßsystem von Mäusen mit intakter Bauchspeicheldrüse als zusätzliche Technik zur Beurteilung der endokrinen Pankreasfunktion mit Reduktion möglicher Störfaktoren.

Zusammenfassung

Aktuelle Methoden zur glukosestimulierten Insulinsekretion (GSIS) bei Nagetieren umfassen die ex vivo-Perifusion oder statische Inkubation von Pankreasinseln und Pankreasschnitten. Ex-vivo-Perfusion und statische Inkubation ermöglichen die schnelle und effiziente Entnahme mehrerer Proben. Diese Verfahren setzen die Inselzellen jedoch einem Trauma, intermittierender Hypoxie und einer verminderten parakrinen Insulinsignalisierung aus, die sich alle auf die GSIS auswirken können. Diese negativen Effekte können durch die Perfusion durch das Gefäßsystem der Maus mit intakter Bauchspeicheldrüse minimiert werden, was eine weitere Vergleichsmethode für die verschiedenen GSIS-Modelle darstellt. Das Rückgrat dieses Perfusionsverfahrens bestand aus i) der Gefäßligatur zur Isolierung der Bauchspeicheldrüse und ii) der Kanülierung des Pankreasgefäßsystems. Dieses Modell umfasste sieben Ligaturpunkte und zwei Kanülen. Das resultierende perfundierte Gefäßsystem umfasste die untere Bauchaorta, die Arteria mesenterica coeliacus und superior, die verzweigten Zuflüsse und die Pfortader.

Das Perfusat wurde mit ~2 ml/min über eine peristaltische Pumpe in das Gefäßsystem eingeführt, die PE-50-Schläuche, die die untere Bauchaorta kanülieren. Die Perfusate liefen durch das isolierte Gefäßsystem und wurden über eine Kanüle mit PE-30-Schlauch durch die Pfortader entnommen. Perfusat wurde über 3-Minuten-Intervalle in Runden von 30 Minuten für jede Perfusatlösung von 2,6 mM Glucose, 16,8 mM Glucose und 2,6 mM Glucose mit 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) in Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer (KRB, 16 mM HEPES und 0,1% BSA, pH 7,4) gesammelt. Der IBMX-Lösung ging eine normale 2,6 mM Glukoselösung als Waschgang voraus. Die Gesamtzeit betrug ~1 h für den chirurgischen Eingriff und 2 h für die Perfusatentnahme. Perfusate wurden eingefroren, bis ein ELISA zur Messung der Insulinsekretion durchgeführt wurde.

Diese Methodenliste soll eine detaillierte verfahrenstechnische Grundlage für die Messung der Insulinsekretion durch die Pankreasperfusion durch das Gefäßsystem liefern, die es den Forschern ermöglicht, die intakte Pankreasperfusion erfolgreich in ihren Laboren durchzuführen.

Einleitung

Die Quantifizierung und das Verständnis der Betazellfunktion erfolgten in erster Linie durch ex vivo-Perifusion, statische Inkubation und in jüngerer Zeit durch Pankreasschnitte. Während diese Verfahren die Bewertung isolierter Inselzellen ermöglichen, können die ersten beiden die Inselzellen Stressoren aussetzen, die ihre Funktionsfähigkeit beeinträchtigen. In einer Studie von Rosenberg et al. zeigten Hundeinseln, die mit Standardmethoden isoliert wurden, eine erhöhte Betazell-Apoptose, was sich durch den Verlust der Basalmembran, das Auftreten von pyknotischen Kernen und apoptotischen Körpern belegte1. Diese Studie deckt sich mit einem anderen Bericht über die Isolierung menschlicher Pankreasinseln, bei dem morphologische Veränderungen, die eine Apoptose darstellen, kurz nach der Isolierung der Inselzellen nachgewiesen werdenkonnten 2,3. Eine erhöhte Apoptose der Betazellen führte zu einer verminderten Insulinfreisetzung aus diesen Inseln, was die Vorstellung unterstützt, dass die Isolierung der Inselzellen sie für Schäden und Funktionsbeeinträchtigungen prädisponiert.

Zusätzlich zur Apoptose geht das Gefäßsystem durch die Isolierung der Inselzellen verloren, was zu einer Beeinträchtigung des Transports von Nährstoffen, Metaboliten und Hormonen führt 4,5. Diese Einschränkung hat zu Alternativen wie der Transplantation der Inselzellen in das Auge geführt, um eine Form des Gefäßsystems und der Innervation zu erhalten6. Die Veränderung der Gefäßarchitektur während der Inselisolierung führt auch zu einer kompakteren Insel, die sich von dem unterscheidet, was in vivo erwartet wird 7,8.

Zu den anatomischen Unterschieden kommt hinzu, dass sich das Verhalten von statisch inkubierten Inselzellen von denen der isolierten perfundierten Bauchspeicheldrüse unterscheidet. Bei statisch inkubierten Inselzellen mit niedrigem Glukosespiegel schienen 77 % des freigesetzten Gesamtinsulins (3,31 ng von insgesamt 4,34 ng) innerhalb der ersten 30 Minuten und in den folgenden Zeiträumen wenig vorhanden zu sein. Dies steht in krassem Gegensatz zur isolierten perfundierten Bauchspeicheldrüse bei niedrigen Glukosekonzentrationen, bei der zu allen Zeitpunkten praktisch keine Insulinfreisetzung stattfand (insgesamt <1,8 ng)9. Während weitere Forschungen durchgeführt werden müssen, um diesen Unterschied bei niedrigen Glukosekonzentrationen vollständig aufzuklären, könnte dieser Unterschied in den Daten ein Leck von hypoxischen sterbenden Zellen darstellen, das durch statische Inkubation von Monoschichten von Inselzellen weiter untersucht wurde. Dennoch können diese Unterschiede zwischen den aktuellen Methoden und den in vivo-Umgebungen zu einer Beeinträchtigung der externen Validität führen (Tabelle 1).

Sowohl die ex vivo-Perifusion als auch die statische Inkubation verursachen nicht nur Hypoxie, sondern beinhalten auch die Kultivierung und Trennung der Inselzellen aus der Bauchspeicheldrüse in Gewebekulturschalen, um sie in einem schwebenden Zustand zu halten. Während dieses Prozesses wird Kollagenase typischerweise durch den Pankreasgang perfundiert, um die Dissoziation des Pankreasgewebes zu ermöglichen. Kollagenase bindet an Kollagenfibrillen und entwirrt diese mit Hilfe von neutralen Proteasen, Gelatinasen und endogenen Pankreasproteasen. Zusammen verdauen diese Proteasen weiter, bis die Inselzellen von ihrer extrazellulären Matrix und ihren Azinuszellansätzen befreit sind. Das Ausbalancieren dieser Mischung von Proteasen führt zu unterschiedlichen Ergebnissen sowohl in Bezug auf die Reinheit als auch auf die Funktionalität der isolierten Inselzellen10. Die Wirksamkeit der Kollagenase hängt auch von tierischen Merkmalen wie Stamm, Alter, Gewicht und Diabetesstatus ab. Die Verwendung dieser Proteasen in Verbindung mit tierspezifischen Merkmalen kann die Pankreasinseln während des Isolationsprozesses schädigen. Bei der Verabreichung von Kollagenase aktivieren diese Proteasen auch endogene proteolytische Enzyme der Bauchspeicheldrüse, die die Verdauung der Basalmembran unterstützen. Eine Kontrolle der endogenen Aktivierung des Pankreasenzyms ist jedoch noch nicht möglich. Daher kann dies eine Rolle bei der Schädigung der Inselzellen während des Anbauprozesses spielen 11,12,13. Ein Bericht aus Edmonton zeigte, dass die endogene Proteaseaktivität die Isolationsausbeute der Inselzellen beeinflusste, sobald ein ausreichendes Enzymaktivitätsniveau für die Isolierung erreichtwurde 14,15.

Es wurde gezeigt, dass die derzeitigen Infusionstechniken der Kollagenase (intraduktal) auch in das Inselinnere eindringen, was zu einer möglichen Inselfragmentierung und damit zu geringen Inselausbeuten führt16. In einer Studie von Balamurugan et al. wurde festgestellt, dass Kollagenase in Inselzellen und azinärem Gewebe in der Bauchspeicheldrüse der Maus lokalisiert ist, was zu einer intensiven Entzündung und Aktivierung apoptotischer Signalwege führt17. Inseln, die die Isolationsphase überlebten, zeigten auch eine verminderte Fähigkeit, Insulin freizusetzen.

Darüber hinaus spielen andere Faktoren wie mechanischer Stress während der Inselvorbereitung und Hypoxie-induzierte Nekrose während der Kultur eine Rolle für die Funktion der Inselzellen18. Diese Merkmale können die Lebensfähigkeit der Insel bei der Isolierung der Bauchspeicheldrüse und damit die daraus resultierende Funktion beeinflussen.

Neben der Isolierung und Bewertung von Inselzellen durch ex vivo-Perifusion und statische Inkubation sind Inselzellen in lebenden Pankreasschnitten eine weitere ex vivo-Methode zur Messung endokriner Zellreaktionen19. In diesem System wird die chemische Belastung durch Inselisolierungsverfahren vermieden. Darüber hinaus bleibt die Mikroumgebung der Inselzellen intakt, was die Untersuchung der Inselphysiologie näher an ihrem in vivo-Zustand ermöglicht20. Ähnlich wie die ex vivo Perifusion und die statische Inkubation ist dies eine Methode, die auch in Zukunft eine wichtige Rolle beim Erwerb von Kenntnissen über die Bauchspeicheldrüse spielen wird. Zu den Einschränkungen gehören jedoch die mechanische Belastung während der Schnittgenerierung sowie das Fehlen einer ganzheitlichen Gesamtbetrachtung einer intakten Bauchspeicheldrüse für Pathologie und Physiologie. Der Schnitt repräsentiert eine bestimmte Region innerhalb der Bauchspeicheldrüse, was seine Generalisierbarkeit aufgrund der verringerten Stichprobengröße und der eingeschränkten Sicht verringert21.

Diese Inselisolierung und andere Methoden gehen mit verschiedenen Stressfaktoren einher, die den Inselchen auferlegt werden können. Mechanischer Stress, Hypoxie, Protease-Überaktivität und eingeschränkte Sicht spielen alle eine Rolle bei der resultierenden Inselausbeute und der externen Gesamtvalidität. Diese Faktoren können durch die Perfusion der Bauchspeicheldrüse über das Gefäßsystem der Maus reduziert werden, wodurch alle oben genannten Stressoren minimiert werden und gleichzeitig die Auswirkungen anderer Sekretagogen und pharmakologischer Wirkstoffe, die aufgrund der Aufrechterhaltung der zellulären Integrität im Körper vorhanden sind, untersucht werdenkönnen 22. Frühere Studien haben gezeigt, dass sich der Blutfluss der Inselzellen auf den Plasmainsulinspiegelauswirkt 23; Im Gegenzug würden vasoaktive Moleküle wie Angiotensinpeptide und sympathische Agonisten, die den Blutfluss auf der Insel verändern, die Funktion der Inselzellen und die Insulinfreisetzung verändern24,25. Die Perfusion der Bauchspeicheldrüse würde eine weitere Bewertung ermöglichen, wie diese und andere verschiedene Moleküle die endokrine Zellantwort beeinflussen können. Dieses System hofft, eine weitere konzeptionelle Weiterentwicklung unseres Verständnisses der endokrinen Pankreasbiologie in Gegenwart von Cross-Talk in ihrer natürlichen Mikroumgebung mit intakten Gefäßen und Innervation zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht die Perfusion der intakten Bauchspeicheldrüse in diesem Protokoll die Isolierung des Organs, wodurch potenzielle Störfaktoren aus anderen Organen wie der Leber, die Insulin aus dem Kreislauf entfernt, im Vergleich zur Perfusion der gesamten Maus reduziert werden. Die Perfusion der gesamten Maus würde eine reduzierte Operationstechnik ermöglichen; Es wäre jedoch immer noch erforderlich, das Perfusat durch ein Gefäß nach der Bauchspeicheldrüse und vor dem Erreichen der Leber - wahrscheinlich der Pfortader - zu sammeln. Die Entnahme von Pfortadern würde weiterhin eine Kanülierung erforderlich machen. Während die Perfusion der gesamten Maus den Vorteil reduzierter chirurgischer Schritte bieten würde, gäbe es Einschränkungen aufgrund der Störfaktoren, die von Organen wie den Nieren und der Lunge erzeugt werden, die Angiotensin-Peptide produzieren. Dies wäre jedoch ein neuartiger Ansatz, der sich als nützlich erweisen könnte, wenn die Auswirkungen von vasoaktiven Molekülen, die von anderen Organen produziert werden, auf Pankreasinseln untersucht werden, was oberste Priorität hat.

Die Perfusion der gesamten Bauchspeicheldrüse wurde in der Vergangenheit bereits von anderen erfolgreich durchgeführt 7,22,26. In diesem aktualisierten Protokoll stellt die Verwendung von Mäusen aufgrund ihrer im Vergleich zu Ratten kleineren Anatomie eine erhöhte technische Herausforderung dar. Dieses Verfahren demonstriert jedoch erfolgreich die Machbarkeit dieses Protokolls, indem es ein gut charakterisiertes Insulinsekretionsprofil aus der intakten Bauchspeicheldrüse von 3 unabhängigen Mäusen demonstriert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Forschungen an Nagetieren erfolgen in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Joslin Diabetes Research Center (Zulassungsnummer 22-01).

1. Beginn

  1. Verabreichen Sie eine Anästhesie.
    1. Injizieren Sie nüchterne, normoglykämische Mäuse (Flox/Cre 53-74 Wochen altes M/F, das in Experimenten verwendet wurde) mit einer Ketamin/Xylazin-Mischung (~75 mg/kg Ketamin-HCl-Mischung), die intramuskulär über einen der Hinterschenkel über eine 28-G-Nadel zur Euthanasie verabreicht wird.
      HINWEIS: Die Verwendung von normoglykämischen, nüchternen Mäusen ist wichtig, um die Wirkung von Ketamin zu reduzieren. Es kann jedoch ein Betäubungsmittel ersetzt werden.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Maus richtig betäubt ist, indem Sie den hinteren Fuß mit einer Pinzette einklemmen, um den Reflex zu überprüfen.
      HINWEIS: Fehlender Reflex wird durch mangelnde Bewegung des eingeklemmten Beins gekennzeichnet.
    3. Verabreichen Sie den Augen sterile Augensalbe, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern und Hornhautgeschwüren vorzubeugen.
  2. Sichern Sie das Motiv.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Maus sicher ist und während des Eingriffs an Ort und Stelle bleibt, was bei diesem Experiment über Magnete abgeschlossen wird, die an Gummibändern befestigt sind, die mit den Gliedmaßen verbunden sind, wobei die Magnete an einer Magnettafel befestigt sind.
  3. Reinigen Sie die Inzisionsstelle.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Maus mit 70%igem Ethanol besprüht wird, um eine Kontamination durch die Haare der Maus zu verhindern.
      HINWEIS: Wenn Sie die Maus rasieren, ist die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination durch das Fell geringer.
  4. Führen Sie einen Schnitt durch.
    1. Mit einer Pinzette/Pinzette 2-3 cm vom After entfernt einklemmen und nach oben schneiden, während Sie das Bauchfell mit einer gebogenen Schere durchstechen.
    2. Erstellen Sie einen diagonalen Schnitt von der Mittellinie bis zu den Rippen und dem lateralen Teil der Maus.
    3. Erstellen Sie einen identischen Schnitt auf der gegenüberliegenden Seite.
      HINWEIS: Ziel ist es, eine angemessene Sicht auf die Bauchhöhle von der Nähe des Rektums bis zum Zwerchfell zu schaffen

2. Ligatur

  1. Liver die Magenarterie.
    1. Bewegen Sie den Darm mit einer stumpfen Zange/Finger nach rechts vom Tier. Hebe den Magen an, um die Magenarterie und die Vene zu lokalisieren.
      HINWEIS: Magenarterie und -vene wurden durch Visualisierung von Gefäßen identifiziert, die von der unteren Speiseröhre zum oberen Magen verlaufen.
    2. Nehmen Sie eine 7-0-Naht (keine Nadel) und platzieren Sie sie mit einer stumpfen Zange unter der Magenarterie, um die Ligatur vorzubereiten.
    3. Legen Sie einen chirurgischen Knoten an und sorgen Sie über einen festen Knoten für eine adäquate Ligatur.
      HINWEIS: Die Art des Knotens spielt keine Rolle; Die Verhinderung des Blutflusses kann durch eine Änderung der Farbe des ligierten Organs zu einem blasseren Aussehen oder die Entfernung des Organs und die Überwachung der Blutausscheidung aus dem Ligaturpunkt festgestellt werden. Die Ligatur der Magenarterie stellt sicher, dass keine Beeinflussung durch den Mageninhalt erfolgt. Dadurch wird auch die Leckage in die Magengefäße reduziert und das Perfusat in die Zöliakiearterie geleitet.
  2. Ligate linke Nierengefäße.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.3 für die linken Nierengefäße.
      1. Identifizieren Sie die linken Nierengefäße, indem Sie hellrote und dunkelviolette Gefäße visualisieren, die mit der linken Niere verbunden sind. Dieser Schritt verhindert das Austreten in die Nierengefäße und leitet das Perfusat in die Zöliakiearterie um.
  3. Lizieren Sie die obere Bauchschlagader.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1 bis 2.1.3.
      1. Identifizieren Sie die obere Bauchaorta, indem Sie das hellrote Gefäß in der Mittellinie mit verzweigten Gefäßen der Arteria coeliacus, der Arteria mesenterica superior und der linken Nierengefäße visualisieren. Führen Sie eine Ligatur oberhalb der Zöliakiearterie durch, um die Leckage durch die obere Bauchaorta zu reduzieren und den Fluss zur Zöliakiearterie und schließlich zur Bauchspeicheldrüse sicherzustellen.
  4. Ligate rechte Nierengefäße.
    1. Bewegen Sie den Darm nach links vom Tier. Kneifen Sie das Gewebe/Fett, das die rechte Niere umgibt, als Hebel ein, um die richtigen Nierengefäße zu identifizieren.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1 bis 2.1.3.
      1. Identifizieren Sie rechte Nierengefäße, indem Sie violette/dunkelrote Gefäße (beide rechten Nierenvenen mit einer darunter liegenden Arterie, die nicht sichtbar ist) visualisieren, die mit der rechten Niere verbunden sind und sowohl mit der Vena cava inferior als auch mit der Bauchschlagader verbunden sind. Dieser Schritt verläuft parallel zu Schritt 2.2 mit den linken Nierengefäßen, was eine weitere Isolierung der Bauchspeicheldrüse ermöglicht; Seien Sie jedoch vorsichtig bei der Nähe dieses Gefäßes zur unteren Hohlvene.
  5. Lizieren Sie den abdominalen Teil der unteren Hohlvene.
    1. Identifizieren Sie den abdominalen Teil der unteren Hohlvene durch Visualisierung eines größeren violetten Gefäßes mit einer verzweigten Verbindung zur rechten Nierenvene.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1 bis 2.1.3.
      HINWEIS: Dieser Schritt reduziert potenzielle Störfaktoren aus dem Blut, das in die Pfortader gelangt, wo das Perfusat aufgefangen wird.
  6. Ligatieren Sie die untere Bauchaorta vor der Bifurkation (Abbildung 1)
    1. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1 bis 2.1.3.
    2. Nach der Ligatur kurz vor der Bifurkation legen Sie einen Nahtfaden unter die Aorta etwa 0,5 cm oberhalb des ersten Knotens. Verwenden Sie diesen Nahtfaden, um die Kanüle an Ort und Stelle zu binden.
    3. Nutzen Sie den Raum zwischen dem Nahtfaden und der ligierten Naht, um den Schlauch für die Kanülierung einzuführen. Diese Ligatur stellt sicher, dass Perfusat durch die untere Bauchschlagader in Richtung der Zöliakiearterie fließt.
  7. Lilaminieren Sie die Pfortader (Abbildung 2)
    1. Bewegen Sie den Darm nach links vom Tier, um die Pfortader richtig sichtbar zu machen.
    2. Schaffen Sie einen Schnitt in das Zwerchfell und die Rippen, um bei Bedarf mehr Platz für die Sicht auf die Pfortader zu schaffen und eine angemessene Traktion für die Ligatur und Kanülierung zu ermöglichen.
    3. Lizieren Sie das Gefäß so hoch wie möglich (näher an der Leber), um Platz für eine spätere Kanülierung zu haben.
    4. Platzieren Sie eine zweite Naht unterhalb der ersten, aber oberhalb der Bauchspeicheldrüse. Schritt 2.7.2 führt dazu, dass das Subjekt verstirbt. Darüber hinaus ist dieser Schritt wichtig, um das Auffangen von Perfusat zu ermöglichen und einen möglichen Rückfluss oberhalb des Kanülenpunkts zu verhindern.

3. Kanülierung

  1. Kanülieren Sie die untere Bauchaorta.
    1. Setzen Sie mit einer Schere einen 0,5-1,5 mm großen Schnitt in die untere Bauchschlagader zwischen dem unteren Knoten und der oberen Naht.
    2. Führen Sie den Schlauch mit dem untersten Knoten als Hebel über die Kerbe in die Aorta ein, bis er die überlegenere Naht erreicht. Pass auf, dass du nicht reißt.
    3. Binden Sie die überlegenere Naht zu einem Knoten, um den Schlauch zu fixieren.
      HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht es, dass das Perfusat in das geschlossene System gelangt. Wenn die Ligaturen an Ort und Stelle sind, sollte das Perfusat vom Eintrittspunkt in der unteren Bauchaorta zur Arteria coeliacus gelangen, dann zu den Pankreasgefäßen und schließlich zur hepatischen Pfortader, wo das Perfusat gesammelt werden kann.
  2. Kanülieren Sie die Pfortader.
    1. Setze einen 0,5-1 mm großen Schnitt in die Pfortader, kurz nachdem die Pfortader die Bauchspeicheldrüse verlassen hat.
    2. Halten Sie den oberen Knoten als Hebel mit einer stumpfen Pinzette in einer Hand und führen Sie den Schlauch mit einer Pinzette in die Pfortader ein, um den Schlauch mit der anderen Hand zu greifen.
    3. Verwenden Sie die zweite Naht, um den Schlauch an Ort und Stelle zu binden, wenn möglich.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist der Endpunkt des geschlossenen Systems, an dem das Perfusat mit dem Aufprall der Bauchspeicheldrüse auf die vorhandene Flüssigkeit austreten sollte.

4. Sammlung

  1. Führen Sie die Perfusion durch.
    1. Stellen Sie vor dem Platzieren des Schlauchs für die untere Bauchaorta sicher, dass das Perfusionssystem begonnen hat und das Perfusat mit der gewünschten Geschwindigkeit (~2 ml/min) fließt.
      HINWEIS: Das Perfusat sollte aus der Pfortaderkanüle in einen Entnahmeschlauch abfließen. Zur einfacheren Lagerung kann ein Polymerase-Kettenreaktions-Röhrchen (PCR) verwendet werden. Bei den hier verwendeten Perfusatlösungen handelt es sich um 2,6 mM Glucose mit 1,2 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), 16,8 mM Glucose und 2,6 mM Glucose mit 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) in Krebs-Ringer Bicarbonatpuffer (KRB, 16 mM HEPES und 0,1% BSA, pH 7,4). Die Perfusatlösung begann mit einer glukosearmen Lösung auf hohe Glukose, zurück auf niedrige Glukose und endete mit einer IBX-Lösung zur Kontrolle.
  2. Sammle das Perfusat.
    1. Sammeln Sie das Perfusat in 30-Minuten-Intervallen in PCR-Röhrchen (alle 3 Minuten werden die Röhrchen ausgetauscht).
    2. Wechseln Sie nach jedem 30-Minuten-Intervall die Lösung.
    3. Führen Sie mit den Proben einen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) durch. Dies kann bei entsprechender Lagerung zu einem späteren Zeitpunkt erfolgen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse nach ELISA sollten eine Insulinsekretion aus der Bauchspeicheldrüse der Maus in einem Ausmaß zeigen, das von den Perfusatglukosespiegeln abhängt. Aufgrund der Neuartigkeit dieses Verfahrens bei Mäusen hängt die Analyse des Ergebnisses und seines Erfolgs vom Vergleich mit mehreren anderen Versuchen mit einer perfundierten Bauchspeicheldrüse von Mäusen ab. Eine zweiphasige Insulinreaktion auf eine hohe Glukosekonzentration gilt als physiologisch, wie sie am Menschen und mit I...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Das oben skizzierte Protokoll zielt darauf ab, ein geschlossenes System zu schaffen, das aus der intakten Bauchspeicheldrüse, zwei Eingängen (Zöliakie und Arteria mesenterica superior) und einem Ausgang (Leberpfortader) besteht. Alle anderen Gefäße sind ligiert, um ein Auslaufen beim Durchströmen von Perfusat zu verhindern und um die Isolierung der Bauchspeicheldrüse selbst mit ihrer Mikroumgebung zu gewährleisten. Die Ligaturschritte in diesem Protokoll ermöglichen auch den Fluss des Pe...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Danksagungen

Die Autoren danken Christopher Cahill, Jennifer Hollister-Lock, Drs. Susan Bonner-Weir, Kanako Iwasaki, Francesko Hela und Priscila Carapeto für hilfreiche Beratung, technische Unterstützung und Mentoring während dieses Projekts. Diese Forschung wurde durch das Stipendium NIDDK R01 DK132535 unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fasermembran-OxygenatorHarvard-Apparatur73-3757Ermöglicht das Eindringen von Sauerstoff in das Perfusat
HeizkissenBraintree wissenschaftlich39OM
Ketamin/XylazinPatterson Veterinärmedizin78908598
MagnettafelBraintree wissenschaftlich39OM
Magnete mit GummibändernBraintree wissenschaftlich39OM
MikroskopieN/AN/AKein bestimmtes Unternehmen
SauerstoffflascheN/AN/AKein bestimmtes Unternehmen
PCR-RöhrchenThermoFisher/InvitrogenAM12225Wird für die Perfusatsammlung verwendet
PE-30 RohrBraintree wissenschaftlichPE30
PE-50 RohrBraintree wissenschaftlichPE50
Peristaltische PumpeN/AN/AKein bestimmtes Unternehmen
Chirurgische InstrumenteN/AN/AKein bestimmtes Unternehmen
NahtN/AN/AKein bestimmtes Unternehmen

Referenzen

  1. Rosenberg, L., Wang, R., Paraskevas, S. Structural and functional changes resulting from islet isolation lead to islet cell death. Surgery. 126 (2), 393-398 (1999).
  2. Paraskevas, S., et al. Apoptosis occurs in freshly isolated human islets under standard culture conditions. Transplant Proc. 29 (1-2), 750-752 (1997).
  3. Bottino, R., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
  4. Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol. 12, 667170(2021).
  5. Jansson, L., Carlsson, P. -O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
  6. Leibiger, I. B., Berggren, P. -O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Mol Metab. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  7. Weir, G. C., Atkins, R. F., Martin, D. B. Glucagon secretion from the perfused rat pancreas following acute and chronic streptozotocin. Metabolism. 25 (11 Suppl), 1519-1521 (1976).
  8. Pisania, A., et al. Quantitative analysis of cell composition and purity of human pancreatic islet preparations. Lab Invest. 90 (11), 1661-1675 (2010).
  9. Weir, G. C., Leahy, J. L., Braunstein, L. P. Characteristics of insulin and glucagon release from the perfused pancreas, intact isolated islets, and dispersed islet cells. Horm Res. 24 (1), 62-72 (1986).
  10. Fathi, I., Goto, M. Collagenases in Pancreatic Islet Isolation. Transplantation, Bioengineering, and Regeneration of the Endocrine Pancreas. , Elsevier Academic Press. (2019).
  11. Heiser, A., Ulrichs, K., Müller-Ruchholtz, W. Isolation of porcine pancreatic islets: low trypsin activity during the isolation procedure guarantees reproducible high islet yields. J Clin Lab Anal. 8 (6), 407-411 (1994).
  12. Basir, I., et al. Improved outcome of pig islet isolation by Pefabloc inhibition of trypsin. Transplant Proc. 29 (4), 1939-1941 (1997).
  13. White, S. A., et al. A preliminary study of the activation of endogenous pancreatic exocrine enzymes during automated porcine islet isolation. Cell Transplant. 8 (3), 265-276 (1999).
  14. Lakey, J. R. T., et al. Serine-protease inhibition during islet isolation increases islet yield from human pancreases with prolonged ischemia. Transplantation. 72 (4), 565-570 (2001).
  15. Rose, N. L., Palcic, M. M., Helms, L. M. H., Lakey, J. R. T. Evaluation of Pefabloc as a serine protease inhibitor during human-islet isolation. Transplantation. 75 (4), 462-466 (2003).
  16. Cross, S. E., et al. Collagenase penetrates human pancreatic islets following standard intraductal administration. Transplantation. 86 (7), 907-911 (2008).
  17. Balamurugan, A. N., et al. Harmful delayed effects of exogenous isolation enzymes on isolated human islets: relevance to clinical transplantation. Am J Transplant. 5 (11), 2671-2681 (2005).
  18. Li, W. Functional analysis of islet cells in vitro, in situ, and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 103, 14-19 (2020).
  19. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nat Protoc. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  20. Cohrs, C. M., et al. Bridging the gap: pancreas tissue slices from organ and tissue donors for the study of diabetes pathogenesis. Diabetes. 73 (1), 11-22 (2024).
  21. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525(2020).
  22. Wargent, E. T. Measurement of insulin secretion using pancreas perfusion in the rodent. Methods Mol Biol. 2076, 281-297 (2020).
  23. Tamayo, A., et al. Pericyte control of blood flow in intraocular islet grafts impacts glucose homeostasis in mice. Diabetes. 71 (8), 1679-1693 (2022).
  24. Yuan, L., Li, Y., Li, G., Song, Y., Gong, X. Ang(1-7) treatment attenuates β-cell dysfunction by improving pancreatic microcirculation in a rat model of type 2 diabetes. J Endocrinol Invest. 36 (11), 931-937 (2013).
  25. Carlsson, P. -O., Berne, C., Jansson, L. Angiotensin II and the endocrine pancreas: effects on islet blood flow and insulin secretion in rats. Diabetologia. 41 (2), 127-133 (1998).
  26. Penhos, J. C., et al. A rat pancreas-small gut preparation for the study of intestinal factor(s) and insulin release. Diabetes. 18 (11), 733-738 (1969).
  27. Ma, Y. H., et al. Differences in insulin secretion between the rat and mouse: role of cAMP. Eur J Endocrinol. 132 (3), 370-376 (1995).
  28. Aynsley-Green, A., Biebuyck, J. F., Alberti, K. G. Anaesthesia and insulin secretion: the effects of diethyl ether, halothane, pentobarbitone sodium and ketamine hydrochloride on intravenous glucose tolerance and insulin secretion in the rat. Diabetologia. 9 (4), 274-281 (1973).
  29. Chen, H., Li, L., Xia, H. Diabetes alters the blood glucose response to ketamine in streptozotocin-diabetic rats. Int J Clin Exp Med. 8 (7), 11347-11351 (2015).
  30. Lehmann, R., et al. Effects of ketamine sedation on glucose clearance, insulin secretion and counterregulatory hormone production in baboons (Papio hamadryas). J Med Primatol. 26 (6), 312-321 (1997).
  31. Sharif, S. I., Abouazra, H. A. Effect of intravenous ketamine administration on blood glucose levels in conscious rabbits. Am J Pharm Toxicol. 4 (2), 38-45 (2009).
  32. Komatsu, M., Takei, M., Ishii, H., Sato, Y. Glucose-stimulated insulin secretion: a newer perspective. J Diabetes Investig. 4 (6), 511-516 (2013).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

PankreasperfusionMaus VaskulaturMessung der InsulinsekretionPankreasinselnperfundiertes M usepankreasGef ligaturKanulationstechnikInsulin ELISA
Glukosestimulierte Insulinsekretion über Perfusion durch das Gefäßsystem der Maus mit intakter Bauchspeicheldrüse
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.