Iteratives Bleaching erweitert die Multiplizität durch den Einsatz von Färbeautomatisierung für Core-Anlagen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Anwendung der Iterative Bleaching Extends Multiplicity (IBEX) Methode unter Verwendung kommerziell verfügbarer, automatisierter Gewebefärbegeräte und Optimierungsüberlegungen für die Verwendung von Tyramid-Signalamplifikations-basierten Reagenzien.

Zusammenfassung

Iterative Bleaching Extends Multiplicity (IBEX) ist ein hochempfindliches, auf Tyramid-Signalamplifikation (TSA) basierendes Mehrrunden-Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren, das eine detaillierte Untersuchung zahlreicher Proteinbiomoleküle in einer einzigen Gewebeprobe durch wiederholtes Bleichen, erneutes Färben und Co-Registrierung von Bildern ermöglicht. Trotz seiner zunehmenden Akzeptanz für die Erzeugung von hochmultiplexierten Immunfärbungen bietet die automatisierte Implementierung von IBEX durch den Einsatz in Kernanlagen zahlreiche Vorteile, darunter einen höheren Durchsatz, eine höhere Reproduzierbarkeit und die Gesamteffizienz des Laborpersonals. Hier demonstrieren wir die erfolgreiche Anwendung von IBEX auf zwei weit verbreiteten Autostainer-Plattformen und diskutieren wichtige Optimierungsüberlegungen für das Paneldesign mit TSA-basierten Reaktionen für formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Gewebeproben. Dazu gehört auch die Methodik zum Testen der Antikörper-Antigen-Retrieval-Sensitivität, ein wichtiger Aspekt für das IBEX-Panel-Design bei der Bestimmung der Sequenz der Antikörperentwicklung. Darüber hinaus stellen wir nachgelagerte Bildgebungsansätze unter Verwendung kommerziell erhältlicher Ganzobjektträgerscanner vor und veranschaulichen die Qualitätsausrichtung und -analyse mit kommerziell erhältlicher Zellphänotypisierungssoftware. Durch detaillierte Beschreibungen dieser Methoden und begleitende Videos möchten wir die Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit von IBEX hervorheben und bieten praktische Anleitungen für zentrale Pathologieeinrichtungen zur Integration von IBEX in ihre bestehenden automatisierten Färbeplattformen.

Einleitung

Iteratives Bleaching Extends Multiplicity (IBEX) ist ein bedeutender Fortschritt in der hochempfindlichen TSA-basierten, fluoreszierenden Mehrrunden-Immunhistochemie, die eine detaillierte Visualisierung und Quantifizierung zahlreicher Biomoleküle in einer einzigen Gewebeprobe ermöglicht. Durch den Einsatz wiederholter Zyklen von Bleichen und erneutem Färben ermöglicht IBEX die Untersuchung komplexer zellulärer Umgebungen mit beispielloser Tiefe und Klarheit, was es zu einem leistungsstarken Werkzeug auf dem Gebiet der Immunfärbung und Multiplex-Bildgebung macht ^1,2.

Viele akademische, staatliche und industrielle Einrichtungen verfügen über zentrale Pathologieeinrichtungen, die sich der Unterstützung einer Vielzahl gewebebasierter Forschungsmethoden widmen, die auf die Generierung qualitativer und quantitativer morphomolekularer Datensätze abzielen. Diese Kerne sind wichtige Ressourcen, da sie spezialisierte gewebebasierte Dienstleistungen bieten, die es Forschungslabors ermöglichen, komplexe und arbeitsintensive molekularpathologische Prozesse auszulagern und sich bei der Studiengestaltung, der Assay-Entwicklung und der Dateninterpretation direkt mit Pathologen zu beraten. Um Konsistenz zu gewährleisten und die Variabilität zwischen den Experimenten zu reduzieren, verlassen sich diese Core Facilities routinemäßig auf kommerziell erhältliche Autostainer-automatisierte Instrumente, die für die Durchführung standardisierter Färbeprotokolle mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz ausgelegt sind³.

Während Autostainer zum Rückgrat der Immunfärbung in Core-Anlagen geworden sind und einen hohen Durchsatz und konsistente Ergebnisse ermöglichen, wurden sie noch nicht an neuere Entwicklungen wie IBEX angepasst. Darüber hinaus fügt der Bedarf an Spezialwissen im Panel-Design, insbesondere bei der Verwendung von Tyramid-Signalverstärkung (TSA)-basierten Reagenzien⁴, eine zusätzliche Komplexitätsebene hinzu, die die breitere Einführung von IBEX in routinemäßigen Forschungsabläufen einschränkt. Infolgedessen sind Forscher, die die hochauflösenden, gemultiplexten Bildgebungsfunktionen von IBEX nutzen möchten, oft durch die vorhandene Ausrüstung ihrer Kerneinrichtungen eingeschränkt. Diese Lücke zwischen innovativen bildgebenden Verfahren und der praktischen Realität des Betriebs der Core Facility stellt ein Hindernis für die breitere Einführung von IBEX in der akademischen Forschung dar. Diese Arbeit zielt darauf ab, dieses Hindernis zu überwinden, indem sie die erfolgreiche Anwendung von IBEX auf gängigen Autostainer-Plattformen demonstriert, wobei der Schwerpunkt auf der Verwendung von TSA-basierten Reagenzien unter Verwendung von formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Geweben liegt. Wir besprechen zunächst die Schritte, die notwendig sind, um eine IBEX-Platte mit TSA-basierten Farbstoffen zu bauen, und das Aufbringen dieser Platten auf zwei verschiedene kommerziell erhältliche Autostainer. Zusammengenommen bietet dies eine praktische Anleitung zu Sensitivitätstests für Antikörper-Antigen-Retrieval, die Erörterung wichtiger Überlegungen zur Optimierung des Panel-Designs und die Bereitstellung einer alternativen Methode für die Panel-Ausrichtung mit kommerzieller Software, die möglicherweise verfügbar ist, und über zentrale Pathologielabore.

Protokoll

1. Bau von IBEX-Platten mit TSA-basierten Farbstoffen

HINWEIS: Verwenden Sie immer ein frisches Präparat aus Antikörpern und Farbstoffen und lagern Sie es bei 4 °C, wenn es nicht verwendet wird.

1. Sensitivitätstests zur Antigengewinnung
   1. Vorbereitung der Objektträger
      1. Verwenden Sie ein Mikrotom, um drei serielle Abschnitte für jeden Antikörper zu sammeln, um es aus demselben FFPE-eingebetteten Gewebe auf drei separate, positiv geladene Objektträger zu testen.
      2. Markieren Sie Objektträger mit dem zu testenden Antikörper und der Anzahl der zu testenden Antigen-Entnahmezyklen: 1 Zyklus, 3 Zyklen und 6 Zyklen.
      3. Trocknen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur. Wenn Sie nur mit Oberflächenmarkierern arbeiten, backen Sie die Objektträger mindestens 20 Minuten lang bei 60 ^°C, um das Wachs weicher zu machen. Wenn Sie mit Kernmarkern arbeiten, backen Sie die Objektträger über Nacht bei 60 ^°C.
   2. Bereiten Sie das Programm auf dem Autostainer für die unterschiedliche Anzahl von Zyklen vor und stellen Sie sicher, dass zwischen jedem Schritt drei Waschschritte liegen. In Tabelle 1 finden Sie Beispielprotokolle für 1-, 3- und 6-Zyklus-Tests.
      HINWEIS: Stellen Sie für jeden einzelnen Antikörper eine konsistente Zeit für den Antikörperschritt und die TSA-Farbstoffapplikation sicher.
      Bei der Anwendung von Farbstoffen auf TSA-Basis besteht eine Alternative zum 3-10-minütigen Einwirken des Farbstoffs bei Raumtemperatur darin, den Farbstoff 20 Minuten bei 37 °C inkubieren zu lassen.
   3. Laden Sie die Proben auf den Autostainer und führen Sie das Protokoll für die entsprechende Anzahl von Zyklen aus.
   4. Wiederholen Sie diesen Vorgang von den Schritten 1.1.1 bis 1.1.3 für jeden einzelnen Antikörper, der validiert und getestet werden soll.
   5. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Autostainer und legen Sie sie in PBS.
   6. Montieren Sie die Objektträger mit wässrigen Eindeckmedien (wie bei einer IBEX-Patrone) und einem Deckglas #1,5 für eine optimale Bildgebung.
   7. Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop, um den 1-Zyklus-Objektträger für den TSA-Farbstoff und DAPI abzubilden, und notieren Sie sich die Belichtungszeit, die zur Visualisierung des Signals erforderlich ist.
   8. Wiederholen Sie dies für die Objektträger mit 3 und 6 Zyklen und notieren Sie sich die Belichtungszeit, die zur Visualisierung des TSA-Farbstoffs benötigt wird.
   9. Vergleichen Sie die Belichtungszeiten über die verschiedenen Zyklusnummern hinweg. Beispiele finden Sie in Abbildung 1 . Stellen Sie sicher, dass zwischen allen Schritten drei Waschgänge liegen.
      1. Wenn die Expositionszeit mit zunehmender Zyklenzahl abnimmt, platzieren Sie diesen Antikörper und färben Sie ihn in einem späteren Schritt.
      2. Wenn die Expositionszeit mit zunehmenden Zyklen zunimmt, platzieren Sie diesen Antikörper in einem früheren Schritt.
      3. Wenn sich die Expositionszeit nicht wesentlich ändert, platzieren Sie diesen Antikörper an einem beliebigen Schritt.
      4. Gruppieren Sie Antikörper basierend auf den Zyklusanforderungen für den ersten Durchgang in IBEX-Panels.
         HINWEIS: Um die besten Ergebnisse zu erzielen, führen Sie diese Validierung für alle gewünschten Marker für ein bestimmtes IBEX-Panel durch. Führen Sie diese Validierung jedes Mal durch, wenn Gewebetypen geändert werden oder wenn Sie mit polyklonalen Primärantikörpern mit eindeutigen Chargennummern arbeiten.
2. Adressierung des Durchblutens des Signals von spektral nahegelegenen Farbstoffen durch Bewertung der Signalstärke.
   1. Gruppieren Sie Antikörper in potenzielle IBEX-Panels basierend auf der optimalen Anzahl von Retrieval-Zyklen, wie oben in 1, 3 oder 6 Zyklusgruppen bestimmt wurde.
   2. Vorbereitung der Objektträger
      1. Verwenden Sie ein Mikrotom, um serielle Schnitte aus einer FFPE-Probe zu erstellen, einen für jeden Antikörper, der in einem einzelnen IBEX-Panel verwendet wird.
      2. Markieren Sie jeden Objektträger mit einem der Antikörper, die im IBEX-Panel verwendet werden sollen.
      3. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Wenn Sie nur mit Oberflächenmarkierern arbeiten, lassen Sie die Objektträger mindestens 20 Minuten bei 60 ^°C backen, um das Wachs weicher zu machen. Wenn Sie mit Kernmarkern arbeiten, lassen Sie die Objektträger über Nacht bei 60 ^°C backen.
   3. Verwenden Sie für die Gruppen 1, 3 und 6 Zyklen die Ein-Zyklus-Einrichtung aus Tabelle 1. Stellen Sie sicher, dass zwischen allen Schritten drei Wäschen eingelegt werden
      1. Ändern Sie das Protokoll für jeden Antikörper, der mit der optimalen Färbezeit verwendet werden soll.
      2. Verwenden Sie für alle Antikörper die gleiche TSA-Zeit.
   4. Färben Sie die Proben auf dem Autostainer.
   5. Entnehmen Sie die Proben und legen Sie die Objektträger in PBS.
   6. Montieren Sie die Objektträger mit wässrigen Eindeckmedien (wie bei einer IBEX-Patrone) und einem Deckglas #1,5 für eine optimale Bildgebung.
   7. Bilden Sie die Objektträger auf einem Epifluoreszenzmikroskop ab, wobei Sie für jedes Bild die optimale Belichtungszeit verwenden.
   8. Bestimmen Sie die Signalstärke. Dias mit kurzen Belichtungszeiten haben eine sehr hohe Signalstärke, während Dias mit langer Belichtungszeit eine geringe Signalstärke aufweisen.
   9. Verwenden Sie die Signalstärke zusammen mit der Zyklusnummer, um IBEX-Panels zu entwickeln.
      1. Gruppieren Sie Antikörper basierend auf der Zyklusnummer.
      2. Für eine bestimmte Gruppe von Antikörpern mit einer bestimmten Zyklusnummer ist sicherzustellen, dass ein starkes Signal optisch nicht in der Nähe eines schwachen Signals liegt, um ein Signal-Spillover zu minimieren.
3. Validieren Sie die einzelnen IBEX-Panels, um sicherzustellen, dass jedes Panel das gewünschte Ergebnis erzielen kann.
   1. Bereiten Sie die Folien vor.
      1. Verwenden Sie ein Mikrotom, um serielle Schnitte zu erstellen, einen für jedes Multiplex-IBEX-Panel, und beschriften Sie es mit der zu verwendenden IBEX-Panel-Reihenfolge.
      2. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Wenn Sie nur mit Oberflächenmarkierern arbeiten, lassen Sie die Objektträger mindestens 20 Minuten bei 60 ^°C backen, um das Wachs weicher zu machen. Wenn Sie mit Kernmarkern arbeiten, lassen Sie die Objektträger über Nacht bei 60 ^°C backen.
   2. Richten Sie den Autostainer ein.
      1. Richten Sie für das erste Panel das Autostainer-Programm ohne zusätzliche Schritte zur Antigenentnahme ein.
      2. Für das zweite Panel sind vor dem ersten Antikörper zusätzliche Denaturierungsschritte einzuführen, die der Anzahl der Denaturierungsschritte im ersten Panel entsprechen. In Tabelle 2 finden Sie ein Beispiel für Panel 1 mit fünf Antikörpern und in Tabelle 3 ein Beispiel für Panel 2 mit vier Antikörpern. Stellen Sie sicher, dass zwischen allen Schritten drei Waschschritte liegen.
      3. Wiederholen Sie dies bei Bedarf für weitere IBEX-Platten und fügen Sie weitere Denaturierungsschritte hinzu.
   3. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Autostainer und legen Sie sie bis zur Montage in PBS.
   4. Montieren Sie die Objektträger mit wässrigen Eindeckmedien (wie bei einer IBEX-Patrone) und einem Deckglas #1,5 für eine optimale Bildgebung.
   5. Bilden Sie die Objektträger auf einem Epifluoreszenzmikroskop ab, wobei die optimale Belichtungszeit für jedes Bild und jeden TSA-Farbstoff verwendet wird.
   6. Beurteilen Sie, ob alle Bereiche ordnungsgemäß angezeigt werden. Wenn ja, wechseln Sie zur IBEX-Bildgebung. Ist dies nicht der Fall, richten Sie die Signalausgleichs- und -abrufzyklen neu ein.
      HINWEIS: Einige Anpassungen können innerhalb eines einzigen Panels vorgenommen werden, um das Signal zu optimieren und den "Umbrella-Effekt" zu verhindern. Einige sehr häufig vorkommende Signale können die Färbung von nachgeschalteten Signalen blockieren. Schauen Sie innerhalb einer bestimmten Platte, um zuerst spärlichere Flecken zu verwenden (siehe Abbildung 2).

2. IBEX-Adaption mit Autostainern unter Verwendung von TSA-Reagenzien und Bildgebungsplattformen für ganze Objektträger (Abbildung 3)

HINWEIS: Für einen Vergleich der beiden validierten Autostainer, die in diesem Protokoll verwendet und besprochen werden, siehe Tabelle 4.

1. Bereiten Sie alle Folien für den IBEX-Lauf vor.
   1. Verwenden Sie ein Mikrotom, um FFPE-Schnitte auf einem positiv geladenen Objektträger zu erstellen. Achten Sie darauf, dass Sie für jede Versuchsprobe einen Objektträger, Positivkontrollpräparate von Gewebeschnitten, von denen bekannt ist, dass sie die abzubildenden Antigene enthalten, und einen negativen Kontrollobjektträger, in dem PBS anstelle aller Primärantikörper verwendet wird, beifügen.
      HINWEIS: Wenn Sie in Stapeln arbeiten, fügen Sie ein Stapelkontrollbeispiel hinzu. Eine Chargenkontrollprobe ist ein einzelner FFPE-Gewebeblock, der geschnitten und in jede Charge von Versuchsproben aufgenommen wird, um zur Normalisierung und Kontrolle der experimentellen Variation zwischen den Chargen von Färbeproben verwendet zu werden. Dies ist nur notwendig, wenn nicht alle Proben zusammen verarbeitet werden.
   2. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Wenn Sie nur mit Oberflächenmarkierern arbeiten, lassen Sie die Objektträger mindestens 20 Minuten bei 60 ^°C backen, um das Wachs weicher zu machen. Wenn Sie mit Kernmarkern arbeiten, lassen Sie die Objektträger über Nacht bei 60 ^°C backen.
2. Bereiten Sie Antikörper und Farbstoffe für das erste IBEX-Panel vor, das abgebildet werden soll.
3. Richten Sie das Autostaining-Programm ein. In Tabelle 2 finden Sie ein Beispiel für ein Bedienfeld mit 5 Markierungen. Stellen Sie sicher, dass zwischen jedem Schritt drei Wäschen eingelegt werden.
4. Laden Sie Proben und Antikörper in den Autostainer und führen Sie das Programm zum Färben der Proben aus.
5. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Autostainer und bringen Sie ein Deckglas mit wässrigem Eindeckmedium an, das für die multispektrale Bildgebung geeignet ist, und einem Deckglas #1,5.
6. Bilde die Objektträger innerhalb von 2 Tagen nach dem Färben ab
7. Fluoreszenzbildgebung auf Epifluoreszenz- oder Fluoreszenz-Dia-Scanner
   1. Beginnen Sie mit der gut kontrollierten Positivkontrollprobe und laden Sie die Positivkontrollprobe in das Mikroskop.
      1. Lokalisieren Sie in der Probe ein positives Signal für jedes der verschiedenen Antigene, die abgebildet werden sollen.
      2. Stellen Sie die Belichtungszeit so ein, dass der Dynamikbereich des Flecks erfasst und der Hintergrund minimiert wird, indem Sie mit einer niedrigen Belichtung beginnen und die Belichtungszeit schrittweise erhöhen, bis das Signal vorhanden ist. Mache dies für jeden Farbstoff einzeln.
         HINWEIS: Testen Sie, ob die Marker sowohl eine hohe als auch eine niedrige Ausprägung aufweisen, um sicherzustellen, dass der volle Dynamikbereich erfasst wird.
   2. Speichern Sie die für die Positivkontrollprobe verwendeten Einstellungen und verwenden Sie sie für alle weiteren Bildgebungsschritte.
   3. Laden Sie die Negativkontrollprobe und alle Versuchsproben mit den von der Positivkontrollprobe festgelegten Einstellungen und bilden Sie sie ab.
   4. Stellen Sie sicher, dass die Bilder von optimaler Qualität sind, bevor Sie mit den nachfolgenden Schritten fortfahren.
8. Entfernen des Deckglases
   1. Tauchen Sie die Objektträger in ein Coplin-Glas mit DI-Wasser. Stellen Sie das Coplin-Glas für 15-20 Minuten in ein Wasserbad mit 65 °C, um das natürliche Entfernen des Deckglases zu erleichtern. Wenn ein Eindeckmedium auf wässriger Basis verwendet wird oder das Eindeckmedium vollständig ausgehärtet ist, können Sie Deckgläser alternativ entfernen, indem Sie sie über Nacht in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder DI-Wasser einweichen, damit die Deckgläser auf natürliche Weise abfallen können.
9. Bleaching mit LiBH₄
   1. Bereiten Sie in einem Abzug eine frische Lösung von LiBH₄ in einer Konzentration von 1 mg/ml in VE-Wasser vor. Machen Sie genug, um jede Probe 3x zu bedecken.
      HINWEIS: Bereiten Sie aufgrund der Reaktion von LiBH₄ mit Wasser nicht mehr als 10 ml auf einmal zu. Verwenden Sie DI-Wasser und kein Millipore/Nanoreines Wasser für eine optimale Bleichaktivität.
   2. Lassen Sie die Lösung 20 Minuten ruhen. Es bilden sich Blasen.
   3. Pipettieren Sie 1 ml LiBH_4-Lösung auf jeden Objektträger in einer Färbekammer in einem Abzug. Lassen Sie die Lösung 10-15 Minuten auf dem Objektträger ruhen.
   4. Entfernen Sie das LiBH₄ , indem Sie den Objektträger abpipettieren und ersetzen Sie es durch einen frischen 1 ml LiBH_4. Lassen Sie die Lösung 10-15 Minuten ruhen.
   5. Entfernen Sie das LiBH₄ , indem Sie den Objektträger abpipettieren und ersetzen Sie es durch einen frischen 1 ml LiBH_4. Lassen Sie die Lösung 10-15 Minuten ruhen.
   6. Entfernen Sie das LiBH₄ durch Pipettieren von den Objektträgern und tauchen Sie die Objektträger zur kurzfristigen Lagerung (nicht länger als 1 Tag) in DI-Wasser oder PBS.
   7. Gehen Sie innerhalb eines Tages zur nächsten IBEX-Färberunde über.
   8. Optional: Nassmontage von Objektträgern und schnelle Visualisierung auf einem Epifluoreszenzskop, um den Erfolg des Bleichens zu überprüfen.
10. Nasseinbettung des Objektträgers in den Autostainer und zweiter IBEX-Färbelauf
    1. Bereiten Sie alle Antikörper und TSA-Farbstofflösungen für den Autostainer vor.
    2. Für den Ventana Autostainer:
       1. Wenn Sie bereit sind, mit der Autofärbung zu beginnen, pipettieren Sie ca. 1 ml Autostainer-Waschpuffer auf den Objektträger, um ein Austrocknen der Nasshalterung zu verhindern.
       2. Legen Sie nass montierte Dias in den Autostainer.
    3. Für den Bond Rx:
       1. Platzieren Sie Abdeckkacheln auf Folien.
       2. Pipettieren Sie oben auf der Deckplatte 300 μl Waschpuffer, damit die Lösung in den Raum zwischen der Probe und der Deckplatte fließen kann.
       3. Laden Sie die Proben auf den Autostainer.
    4. Richten Sie das Autostainer-Programm gemäß dem Beispiel in Tabelle 2 ein, wobei N auf die Anzahl der Antikörper im Panel festgelegt ist.
    5. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Autostainer und bringen Sie ein Deckglas mit wässrigem Eindeckmedium an, das für die multispektrale Bildgebung geeignet ist, und einem Deckglas #1,5.
    6. Bilden Sie die Objektträger innerhalb von 2 Tagen nach der Färbung ab, indem Sie das in Schritt 2.7 beschriebene Probenverfahren zum Einrichten der Bildgebungssitzung und zum Sammeln von Bildern befolgen.
    7. Nach der Bildgebung Bleichproben wie in den Schritten 2.8-2.9 beschrieben.
11. Wiederholen Sie den Vorgang für alle gewünschten IBEX-Platten.

3. Analyse der Proben mit kommerziell erhältlicher Software

1. Führen Sie ganze Objektträgerscans der gefärbten Objektträger durch, bevor Sie mit der Ausrichtung fortfahren.
2. Wenn die Software dies zulässt, können Sie die spektrale Entmischung über die in die Scanfunktionen integrierte automatische Entmischung durchführen, einschließlich der Entfernung der Autofluoreszenzspektren. Wenn dies eine Funktion der verwendeten Software ist, wählen Sie die Option zum Entmischen und führen Sie den Vorgang mit den Standardeinstellungen und voreingestellten Farbstoffen aus
   HINWEIS: Benutzerdefinierte Entmischungen können in den meisten Softwareprogrammen generiert werden, die eine Entmischung ermöglichen. Um eine Bibliothek zu erstellen, werden einzelne Gewebeabschnitte, die mit einem einzigen Fluorophor gefärbt wurden, zu den Messungen der Software hinzugefügt. Zur Charakterisierung des Autofluoreszenzspektrums wird auch ein Bereich aus ungefärbtem oder autofluoreszierendem Gewebe gescannt, der mit dem Autofluoreszenzwerkzeug ausgewählt wird. Diese Spektren werden innerhalb des Programms kompiliert, indem Sie auf "Bild vorbereiten" klicken, und dann in eine projektspezifische Entmischungsbibliothek exportiert. Diese Bibliothek wird dann in der Option zum Aufheben der Mischung als Bibliothek zum Aufheben der Mischung ausgewählt.
3. Importieren Sie die gescannten Objektträger zur Ausrichtung in eine handelsübliche Bildanalysesoftware.
4. Objektträgerregistrierung mehrerer IBEX-Runden
   1. Wählen Sie zwei Iterationen von IBEX-Runden aus, die registriert werden sollen.
   2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die beiden und wählen Sie die Option Registrieren .
   3. Wählen Sie die Standardregistrierung mit hochauflösender Registrierung für einen ersten Registrierungsversuch aus.
   4. Alternativ können Sie in den Optionen die Option Einzelkanalregistrierung auswählen und einen einzelnen Kanal auswählen, der über alle IBEX-Läufe hinweg konsistent war.
      HINWEIS: Diese Option ist nützlich für Farbstoffe, die gegen Bleichen beständig sind (siehe Materialien, bei denen Farbstoffe nicht bleichen).
5. Bildausrichtung
   1. Öffnen Sie eines der registrierten Bilder.
   2. Wählen Sie auf der Registerkarte Tools unter Image Registration die Option Registration Tools aus, um alle registrierten Images zu öffnen.
   3. Wählen Sie auf der Registerkarte Registrierungstools die Orientierungsfunktion aus.
   4. Verwenden Sie die Landmark-Funktion , um die Ausrichtung ganzer Folien fein abzustimmen.
      1. Markieren Sie Orientierungspunkte auf einem Folienbild manuell.
      2. Markieren Sie auf den anderen IBEX-Bildern denselben Orientierungspunkt. Das Programm verfeinert die Ausrichtung anhand des identifizierten Orientierungspunkts. Wiederholen Sie diesen Vorgang zur Feinabstimmung der Ausrichtung.
   5. Wenn Sie mit der Ausrichtung zufrieden sind, verschmelzen Sie die Folien mit der Schaltfläche Sicherung | Serial Stain-Funktion.
   6. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen weiteren IBEX-Bildgebungsrunden, bis ein endgültiges Komposit aller Bilder abgeschlossen ist.
6. Bildanalyse
   1. Segmentierung von Zellen
      1. Wählen Sie auf der Registerkarte Analyse das HighPlex-Modul aus, öffnen Sie es und wählen Sie dann das Phänotypisierungsmodul für die Zellidentifikation aus.
         1. Laden Sie alle Marker und beginnen Sie damit, alle Kerne mit der Registerkarte "Nukleare Detektion" im Highplex-Modul zu finden. Laden Sie Marker auf der Registerkarte Farbauswahl . Identifizieren Sie Zellen mit dem DAPI-Farbstoff.
         2. Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Analysieren " das Echtzeit-Tuning-Werkzeug mit den folgenden Schlüsselparametern: Minimale Kernintensität zum Herausfiltern des Hintergrundsignals; Maximale Bildhelligkeit zur Steuerung der Gesamtsichtbarkeit des Signals; Nukleare Segmentierung Aggressivitätseinstellung zur Verfeinerung der Grenzen detektierter Kerne.
         3. Stimmen Sie jeden Parameter sorgfältig ab, um eine genaue Segmentierung zu gewährleisten.
   2. Erkennen Sie das Zytoplasma und die Membranmarker.
      1. Navigieren Sie zur Registerkarte Membran- und Zytoplasmadetektion .
      2. Legen Sie den minimalen Zytoplasmaradius auf einen Wert fest, der für die Probe für die erwartete Größe der Zellen geeignet ist.
      3. Geben Sie unter der Option Membranfarben an, welche Kanäle Membranmarkierungen sind.
         HINWEIS: Dies sollte zu einer besseren Segmentierung der einzelnen Zellen für die weitere Analyse führen.
   3. Marker-Thresholding und Phänotyp-Zuordnung
      1. Legen Sie für jeden Marker die Schwellenwerte für positive und negative Signale fest. Führen Sie dies unter den Registerkarten aus, die für jeden Marker generiert werden.
      2. Führen Sie die manuelle Schwellenwertbestimmung für jeden Marker durch, um die Populationen zu identifizieren.
      3. Alternativ können Sie einen bioinformatikbasierten automatisierten Ansatz zur Schwellenwertbestimmung verwenden. In der Erweiterten | Speichern Sie Objektdaten (Zelle), und schalten Sie die Option auf True um. Im Export | Objektdaten: Exportieren Sie das Dataset, um Informationen zum Markerausdruck für jede identifizierte Zelle zu erhalten.
      4. Importieren Sie diese Daten in zusätzliche Software, um sie weiter und individuell zu analysieren. Optionen für Software für weitere Analysen sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Ergebnisse

Wir zeigen ein Beispiel für ein IBEX-Panel mit TSA-basierten Reagenzien auf dem Autostainer 2 (Abbildung 4). Jeder Marker kann klar abgegrenzt werden, und es gibt nur minimales Durchscheinen zwischen den Markern. Das Bild wurde in zwei Färberunden gesammelt. Bei der Probe handelt es sich um Lungengewebe nach einer Infektion mit Mycobacterium tuberculosis. Die beiden IBEX-Färbepaneele wurden mit Hilfe von kommerziell erhältlicher Beispielsoftware ausgerichtet. Unter Verwendung des IBEX-Ansatzes mit optimierten TSA-Reagenzien (wie hier beschrieben) kann die räumliche Organisation von Immunzellen, Entzündungsmarkern und spezialisierten Lungenzellen gesehen und gewürdigt werden. Durch die richtige Optimierung können Marker problemlos mit minimalem Hintergrund angezeigt werden.

Abbildung 1: Antigen-Retrieval-Test mit einem Fluorophor mit einer Emission von 520 nm von zwei verschiedenen Antigenen. RAGE und CD3e wurden unter Verwendung konservierter Belichtungszeiten abgebildet. Das Epitop dieses RAGE-Antikörpers ist hochsensitiv und anfällig für wiederholte Antigen-Retrieval mit schnellem Abfall der Assay-Sensitivität bei nachfolgenden Antigen-Retrievals. Umgekehrt verbessert sich die Sensitivität des CD3e-Assays mit mehreren Runden der Antigen-Retrieval. Maßstabsleisten = 50 μm. Abkürzung: RAGE = Receptor for Advanced Glycation Endproducts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiel für die Bedeutung der Sequenzentwicklung in Bezug auf den Umbrella-Effekt. RAGE ist ein hoch exprimierter Marker in AT1-Zellen und blockiert in Kombination mit CD31 wirksam die Immunreaktivität von SARS-CoV-2. Wenn jedoch zuerst eine SARS-CoV-2-IHC durchgeführt wird, können alle Signale sichtbar gemacht werden. Maßstabsleisten = 25 μm. Abkürzungen: RAGE = Receptor for Advanced Glycation Endproducts; AT1 = Alveolärer Typ 1; SARS-CoV-2 = Schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2; IHC = Immunhistochemie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Überblick über den Prozess mit automatisierten Färbegeräten für das IBEX-Protokoll. Nassmontage für Runde 2 oder höher des Färbeprozesses, um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern. Abkürzung: IBEX = Iteratives Bleichen erweitert die Multiplizität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Beispiel für IBEX mit TSA-basierten Farbstoffen aus Autostainer 2 auf einer mit Mycobacterium tuberculosis infizierten Lunge. Tafel 1 enthält alle Farbstoffe, und Tafel 2 enthält Farbstoffe, die gebleicht werden konnten. Es wird ein zusammengeführtes Bild aller Kanäle über den gesamten IBEX des Lungenbildes präsentiert. Maßstabsleisten = 200 μm. Abkürzungen: IBEX = iteratives Bleichen erweitert die Multiplizität; TSA = Tyramid-Signalverstärkung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Ein Beispielprotokoll zur Validierung der Auswirkungen der Zykluszahl auf Antikörper für Tests mit 1, 3 und 6 Zyklen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Ein Beispiel für ein Panel 1 mit fünf Antikörpern für den IBEX-Autostainer zur Panelvalidierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Ein Beispiel für ein Panel 2 mit vier Antikörpern für den IBEX-Autostainer zur Panelvalidierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Vergleich von zwei Autostainern. Eine Tabelle, in der die Vor- und Nachteile des Ventana Autostainers und des Bond Rx zusammengefasst sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Software-Zusammenfassung für die Bildanalyse. Tabelle, die einige der Analyseansätze und Softwaretools zusammenfasst, die für die Analyse von Bildern nach der Segmentierung verfügbar sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Hier stellen wir Überlegungen zur Anpassung des IBEX-Protokolls in zentrale Pathologieeinrichtungen durch den Einsatz automatisierter Färbegeräte und die Optimierung von TSA-basierten Reagenzien im IBEX-Protokoll vor. Wir zeigen, wie die wiederholten Runden der Antigengewinnung und des ordnungsgemäßen Ladens in Runde 2 oder höher auf die automatisierte Ausrüstung am besten optimiert werden können. Darüber hinaus demonstrieren wir eine zusätzliche Methode zur Durchführung der Ausrichtung mit der Halo-Software, die möglicherweise in den Kerneinrichtungen verfügbar ist. Diese Ansätze haben sich als nützlich erwiesen, um die Unterschiede in der Lungenumgebung in nicht-menschlichem Primatengewebe nach SARS-CoV-2-Infektionen zu bestimmen⁵.

Eine Schlüsselkomponente dieser Arbeit ist die Hervorhebung der Notwendigkeit einer umfassenden Optimierung des IBEX-Panel-Designs vor der Färbung von experimentellen Geweben. Insbesondere bei der Verwendung von TSA-basierten Reagenzien müssen einige Aspekte berücksichtigt werden, die bei den IBEX-Basismethoden nicht zu finden sind. Der erste ist der Einfluss mehrerer Runden der Antigen-Retrieval auf die Antikörpersensitivität. Bei TSA-basierten Reagenzien geht jeder neuen Antikörperentwicklung eine Antikörperdenaturierung voraus. Einige Antikörper/Antigen-Paare sind anfällig für zusätzliche Runden der Antigen-Retrieval und verringern die Assay-Sensitivität, während andere eine erhöhte Sensitivität durch wiederholte Denaturierung/Antigen-Retrieval erreichen. Eine sorgfältige Prüfung jedes Antikörpers im Zielgewebe vor dem Design der Panels ist wichtig, um die besten Färbepraktiken zu gewährleisten und die Sequenzreihenfolge sowohl der Antikörper als auch der Fluoreszenzfarbstoffe zu bestimmen. Puffer, darunter sowohl Citrat-basierte (pH 6,0) als auch Tris-EDTA-basierte (pH 9,0), werden auf alle Antikörper getestet, um die optimalen Bedingungen für die Antigen-Entnahme zu bestimmen. Dabei wird jeder Puffer systematisch bewertet, um festzustellen, welcher die Antigenexposition für einen bestimmten Antikörper maximiert. Darüber hinaus werden die Temperatur (z. B. 20-37 °C), die Inkubationszeit (typischerweise 30-60 min) und die Blockierungsbedingungen optimiert, um unspezifische Hintergrundfärbungen zu reduzieren und bei Bedarf eine spezifische Bindung der primären und sekundären Antikörper zu gewährleisten. Die Blockierung vor den primären und sekundären Antikörpern kann die Verwendung von kommerziell erhältlichen Blockierungsreagenzien umfassen, um gewebespezifische Autofluoreszenz oder unspezifische Wechselwirkungen zu berücksichtigen. Zu den weiteren wichtigen Überlegungen, die vor der Fertigstellung von IBEX-Panels optimiert werden müssen, gehört der Umbrella-Effekt, bei dem eine Abschirmung der Epitope auftreten kann, wenn die Reihenfolge nicht auf die jeweilige Forschungsfrage abgestimmt ist⁶. Um fluoreszierendes Durchbluten zu vermeiden, ist es typisch, höher exprimierende Antigenziele in dunkelrote Kanäle zu stecken, die das geringste Durchbluten und schwächere Marker im Bereich von 480-520 nm aufweisen, die das beste Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen, da diese Fluoreszenzfarbstoffe die hellsten⁷ sind. Es sollte jedoch auf stark autofluoreszierende Gewebeproben geachtet werden, die in diesem Bereich am hellsten sein können. Wir empfehlen, dieses Problem durch Bildgebung von Gewebe ohne Farbstoffe zu lösen, um mögliche Mengen an Autofluoreszenz zu berücksichtigen. Zusammen mit allen normalen Optimierungen und Kontrollen, die typischerweise mit IBEX durchgeführt werden, können diese Optimierungsschritte das richtige Panel-Design für IBEX mit TSA-Reagenzien ermöglichen.

Bei dieser Methode haben wir die Verwendung von zwei gängigen Autostainern demonstriert. Diese Ansätze könnten aber auch auf andere Autostainer-Verfahren übertragen werden. Entscheidend ist dabei die optimale Entfernung von Deckgläsern und die Nassladung für zusätzliche Färberunden. Darüber hinaus geben wir keinen spezifischen Mikroskopaufbau an. Obwohl Kits die Verwendung mit bestimmten Bildgebungssystemen für eine optimale Objektträgerabtastung empfehlen können, sollte jedes Mikroskop-Setup, insbesondere ein Epifluoreszenzmikroskop mit kompatiblen Filterwürfeln und einer Breitband-LED-Lichtquelle, funktionieren. Einige Farbstoffe erfordern multispektrale Detektoren oder spezielle Filterwürfel, die möglicherweise nicht in allen Labors verfügbar sind und bei der Verwendung mit Standard-Filterwürfeln aufgrund ihrer spektralen Überlappung eine Herausforderung darstellen können. Diese Farbstoffe lassen sich mit multispektralen Bildgebungssystemen oder hochspezifischen Filtern besser trennen. Einige Fluorophore liegen außerhalb des Bereichs herkömmlicher Fernrotfilter (typischerweise ~700 nm) und erfordern einen speziellen Filterwürfel oder Detektor, der Nahinfrarotsignale erfassen kann. Spezielle Mikroskope werden mit diesen Filtern gebaut, aber es gibt auch Alternativen. Diese erfordern eine zusätzliche Optimierung, um zu bestimmen, wie sich die Farbstoffe in einer bestimmten Mikroskopkonfiguration verhalten.

Die multispektrale Entmischung wird für Multiplex-Fluoreszenz-IHC dringend empfohlen, insbesondere bei der Arbeit mit Geweben, die zu Autofluoreszenz neigen, da sie das wahre Signal effektiv vom Hintergrundrauschen trennt. Die Autofluoreszenz, die sich oft mit den Emissionsspektren häufig verwendeter Fluorophore überschneidet (insbesondere in Kanälen mit höheren Wellenlängen), kann bestimmte Signale verdecken oder stören, wodurch die Genauigkeit verringert wird. Die spektrale Entmischung entwirrt mathematisch überlappende Emissionsspektren, isoliert echte Fluoreszenzsignale und "bereinigt" unerwünschte Autofluoreszenz. Die spektrale Entmischung ist besonders wertvoll in IBEX-Arbeitsabläufen, bei denen es aufgrund des iterativen Charakters des Färbe- und Bildgebungsprozesses entscheidend ist, möglichst saubere Signale zu erzielen. In IBEX werden Signale aus mehreren Färberunden abgebildet, gebleicht und übereinander gestapelt, um ein Kompositbild zu erzeugen. Jede Autofluoreszenz oder jedes Durchschlagen, das in einer Runde unaufgelöst bleibt, kann sich durch die gestapelten Bilder ausbreiten, was die nachgelagerte Analyse erschwert und das Vertrauen in die Markerlokalisierung verringert. Die spektrale Entmischung isoliert effektiv echte Fluoreszenzsignale von der Hintergrund-Autofluoreszenz und sorgt so für eine sauberere und genauere Signaldetektion in jeder einzelnen Runde. Diese Signalklarheit ist entscheidend für die Erzeugung zuverlässiger Kompositbilder, bei denen mehrere Marker zusammen über Runden hinweg analysiert werden, was eine zuverlässige Phänotypisierung und räumliche Analyse ermöglicht. Die für dieses Protokoll verwendete Bildgebungsplattform verfügt über integrierte Entmischungsfunktionen, aber für die Kompatibilität mit anderen fluoreszierenden Ganzobjektträger-Bildgebungsplattformen sind mehr Entmischungsoptionen erforderlich.

Darüber hinaus ist eine Einschränkung dieser Arbeit die proprietäre Natur der Autostainer, da die zugehörigen Reagenzien und Waschpuffer für diese Systeme optimiert sind, die spezifischen Formulierungen jedoch nicht bekannt gegeben werden. Darüber hinaus haben wir uns ausschließlich auf eine kommerziell erhältliche Bildanalysesoftware für die Analyse von Ganzobjektträgern konzentriert und sind uns bewusst, dass die Kosten für Softwarelizenzen für einige Labore ein finanzielles Hindernis darstellen können. Zusätzliche Analysesoftware ^8,9 und Optionen in R erscheinen vielversprechend; insbesondere die Bodenmiller-Gruppe¹⁰, die ein Paketset erstellt hat, das für Kerne optimal erscheint, da IMCDataAnalysis¹¹ für den reproduzierbaren Arbeitsablauf bei der Downstream-Analyse von Multiplexbildern in R vorgesehen ist. Es sind jedoch zukünftige Anstrengungen erforderlich, um zugängliche und kostengünstige Alternativen für die IBEX-Analyse des gesamten Objektträgers zu entwickeln und zu charakterisieren, um eine breitere Akzeptanz in ressourcenbegrenzten Umgebungen zu gewährleisten. Darüber hinaus kann dieser Ansatz mit der Verwendung der Autostainer für IBEX für die traditionellere Färbung in IBEX angepasst werden, einschließlich mit fluoreszierenden konjugierten Primärantikörpern, oder mit Standard-Sekundärantikörpern ohne die TSA-basierten Farbstoffe, wenn das Gewebe von hoher Qualität und optimaler Fixierungszeit ist, um ein gutes Signal zu ermöglichen.

Insgesamt hoffen wir, dass diese Arbeit die Anwendung von TSA-basierter Multiplex-Fluoreszenz-IHC unter Verwendung routinemäßig eingesetzter Pathologie-Core-Facility-Geräte unterstützen wird, um IBEX in diesen Umgebungen breiter zu adaptieren. Diese Art der Anwendung unterstreicht die Vielseitigkeit des IBEX-Protokolls und demonstriert seine Nützlichkeit auch bei schwierigen Gewebeproben oder bei großen Chargenansätzen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Verfärbungsreagenz Alexa TSA-Kits	ThermoFisher		Alternative TSA-Farbstoffe, falls Opalmikroskopiefilter nicht verfügbar sind. Dazu gehören Alexa Fluor 488 (blau/grüner Kanal), Alexa Fluor 555 oder 568 (roter Kanal), Alexa Fluor 647 (fernroter Kanal), Alexa Fluor 750 (nahe infrarot, wenn mit geeigneten Filtern ausgestattet).
Antikörper Arg1	Zellsignalübertragung	93668	Verwendet in Abbildung 4 bei 1:100
Material Klingen	Leica Biosystems		Oder ähnlich: Hoch- oder Niedrigprofil hängt vom Gewebetyp ab
Antikörper CD11b	Abcam	ab133357	Verwendet in Abbildung 4 bei 1:2000
Antikörper CD163	Abcam	ab182422	Verwendet in Abbildung 4 bei 1:500
Antikörper CD31	Zellsignalübertragung	77699S	Verwendet in Abbildung 2 bei 1:100
Antikörper CD3e	Dako	A045201-2	Verwendet in Abbildung 1 bei 1:100
Tool Coplin Jar	Fischer Scientific	01-816-21	Oder Ähnliches
Material Deckblätter	VWR	v48393-026	Oder Ähnliches
Antikörper CX3CR1	Abcam	ab308613	Verwendet in Abbildung 4 bei 1:450
Stain DAPI	Akoya	FP1490
Software FIJI			Verwendet zur Messung der Signalintensität
Slide Fisher Superfront Slides	Fisher Scientific	22-037-246	Oder ähnlich
Software HALO	Indica Labs		Beispiel für kommerziell verfügbare Bildanalyse-Software. Wird verwendet, um Bilder auszurichten und zu analysieren.
Antikörper Iba1	Zellsignalübertragung	17191	Verwendet in Abbildung 4 bei 1:800
Software inForm	Akoya		Verwendet zur Messung der Signalintensität
Antikörper iNOS	Abcam	ab283655	Verwendet in Abbildung 4 bei 1:400
Instrument Leica Bond Rx (oder RXm)	Leica Biosystems	21.2201	Im Text als "Autostainer 1" bezeichnet. Stellen Sie sicher, dass alle zugehörigen Reagenzien ebenfalls verfügbar sind, einschließlich Färbungsboxen und Massenlösungen.
Reagenz LiBH4	Sigma-Aldrich	62460-5G-F	In einer wasserfreien Umgebung halten
Instrument Mantra Snap	Akoya		Ein multispektrales Mehlzenzmikroskop ist erforderlich, um die Farbstoffe zu erkennen. Beispiel-Mikroskop, mit dem Opalfarben nachgewiesen werden kann.
Tool Microtome	Leica Biosystems		Oder ähnlich mit bevorzugtem Zubehör wie Pinseln
Färbereagenz Opal IHC 480 Kit	Akoya	FP1500001KT	Verwendet in Abbildung 4
Färbereagenz Opal IHC 6-plex Plex Kit	Akoya	NEL821001KT	520 und 620 werden nicht gebleicht, wie sie in Abbildung 1, 2 und 4 verwendet werden
Färbereagenz Opal IHC 780 Kit	Akoya	FP1501001KT	Verwendet in Abbildung 4
Tool Ofen	Millipore Sigma	Z683329	Oder Ähnliches, das kann auch mit Autostainer gemacht werden
Antikörper Pancytokeratin	Abcam	ab9377	Verwendet in Abbildung 4 bei 1:50
Reagenz PBS (optional)	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Instrument PhenoImager	Akoya		Multispektrale Gesamtbildabbildung mit integrierter spektraler Entmischung in der Software enthalten
Reagenz ProLong Gold Antifade	Fisher Scientific	P36961	Oder ähnliche wässrige Montagemedien
Antikörper ProSP-C n-terminal (ProSPC)	Seven Hills Bioreagenzien	WRAB-9337	Verwendet in Abbildung 4 bei 1:250
Antikörper RAGE	R& D	MAB1179	Verwendet in Abbildung 1 und 2 bei 1:50
Reagenz Reaktionspuffer	Roche	NC1895692	Zur Verwendung mit Ventana Autostainer
Antikörper SARS-CoV-2-N	Zellsignalübertragung	68344	Verwendet in Abbildung 2 bei 1:1000
Slide TOMO Adhesion CC Microscope Slides-WH	Avantik	SKUSL6519-1	Ob Gewebehaftung ein Problem ist
Instrument Ventana Discovery Ultra	Roche		Im Text als "Autostainer 2" bezeichnet. Stellen Sie sicher, dass alle zugehörigen Reagenzien ebenfalls verfügbar sind, einschließlich Färbungsboxen und Massenlösungen.
Reagenz Waschpuffer	Leica Biosystems	AR9590	Zur Verwendung mit Leica Bond Autostainer
Reagenz Wasser	Fisher Scientific	15-230-147	DI ist am besten, nicht Millipore
Tool Wasserbad	Leica Biosystems	140607020C1	Oder Ähnliches