Methodenartikel

Ein kardiales mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Ca2+ -Ausbreitung durch nicht-genetische optische Stimulation

DOI:

10.3791/67823

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21. März 2025

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1Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milano-Bicocca, 2Center for Nano Science and Technology, Istituto Italiano di Tecnologia, 3Disease Biophysics Group, John A. Paulson School of Engineering and Applied Science, Harvard University, 4Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering “Giulio Natta”, Politecnico di Milano, 5Department of Physics, Politecnico di Milano, 6Department of Physics and Astronomy, University of Bologna

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Steuerung von Herzzellen und -gewebe mit Licht ermöglicht eine berührungslose Stimulation, wodurch der natürliche Zustand und die Funktion der Zellen erhalten bleiben, was sie zu einem wertvollen Ansatz sowohl für die Grundlagenforschung als auch für therapeutische Anwendungen macht.

Zusammenfassung

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In-vitro-kardiale mikrophysiologische Modelle sind äußerst zuverlässig für die wissenschaftliche Forschung, Arzneimittelentwicklung und medizinische Anwendungen. Obwohl diese Systeme von der wissenschaftlichen Gemeinschaft weitgehend akzeptiert werden, sind sie aufgrund des Fehlens nicht-invasiver Stimulationstechniken immer noch in ihrer Langlebigkeit begrenzt. Phototransducer bieten eine effiziente Stimulationsmethode, die einen drahtlosen Ansatz mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung bietet und gleichzeitig die Invasivität in Stimulationsprozessen minimiert. In diesem Manuskript stellen wir eine vollständig optische Methode zur Stimulierung und Detektion der Aktivität eines in vitro kardialen mikrophysiologischen Modells vor. Konkret haben wir technisch hergestellte laminare anisotrope Gewebe hergestellt, indem wir humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) ausgesät haben, die in einer 3D-Bioreaktor-Suspensionskultur erzeugt wurden. Wir verwendeten einen Photowandler, ein amphiphiles Azobenzol-Derivat namens Ziapin2, zur Stimulation und einen Ca2+ -Farbstoff (X-Rhod 1) zur Überwachung der Reaktion des Systems. Die Ergebnisse zeigen, dass Ziapin2 dieCa2+ -Reaktionen im verwendeten System photomodulieren kann, ohne die Integrität, Lebensfähigkeit oder das Verhalten des Gewebes zu beeinträchtigen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass der lichtbasierte Stimulationsansatz eine ähnliche Auflösung im Vergleich zur elektrischen Stimulation, dem aktuellen Goldstandard, bietet. Insgesamt eröffnet dieses Protokoll vielversprechende Perspektiven für die Anwendung von Ziapin2 und der materialbasierten Photostimulation in der Herzforschung.

Einleitung

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Die Verwendung von Licht zur Stimulation lebender Zellen und Gewebe entwickelt sich zu einem bedeutenden Wendepunkt in der biomedizinischen Forschung und bietet berührungslose Stimulationsmöglichkeiten mit präziser zeitlicher und räumlicher Auflösung 1,2,3,4,5,6. Eine der führenden Techniken, um Zellen lichtempfindlich zu machen, ist die Optogenetik, bei der Zellen genetisch so verändert werden, dass sie lichtempfindliche Ionenkanäle oder Pumpen exprimieren 7,8. Dieser Ansatz hat eine beeindruckende Wirksamkeit bei der Regulierung von Zellen im lebenden Gewebe gezeigt. Die Abhängigkeit vom viralen Gentransfer hat jedoch seine breite Einführung in Forschung und klinischen Anwendungen behindert.

Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden organische und anorganische Materialien als lichtempfindliche Wandler verwendet, um nicht-genetische, materialbasierte lichtvermittelte Stimulationstechniken zu entwickeln 9,10. Organische nanostrukturierte Photowandler 11,12,13,14,15 haben kürzlich bemerkenswerte Erfolge bei der Auslösung zellulärer Reaktionen in verschiedenen Anwendungen gezeigt, einschließlich Neuronen, Kardiomyozyten und Skelettmuskelzellen.

Hier schlagen wir Ziapin2 16,17,18, ein Azobenzolderivat, zur Untersuchung der Ca2+-Ausbreitung in manipulierten laminaren Herzgeweben vor. Die amphiphile Struktur des Moleküls ermöglicht ein präzises Targeting der Plasmamembran der Zelle, während der Azobenzolkern eine lichtinduzierte Isomerisierung ermöglicht, die zu einer Konformationsänderung führt 16,17,18. In Herzzellen verändert diese trans-to-cis-Isomerisierung die Dicke der Plasmamembran und induziert eine Kaskade von Effekten, die ein Aktionspotential erzeugt, das wiederum den Erregungs-Kontraktionsprozess auslöst 19,20,21.

Darüber hinaus beschreiben wir den Herstellungsprozess einer technischen Plattform für das anisotrope Wachstum von Herzgewebe22 und beschreiben detailliert den experimentellen Aufbau, der zur optischen Auslösung und Überwachung seiner Aktivität verwendet wird, mit besonderem Fokus auf die Erfassung der Ca2+-Dynamik innerhalb des Gewebes23,24. Schließlich vergleichen wir die erfassten Signale mit denen, die durch elektrische Stimulation erhalten werden, die als Referenzstandard gilt. Insgesamt unterstreicht dieses Protokoll die Anwendung eines neuartigen lichtempfindlichen Schallkopfs zur Verbesserung unseres Verständnisses des zellulären Verhaltens des Herzens, insbesondere im Zusammenhang mit manipulierten Geweben.

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Protokoll

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Bei der verwendeten humanen pluripotenten Stammzellkultur (hiPSC) handelt es sich um eine humane humane männliche iPSC-Linie, die ein Doxycyclin (Dox)-induzierbares CRISPR/Cas9-System enthält, das durch die Einführung von CAGrtTA::TetO-Cas9 in den AAVS1-Locus (Addgen: #73500) erzeugt wurde. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den vom Boston Children's Hospital Institutional Review Board genehmigten Protokollen durchgeführt. Die Einverständniserklärung der Patienten wurde vor ihrer Teilnahme an der Studie eingeholt. Die Erzeugung von hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) wurde, wie zuvor beschrieben, induziert25,26. Das Protokoll soll im folgenden Abschnitt kurz zusammengefasst werden:

1. Erzeugung und Aufbereitung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

  1. HiPSCs, die in T75-Kolben kultiviert werden, werden einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen werden abgelöst, indem sie 10-15 Minuten lang mit dem Chelatbildner Versen inkubiert und in Bioreaktorgefäße eingesät werden, die mit einer 1%igen Lösung eines nichtionischen Tensids bei einer Dichte von 50 Millionen IPSCs/Gefäß in 100 ml E8-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632, vorbehandelt sind.
  2. Stellen Sie die folgenden Bioreaktorparameter ein: Rühren 60 U/min, Temperatur 37 °C, pH 7 und Überlagerungsbegasung (O2 und CO2) bei 3 Standard-L/h.
  3. Bestätigen Sie nach 1 Tag in Kultur, dass der Durchmesser des Embryoidkörpers (EB) 100-300 μm erreicht hat, und behandeln Sie die Zellen mit basischem RPMI-Medium (RPMI 1640-Medium, ergänzt mit B27 minus Insulin), das 7 μM CHIR99021 für 24 h enthält, gefolgt von einem Medienwechsel auf RPMI für weitere 24 Stunden. Geben Sie für weitere 48 h basisches RPMI-Medium mit 5 μM IWR-1-endo hinzu, um den Differenzierungsprozess in Richtung der kardialen Linie zu starten. Wechseln Sie nach 48 Stunden das Medium wieder auf die Basis-RPMI.
  4. Am 7. Tag der Differenzierung wurden die Kulturzellen in einem basischen RPMI-Medium mit 1:1.000 (v/v) Humaninsulin ergänzt. Aktualisieren Sie das Medium alle 2 Tage oder täglich mit einem Medienwechsel von 50 %, wenn der Sauerstoffverbrauch mehr als 30 % erreicht.
  5. An Tag 15 dissoziieren Sie die Bioreaktorzellen 3 h lang enzymatisch mit einer Kollagenase II-Lösung, die HBSS, Kollagenase II (200 Einheiten/ml), HEPES (10 mM), ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 μM) und N-Benzyl-p-toluolsulfonamid (BTS, 30 μM) enthält. Dazu werden die differenzierten hiPSC-CM EBs zunächst 2x mit vorgewärmtem HBSS gewaschen und in Kollagenase II Lösung (200 μl Volumen EB / 12 ml Collagenase II Lösung) bei 37 °C in 5% CO2 inkubiert, bis einzelne Zellen aus der vollständigen EB-Dissoziation erscheinen.
  6. Stoppen Sie die Dissoziationsreaktion, indem Sie der Einzelzellsuspension ein gleiches Volumen Blockierungspuffer (RPMI-1640 ohne B27 und DNase II, mit 6 μl DNase II pro ml RPMI-1640) zusetzen. Zählen Sie die differenzierten hiPS-CMs, zentrifugieren Sie sie (200 × g, 5 min) und bereiten Sie sie für nachgelagerte Anwendungen vor, indem Sie die Zellen 24 Stunden lang bei -80 °C in Isopropanol einfrieren und in Flüssigstickstofftanks umfüllen, bis die Aussaat durchgeführt wird.

2. Technische Herstellung von laminarem Gewebe

  1. Kleben Sie zwei Schichten Laborklebeband, eine weiße und eine blaue, auf eine 1 mm starke, klare, kratz- und UV-beständige Acrylplatte. Schneiden Sie mit einem CO2 -Lasergravierer die Acrylplatte in Kreise (20 mm Durchmesser für die 12 MW) und das Chipmuster (3 x 7,5 mm Quadrate, drei pro Chip) auf das Band, wie es in einer Vektorgrafiksoftware (z. B. CorelDraw) entworfen wurde. Acryl-Schneidparameter: 100 Leistung, 20 Geschwindigkeit und 1.000 PPI; Parameter für das Schneiden des Bandes: 8 Leistung, 6 Geschwindigkeiten und 1.000 PPI. Entfernen Sie die beiden Schichten Klebeband in der innersten Linie mit einer Pinzette, weichen Sie die Chips 30 Minuten bis 1 Stunde lang in reinem Bleichmittel ein, um dicke Linien und dunkle Flecken vom Schneiden zu entfernen, und hinterlassen Sie eine scharfe Linie, und spülen Sie die Chips in einem Becherglas über Nacht oder mindestens 3 Stunden lang mit fließendem deionisiertem (DI) Wasser ab.
    HINWEIS: Nicht länger als 2 Stunden bleichen, da dies die Klebstoffe auf den Seitenwänden ätzt und verhindert, dass Gelatine richtig haftet.
  2. Beschallen Sie die Chips 10 Minuten lang und die Polydimethylsiloxan-Stempel (PDMS, Sylgard 184) mit Linienrillenmerkmalen (25 μm Rillenbreite, 4 μm Rillenbreite und 5 μm Rillentiefe) für 30 Minuten in sauberem 70%igem Ethanol. Bringen Sie die Chips und Stempel in einen sauberen Bereich unter einer Haube und lassen Sie sie ~1-2 h unter Luftstrom trocknen.
  3. Wiegen Sie 1 g Gelatine aus Schweinehaut (Gelstärke ~175 g Bloom, Typ A) in ein 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 5 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu und mischen Sie gründlich, um eine sofortige Auflösung der Gelatine zu gewährleisten. Legen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang in ein 65 °C heißes Wasserbad, um den Auflösungsprozess abzuschließen. Wiegen Sie auf ähnliche Weise 1 g mikrobielle Transglutaminase (MTG) in ein separates 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 12,5 ml PBS hinzu, mischen Sie gründlich und legen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang in ein 37 °C heißes Wasserbad, um eine vollständige Auflösung des MTG zu gewährleisten.
  4. Beschallen Sie das Gelatineröhrchen 15 Minuten lang und stellen Sie es dann vor Gebrauch wieder in das 65 °C warme Wasserbad. Legen Sie das MTG-Röhrchen mit leicht gelockerter Kappe in einen Exsikkator und schalten Sie das Vakuum langsam ein. Beobachten Sie, wie die Blasen unter Vakuum aus der MTG-Lösung entfernt werden. Nach der Entgasung stellen Sie das MTG-Rohr wieder in das 37 °C warme Wasserbad.
    HINWEIS: Überwachen Sie den Prozess und stellen Sie das Vakuum ein, um starkes Kochen zu vermeiden.
  5. Decken Sie ein Gitterblatt mit sauberem Parafilm ab, legen Sie die Chips auf das Gitter und halten Sie den Stempel griffbereit. Fügen Sie 5 ml MTG zu den 5 ml Gelatinelösung hinzu und pipetieren Sie vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Pipettieren Sie dann die Gelatine schnell auf den Chip und verwenden Sie so viel, dass die Chipfläche bedeckt ist (jeweils ca. 0,5 ml). Platzieren Sie dann den linienförmigen Stempel PDMS22 (Linienbreite 25 μm, Höhe 5 μm, Abstand 4 μm) darauf und tragen Sie ein Gewicht von 200 g auf, um sicherzustellen, dass die Gelatine parallel zur Längsachse des Gewebes strukturiert ist. Sobald alle Chips geformt sind, decken Sie sie mit einem Glas ab, um Umweltstörungen zu vermeiden, und lassen Sie sie über Nacht vernetzen.
    HINWEIS: Verwenden Sie die gemischte Lösung gelatine-MTG innerhalb von 5 min; Andernfalls wird das Zielmuster aufgrund eines höher vernetzten Zustands der Gelatine verändert.
  6. Übertragen Sie den Chip und das PDMS-Stempelsandwich in eine neue, mit PBS gefüllte P150-Schale und hydratisieren Sie die Gelatine 30 Minuten bis 1 Stunde lang, um die Trennung des PDMS-Stempels vom Chip zu erleichtern. Entfernen Sie überschüssige, ungeformte Gelatine um den Chip herum und geben Sie den sauberen Chip in eine neue P150-Schale, die mit PBS gefüllt ist. Lagern Sie die PDMS-Stempel in 70% Ethanol.
  7. Sterilisieren Sie die Chips, indem Sie sie 10 Minuten lang unter der Haube in Ethanol einweichen.
    HINWEIS: Nicht länger als 10 min in Ethanol einwirken, da sich die Gelatine bei längerer Einwirkung verformen kann.
  8. Übertragen Sie die Chips auf PBS, lassen Sie sie 10 Minuten einweichen und spülen Sie sie 3x aus. Bereiten Sie Beschichtungslösungen vor, indem Sie 20 μg/mL Fibronektin mit 1:100 verdünnter Basalmembranmatrix in Kulturmedien mischen (ca. 0,5 mL pro Well). Die Chips 2 h im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 oder über Nacht bei 4 °C beschichten.
  9. Auftauen und Keimzellen (8 × 105 hiPSC-CMs pro cm2) in RPMI-Medium mit Y-27632 (10 μM) und nach 24 Stunden durch RPMI ohne Y-27632 ersetzen.
  10. Entfernen Sie drei Tage nach der Zellaussaat das weiße Klebeband mit einer Pinzette.

3. Synthese und Anwendung des Phototransducers

HINWEIS: Ziapin2 wurde gemäß einem zuvor veröffentlichten Verfahrensynthetisiert 16,18 und hiPSC-CMs direkt im Kulturmedium verabreicht.

  1. 25 μM Ziapin2 in die Zellkultur geben und bei 37 °C und 5 % CO2 7 min inkubieren.
  2. Überschüssige Moleküle vorsichtig auswaschen und mit frischem Kulturmedium abspülen.

4. Viabilitätsprüfung

HINWEIS: Alamar Blue ist ein Resazurin-basierter Assay, der Zellen durchdringen und als Redoxindikator zur Überwachung der Zellviabilität fungieren kann. Resazurin löst sich in physiologischen Puffern auf, was zu einer tiefblauen Lösung führt, die den Zellen in Kultur direkt zugesetzt wird. Lebensfähige Zellen mit aktivem Stoffwechsel reduzieren Resazurin zu Resofurin, das rosa und fluoreszierend ist.

  1. Plattenzellen in einer 96-Well-Platte, die zuvor mit 20 μg/mL Fibronektin und 1:100 verdünnter Basalmembranmatrix in Kulturmedien beschichtet war. Mischen Sie durch Schütteln und fügen Sie dann aseptisch Alamar Blue in einer Menge von 10 % des Well-Volumens in jede Vertiefung hinzu.
  2. Inkubieren Sie Kulturen mit Alamar Blue für 4 Stunden.
  3. Behandeln Sie die Zellen mit dem Phototransducer and Vehicle (DMSO) wie zuvor beschrieben. Wenden Sie eine Lichtstimulation (1 Hz gepulstes Licht für 1 min) über eine optische Faser (Cyan, 470 nm) an, um den Effekt der Ziapin2-Internalisierung und der Lichtexposition auf die Lebensfähigkeit von hiPSC-CM zu bewerten.
  4. Lesen Sie die Fluoreszenz mit einem Platten-Reader bei Anregung 560 nm und Emission 590 nm.

5. Bewertung der künstlichen Anisotropie laminarer Herzgewebe

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt einen systematischen Ansatz zur Beurteilung der Anisotropie von künstlich hergestelltem laminarem Herzgewebe unter Verwendung von Immunfärbung, konfokaler Mikroskopie und Zellkernanalyse27.

  1. Waschen Sie das Substrat mehrmals mit PBS, bevor Sie es mit 4 % (v/v) Paraformaldehyd mit 0,05 % (v/v) Triton X-100 in PBS für 10 min fixieren.
  2. Blockieren Sie die unspezifische Bindung, indem Sie Proben 30 Minuten lang mit 5 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS inkubieren.
  3. Inkubieren Sie die Proben mit Hoechst (1:500) bei Raumtemperatur für 1 h.
  4. Vor der Montage auf Objektträgern mit einem Anti-Fade-Mittel mit PBS waschen. Lassen Sie die Objektträger über Nacht trocknen und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei 4 °C.
  5. Nehmen Sie Proben mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung auf. Bestimmen Sie die Ausrichtung der Zellen mit OrientationJ Measure28, einem FiJi-Plugin.

6. Optische Mapping-Aufnahmen

HINWEIS: Das optische Mapping wurde nach 5 Tagen in Kultur an hiPSC-CMs durchgeführt, die auf gelatinegeformte Gewebechips gesät wurden.

  1. Um dieses Protokoll zu befolgen, stellen Sie sicher, dass die optische Kartierungsvorrichtung aus einem modifizierten Tandemlinsenmikroskop besteht, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera und der Anregungslichtquelle, einer 200-mW-Quecksilberlampe, ausgestattet ist. Stellen Sie einen dichroitischen Spiegel vor die dafür vorgesehene Ca2+ -Bildkamera, um sicherzustellen, dass das Präparat Anregungslicht ausgesetzt ist, und um die von der Probe emittierte Fluoreszenz zu sammeln.
  2. Die Probe wird mit 2 μM X-Rhod 1, die dem Kulturmedium zugesetzt wurde, 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
    HINWEIS: Setzen Sie die Probe nur während der Bildaufnahme Licht aus, um ein Photobleichen des Farbstoffs zu vermeiden.
  3. Inkubieren Sie den Phototrasducer wie zuvor in Abschnitt 3 beschrieben.
  4. Mit frischem Kulturmedium waschen und die Chips auf phenolrotfreies Medium RPMI 1640 übertragen, das mit B27 minus Insulin versetzt ist.
  5. Legen Sie die Gewebechips in eine temperaturgesteuerte Schüssel und starten Sie die Aufnahme bei physiologischer Temperatur (37 °C), wobei die Bilder mit einer Bildrate von 2,5 Bildern/s aufgenommen werden.
  6. Für die optische Stimulation wenden Sie die optische Punktstimulation an einem Ende des Gewebes mit einer LED-Lichtquelle (465/25 nm) an, die eine Ziapin2-Stimulation ermöglicht. Beschleunigen Sie das Gewebe mit einer Frequenz von 0,5 oder 1 Hz über eine zeitlich regulierte optische Faser, die 1 mm vom Gewebe entfernt positioniert ist. Für die elektrische Stimulation wenden Sie eine Punktstimulation mit einer bipolaren Platinelektrode an, die in der Mitte des distalsten Endes des rechteckigen Gewebes positioniert ist. Diese Platzierung stellt sicher, dass die Ausbreitung der Ca2+ -Welle von der Mitte der Gewebebreite ausgeht, die der kürzeren Seite des Rechtecks entspricht. Die Stimulation sollte bei einer Frequenz von 0,5 Hz, mit einer Amplitude von 10 V und einer Impulsdauer von 100 ms erfolgen.
  7. Wenden Sie nach den Aufnahmen einen räumlichen Filter mit einer Größe von 3 x 3 Pixeln an, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
  8. Bestimmen Sie die Ca2+ -Wellenleitungsgeschwindigkeit an jedem Pixel für jeden Impuls und berechnen Sie die Änderungsrate sowohl in x- als auch in y-Richtung. Messen Sie dazu den räumlichen Gradienten der Intensität des Ca2+ -Signals in diese Richtungen und setzen Sie ihn in Beziehung zur Zeitverzögerung der Ausbreitung des Signals. Durch die Kombination dieser Richtungsänderungsraten können Sie quantifizieren, wie schnell sich die Welle in beiden Dimensionen über das zelluläre Feld ausbreitet.

7. Datenexport und -verarbeitung

  1. Extrahieren und analysieren Sie die Daten mit der referenzierten Software.
  2. Wenden Sie einen räumlichen Filter von 3 x 3 Pixeln an, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
  3. Extrahieren Sie die Ca2+ -Transientenkurven (CaT) als Mittelwert eines bestimmten manuell ausgewählten Region of Interest (ROI).
  4. Messen Sie die CaT-Parameter in einem zentralen Bereich of Interest (ROI) von 50 x 50 Pixeln (≈ 25 mm2).
  5. Analysieren Sie für jeden CaT die CaT-Amplitude, die Anstiegszeit (tPeak), die Zeit der maximalen Abklingneigung (Max Decay Slope) und die Zeit bis zum transienten Abklingen von 90 % (Abklingzeit90).

8. Statistische Auswertung

  1. Beurteilen Sie die Normalverteilung mit einem geeigneten statistischen Test, z. B. einem Normalitätstest, um zu bestimmen, ob parametrische oder nicht-parametrische Methoden angewendet werden sollten.
  2. Bewerten Sie die statistische Signifikanz zwischen zwei Bedingungen mit dem Student's t-Test oder dem Mann-Whitney U-Test für kontinuierliche bzw. kategoriale Daten. Wenn Sie mehr als zwei Gruppen vergleichen, verwenden Sie je nach Datenannahmen eine unidirektionale ANOVA oder den Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von geeigneten Post-hoc-Tests, um signifikante paarweise Unterschiede zu identifizieren.

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Ergebnisse

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Es wurde ein mehrstufiges Verfahren für die Herstellung von künstlich hergestelltem laminarem Herzgewebe unter Verwendung einer Kombination aus Laserstrukturierung, Gelatineformung und Zellaussaattechniken entwickelt und implementiert. Ursprünglich von McCain et al.22 und Lee et al.24 etabliert, wurde diese Technik nach deren Protokollen zur Konstruktion des manipulierten laminaren Mikrogewebes erneut implementiert. Das Verfahren integriert eine präzise laserbasierte Strukt...

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Diskussion

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Dieser Ansatz bietet eine robuste Plattform für die Weiterentwicklung der kardiologischen Forschung und bietet Einblicke in die komplexe Dynamik des Herzgewebes und eröffnet neue Möglichkeiten für kardiomechanistische Langzeitstudien in vitro , die möglicherweise zu neuen therapeutischen Strategien führen könnten. Um den Erfolg dieser Methode zu gewährleisten, ist es entscheidend, eine mikrophysiologische Umgebung zu reproduzieren, die die In-vivo-Bedingungen des mensch...

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Offenlegungen

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CB, GL und FL sind Erfinder des Patents Nr. EP 3802491 (02.07.2020).

Danksagungen

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Die Autoren danken Michael Rosnach für die Abbildungen in Abbildung 1 und Abbildung 3 sowie Prof. William T. Pu für die hiPSC-Versorgung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das NCATS Tissue Chips Consortium (UH3 TR003279) an KKP, das italienische Ministerium für Universitäten und Forschung durch das Projekt PRIN 2022 (ID 2022-NAZ-0595) an FL, das Projekt PRIN 2020 (ID 2020XBFEMS) an CB und GL und das Projekt Fondo Italiano per la Scienza (ID FIS00001244) an GL.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
alamarBlue Cell Viability ReagenzThermo Fisher ScientificDAL1025Cell Viability Assay
B-27 Supplement, minus InsulinThermo Fisher ScientificA1895601Für Zellkulturen
Rinderserum AlbuminSigma-AldrichA9056-50GFür die Zellfärbung
BrainVision Analyzer Software Brain Productshttps://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/Datenexport und -handhabung
BTSSigma203895-5MG
CHIR99021Stem Cell Technologies72054
Klare kratz- und UV-beständige Acrylplatte, 12" x 12" x 0,01 ZollMcMaster Carr4076N11Herstellung von Gewebechips
Kollagenase Typ II WorthingtonCLS-2 / LS004176
DNase IIVWR89346-540
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Für Zellkulturen
FibronektinVWR47743-654Beschichtung
Gelatine aus Schweinehaut Gel Stärke 175 Typ ASigma-AldrichG2625-100GHerstellung von Gewebechips
Geltrex LDEV-Frei, hESC-qualifiziert, Basalmembran-Matrix mit reduziertem WachstumsfaktorThermo Fisher ScientificA1413302Beschichtung
HBSS Thermo Fisher14175-095
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
Hoechst 33342 Life technologiesH1399Für die Zellfärbung
Insulinlösung humanSigma AldrichI9278-5ML
IWR-1-endoStem Cell Technologies72564
Paraformadehyde 16% wässrige Lösung (PFA)VWR100503-917Für die Zellfärbung
PBS, steril, 500 mLThermo Fisher Scientific10010049Herstellung von Gewebechips
phosphatgepufferte KochsalzlösungThermo Fisher Scientific10010049
Pluronic F-127 (20%ige Lösung in DMSO)Thermo Fisher ScientificP3000MPNichtionisches Tensid
ROCK-Inhibitor Y-27632Stem Cell Technologies72304
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific61870127Für die Zellkultur
RPMI 1640 Medium, kein PhenolrotThermo Fisher Scientific11835030Optisches Mapping
Versene SolutionThermo Fisher Scientific15040066Chelatbildner
VWR Allzweck-Labor-BeschriftungsbandVWR89098-058Herstellung von Gewebechips
X-Rhod-1 AMThermo Fisher ScientificX14210Optisches Mapping

Referenzen

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