Method Article

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

DOI:

10.3791/69095

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December 12th, 2025

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1Department of Chemistry, Washington State University, 2Department of Biosciences, Biotechnology and Environment, University of Bari Aldo Moro

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung, wie Proben für die Tracking von Einzelproteinen in festgestützten Lipiddoppelschichten erstellt werden können. Es erklärt außerdem ein einfaches Fluoreszenzmikroskop mit Einzelmolekülempfindlichkeit und hoher Bildrate. Abschließend skizzieren wir das Verfahren zur Extraktion von Einzelprotein-Trajektorien.

Abstract

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Direkte Beobachtung ist eine grundlegende Methode für wissenschaftliche Entdeckungen und Verständnisse. Zeitraffer-Fluoreszenzbildgebung mit Einzelmolekül ermöglicht die Beobachtung einzelner Proteine, während sie sich bewegen und mit ihrer Umgebung interagieren, wodurch Zustände sichtbar werden, die normalerweise in Ensemble-Messungen verborgen wären. Das Tracken von Einzelproteinen eignet sich besonders gut zur Untersuchung von Membranproteinen, wo ihre zweidimensionale Natur eine schnelle, weitfeldige Bildgebung mit Einzel-Fluorophor-Sensitivität ermöglicht. Die Verwendung künstlicher Lipiddoppelschichten, die Membranen nachahmen, an denen transmembranale oder periphere Membranproteine vorkommen (wie Plasmamembranen oder Membranen intrazellulärer Organellen verschiedener Zelltypen), ermöglicht die Messung spezifischer Wechselwirkungen in nahezu natürlichen Umgebungen. Es ermöglicht auch die allmähliche Erhöhung der Komplexität, Komponente für Komponente, während Hintergrundinterferenz durch Fluoreszenz und Raman-Streuung unterdrückt werden. Durch die Hinzufügung der Temperaturregelung ist es auch möglich, die thermodynamischen Eigenschaften von Einzelteilchenwechselwirkungen zu bestimmen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Probenvorbereitung, Datenerhebung, zur Verfolgung der einzelnen Molekülfluoreszenz und zur Analyse von Membranproteintrajektorien in Lipiddoppelschichten mit Aquaporin-4. Diese Arbeit dient als grundlegendes Beispiel und kann an verschiedene Proteine und Doppelschichtzusammensetzungen angepasst werden.

Introduction

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Unter natürlichen biologischen Bedingungen sind Membranproteine von einem umfangreichen Netzwerk von Interaktionen umgeben, das andere Membranproteine, Proteine in den intra- und extrazellulären Flüssigkeiten, verschiedene Arten von Lipiden und Cholesterin, Substrate oder Liganden, Lösungsinteraktionen sowie Wechselwirkungen zwischen extrazellulären und intrazellulären Matrizen umfasst. Ein klassischer biophysikalischer Ansatz, um spezifische und kollektive Interaktionen besser zu verstehen, beginnt mit einer einzigen Komponente, wobei nach und nach weitere Komponenten nacheinander eingeführt werden, bis die Komplexität die natürliche Umwelt widerspiegelt – ein "Divide and Conquer"-Ansatz in der Biophysik. Eine moderne molekulare Methode zur Untersuchung dieser Wechselwirkungen erfolgt durch direkte Beobachtung mittels Zeitraffer-Einzelmolekül-Fluoreszenzbildgebung, um einzelne Proteine zu verfolgen, während sie sich bewegen und mit ihrer Umgebung interagieren. In diesem Artikel beschreiben wir die grundlegenden Schritte dieses Ansatzes, darunter die Bildung von Lipiddoppelschichten auf Quarz-Deckschichten und das Einfügen eines großen Membranproteins in diese vorgefertigten Doppelschichten auf eine für die Einzelproteinbildgebung geeignete Weise. Darauf folgt ein "Arbeitspferd"-Protokoll zur Verfolgung einzelner Proteine in unterstützten Doppelschichten.

Dieser Artikel beschreibt, wie man fest getragene Lipiddoppelschichten mit kleinen unilamellenaren Vesikeln (SUVs) erzeugt, die auf hydrophilen Quarz-Deckrutschen platzen. Die Quarzoberflächen werden entweder durch eine Säurereinigung oder eine UV-Ozonreinigung vorbereitet. Das Lipid, das zur Herstellung der SUVs verwendet wird, sollte, wenn möglich, der Hauptchemiezusammensetzung der relevanten biologischen Membran entsprechen (z. B. wird Aquaporin-4 (AQP4) in der Plasmamembran von Astrozyten gefunden, und die Hauptbestandteile sind POPC (46,4%), POPE (8,5%), PS (5,6%), Cholesterin (30%), PI (2,5%) und SM (5,6%))1,2). Um eine Wechselwirkung mit dem festen Substrat zu verhindern, heben Zusatzstoffe wie Polyethylenglykol (PEG), die an ein Lipid gepfropft sind, die Doppelschicht von derOberfläche 3,4 ab. Die Menge jedes Zusatzstoffs muss sorgfältig angepasst werden, um sicherzustellen, dass die Proteindiffusion nicht blockiert wird, während gleichzeitig genügend Unterstützung geschaffen wird, um die Membran von der Substratoberfläche zu heben. Zusätze wie PEGylierte Lipide zeigen typischerweise zwei Phasen: eine "Pinselphase" und eine "Pilzphase". Die Pinselphase tritt auf, wenn der PEG eine hohe Konzentration aufweist, wodurch das Polymer aufrecht steht, um sterische Hindernisse zu verringern. Die Pilzphase tritt in niedrigen Konzentrationen auf, wenn die Polymere ausreichend voneinander getrennt sind, um als zufällige Spulen zu existieren. Im Allgemeinen behindert die Pinselphase die Diffusion, aber die Pilzphase bietet wenig Unterstützung. Die Konzentration zwischen Pinsel- und Pilzphase ist optimal und bietet Unterstützung mit minimalem Einfluss auf die Diffusion 3,4.

Einige Membranproteine setzen sich spontan in fest gestützte Lipidmembranen ein, wie P450s und Cytochrom P450-Reduktase5, während andere mit Reinigungsmitteln eingesetzt werden müssen, was ein heikler Prozess ist. Sorgfältiges Waschen ist notwendig, um diese Waschmittel sowie alle nicht integrierten Proteine zu entfernen, die das Tracking von Einzelproteinen beeinträchtigen könnten – ein Prozess, der im Detail beschrieben wird. Der Hauptfokus dieses Artikels liegt auf der Vorbereitung einer Probe für die Einzelmolekülverfolgung (SMT) mittels Zeitraffer-Fluoreszenzbildgebung. Dies erfordert ein Objektiv mit hoher Vergrößerung und numerischer Apertur (NA) – typischerweise ein 100x und ein 1,45 NA Ölimmersionsobjektiv 6,7. Außerdem wird eine schnelle, hochempfindliche Kamera (EMCCD, CMOS oder ICCD-Kamera) und eine Laseranregung benötigt. Die Laseranregung muss ein ausreichend großes Sichtfeld abdecken, um lange Proteinbahnen zu messen, was oft durch totale interne Reflexion erreicht wird, um ein evaneszentes Feld von etwa 50 μm x 100 μm oder Epi-Beleuchtung mit strahlformenden Optiken (Gauß bis Zylinder) von etwa 80 μm x 80 μm8 oder ein stark geneigtes und laminiertes optisches Blatt (HILO) mit einem Feld ähnlich dem TIRF zu erzeugen. Die Total Internal Reflection Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) hat den Vorteil, das Hintergrundsignal zu reduzieren. Ein einfaches, relativ kostengünstiges TIRF-Mikroskopdesign wird unten vorgestellt. Durch das Hinzufügen von Temperaturkontrollen ist es möglich, mehrere thermodynamische Eigenschaften wie Enthalpie, Entropie und Gibbs-freie Energie9 zu messen. Die Technik erfordert außerdem eine Fluoreszenzkennzeichnung des Membranproteins in einem Grad, der sicherstellt, dass die meisten Membranproteine ein fluoreszierendes Tag tragen.

Das in diesem Artikel interessierende Transmembranprotein ist AQP4. AQP4 ist ein Wasserkanal, der an den Endfüßen von Astrozyten und anderen Bereichen der Gefäße10 des zentralen Nervensystems polarisiert ist. Es kann bis zu 3 Milliarden Wassermoleküle pro Sekunde transportieren und ist an der Wasserhomöostase, Zellwanderung, Hirnödem, Lernen und Gedächtnisbildung durch synaptische Plastizitätbeteiligt. Die Dysregulation der AQP4-Funktion wurde mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Hirnödem, Neuromyelitis optica und Epilepsie 12,13,14,15. AQP4 ist ein 32–37 kD-Protein, abhängig von seiner Isoform, und besitzt eine tetramerische quartäre Struktur mit acht hydrophoben Membrandomänen, die durch verbindende Schleifen verbunden sind, einer intrazellulären N-terminalen Domäne und einer großen intrazellulären C-terminalenDomäne 16. Es gibt zwei Hauptisoformen von AQP4, M1 und M23; Der Unterschied entsteht durch die Initiierung des Methionin-1-Rests oder des Methionin-23-Rests. Forschungen haben gezeigt, dass die M1-Isoform je nach Palmitoylationszustand9 Dyaden oder Triaden mit sich selbst bilden kann. Die M23-Isoform setzt sich zu großen Proteinaggregaten zusammen, die als orthogonale Teilchenarrays (OAPs) bekannt sind. Bei Koexprimierung begrenzt die M1-Isoform das Wachstum der OAP, indem sie eine periphere Proteinschicht um ihre äußere 17,18,19 bildet. Die Dynamik der OAP-Aggregation könnte ein entscheidender Faktor bei der Modulation der Wasserdurchlässigkeit und Homöostase im Gehirn sein. In diesem Artikel beschreiben wir die notwendigen Schritte, um einzelne AQP4s in einer Membran zu verfolgen und einzelne Protein-Protein-Interaktionen zu beobachten.

Protocol

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1. Herstellung kleiner unilamellärer Bläschen

  1. Nimm die Lipidbrühlösungen aus dem Gefrierschrank und lasse sie auf Zimmertemperatur kommen.
  2. Nimm eine saubere 10-ml-Flasche aus dem Ofen und lasse sie auf Zimmertemperatur abkühlen.
  3. Gib 900 μL spektroskopisches Chloroform und 100 μL spektroskopisches Methanol in den kühlen, rundbodenigen Kolben und gib dann die entsprechenden Mengen jedes Lipids in der Mischung hinzu. Drehen Sie die Flasche, um sicherzustellen, dass die Lipide gut gemischt sind.
    HINWEIS: Andere Autoren verwenden unterschiedliche Verhältnisse von Chloroform:Methanol, aber wir haben festgestellt, dass das beste Verhältnis zur Bildung gleichmäßiger Lipidkuchen 9:1 war.
    Eine Tabelle zur Berechnung der korrekten Lipidmengen wird in Supplemental File 1 bereitgestellt. Bei der Herstellung von Lipiden zur Überprüfung der Lipiddoppelschichtbildung auf der Oberfläche des Substrats verwenden Sie ein fluoreszierend markiertes Lipid.
  4. Setzen Sie einen Vakuumdestillationsanschluss auf den rundbodenigen Kolben, wie in Abbildung 1 gezeigt, und verbinden Sie ihn mit der Stickstoffleitung (Trocknungsgerät).
    HINWEIS: Verwenden Sie gereinigtes N2(g) und lassen Sie es vor dem Anschluss an das Trocknungsgerät durch einen 0,22 μm-Filter.
  5. Schalte den N2(g) ein und stelle den Druck so an, dass der Fluss so ist, dass er auf dem Handrücken kaum spürbar ist.
    HINWEIS: Das Befeuchten des Handrückens kann helfen, die Verdunstung zu spüren.
  6. Lassen Sie die Probe bei einem Durchfluss von N2(g) für 2,5–3 Stunden trocknen und prüfen Sie regelmäßig, ob der Stickstoff weiterhin fließt. Die Probe wird wahrscheinlich innerhalb der ersten halben Stunde trocken erscheinen; Führen Sie jedoch weitere 2–2,5 Stunden weiter, um verbleibende Lösungsmittel zu entfernen.
    HINWEIS: Die Probe kann auch über Nacht getrocknet werden.
  7. Fügen Sie 1 ml Puffer für jeweils 5,0 μmol Gesamtlipid im runden Kolben hinzu.
    HINWEIS: Der in dieser Studie verwendete Puffer bestand aus 100 mM HEPES, 5 mM CaCl2 und 140 mM NaCl; dies ist derselbe Puffer, der während der gesamten Vorbereitung der Probe verwendet wird.
  8. Setzen Sie einen Glasstopper auf die Kolben und wickeln Sie sie mit Paraffinfolie um.
  9. Setzen Sie die Flasche in eine Klemme auf einen Ringhalter und tauchen Sie den Boden der Flasche in ein Bad eines auf 60 °C eingestellten Sonikators. Lassen Sie die Flasche eine Stunde lang inkubieren, wobei Sie alle 15 Minuten sanft wirbeln, um multi-lamellenläre Liposomen zu erzeugen, die als undurchsichtige Lösung ohne Lipide am Kolben erscheinen.
  10. Nach der 1-Stunden-Inkubation schalten Sie den Sonikator (~35 kHz) ein und stellen Sie die Amplitude auf die höchste Stufe. Dann bewegt man den Kolben im Bad, um die Position zu finden, an der die größte Bewegung auftritt, sodass die Lösung im Behälter stößt und sprüht. Sonikate 30 Minuten lang, suche einen Wechsel von undurchsichtig zu transparent und leicht opalisierend.
  11. Entfernen Sie die Lipidlösung aus dem Kolben und legen Sie sie in ein Mikrozentrifugenrohr, dann zentrifugieren Sie sie bei 100.000 × g für 1 Stunde bei 4 °C. Entfernen Sie das Überlagerungsmittel aus dem Mikrozentrifugenrohr.
    HINWEIS: Am Boden des Röhrchens kann sich eine kleine Kugel bilden. Wenn das Pellet groß ist, werfen Sie es weg und wiederholen Sie den Vorgang.
  12. Nutzen Sie die SUVs nach der Zentrifugation, lagern Sie sie eine Woche bei 4 °C oder halten Sie sie bei -80 °C mit etwas Trehalose.
    HINWEIS: Die empfohlene Menge Trehalose beträgt 1 mg pro ml Lipidlösung. Für optimale Ergebnisse können wöchentlich neue SUVs gebaut und im Kühlschrank gelagert werden.
    HINWEIS: Dies ist nur eine Methode zur Vorbereitung von SUVs. Neben SUVs können auch kleine, mittlere und große unilamellare Vesikel mittels Extrusion oder riesigen unilamellären Liposomen mittels Elektroformation 20,21,22,23 hergestellt werden.

2. Proteinkennzeichnung

HINWEIS: Die Markierung von Proteinen mit fluoreszierenden Sonden unter Verwendung verschiedener Konjugate, wie NHS-Ester und Malimide, ist gut dokumentiert und gut verstanden. Der Grad der Markierung (DOL) ist jedoch besonders wichtig bei der Verfolgung von Einzelproteinen. In dieser Studie war es entscheidend zu bestimmen, welcher Prozentsatz der transmembranen Proteine markiert waren und wie die Fluorophore auf jedem AQP4-Tetramer verteilt waren.

  1. Setzen Sie ein Dialyserohr in einen Becher mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8,3, der durch einen 0,22 μm Filter geleitet wurde. Dann lässt man es über Nacht in umgekehrter Position im Puffer liegen, sodass die Membran konditioniert werden kann.
  2. Am folgenden Tag ersetzen Sie den Puffer im Dialyseröhrchen durch die Proteinlösung.
    HINWEIS: Das Volumen der Proteinlösung sollte zwischen 20 und 250 μL liegen. In der Lösung sollten ~1-5 mg gelöstes Protein enthalten sein.
  3. Sobald das Protein in die Dialyseröhre gelegt ist, lassen Sie es über Nacht auf dem Rücken im 0,1 M großen Phosphatpuffer liegen.
  4. Nach der Dialyse wird das Protein in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen.
  5. Bereiten Sie eine neue Dialyseröhre vor, indem Sie Schritt 2.1 wiederholen.
  6. Bereiten Sie den NHS-Farbstoff vor, indem Sie einige Körner (3-4) auf ein kleines Stück Schwerpapier geben, es dann in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr übergeben und in 100 μL DSMO auflösen. Folgt dies mit zwei 1-mL 10-fachen Verdünnungen in DMSO, wobei die letzte Verdünnung verwendet wird, um die Konzentrationen jeder Probe mittels UV-Vis-Spektroskopie zu bestimmen. Um einen durchschnittlichen DOL von 2-3 zu erreichen, geben Sie beim sanften Schütteln einen dreifachen molaren Überschuss reaktiven Farbstoffs zur Proteinlösung.
    HINWEIS: Ein Standard-UV-Vis-Spektrometer genügt für diesen Zweck, obwohl ein Spektrometer mit kleinem Volumen aufgrund der Stichprobengröße vorteilhaft ist.
  7. Fügen Sie den reaktiven Farbstoff in das Mikrozentrifugenrohr ein, das das Protein in gleichen Mengen enthält. Sobald der reaktive Farbstoff und das Protein zusammengesetzt sind, nutieren Sie mindestens 8 Stunden.
  8. Nach der Nutation wird das markierte Protein in das in Schritt 2.5 vorbereitete Dialyserohr übertragen und in einen Becher mit frischem Phosphatpuffer gelegt. Setzen Sie einen Rührstab in den Puffer und lassen Sie ihn 6 Stunden sanft wirbeln, gefolgt von einem Pufferwechsel und weiteren 6 Stunden Dialyse.
  9. Nach den beiden Puffertauschen wird das Dialyserohr mit dem markierten Protein in einen sauberen Becher mit dem endgültigen Arbeitspuffer gesetzt.
    HINWEIS: Der endgültige Arbeitspuffer, der in dieser Studie verwendet wurde, bestand aus 100 mM HEPES, 5 mM CaCl2 und 140 mM NaCl bei pH 7,4.
  10. Nach der Dialyse wird das DOL mit einem UV-Vis-Spektrometer gemessen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, Standardmethoden zur Messung des DOL zu befolgen. Nachfolgend eine Gleichung für die Berechnung.
    figure-protocol-1(1)
    Dabei ist die am Peak des Farbstoffs figure-protocol-2 gemessene Absorptionskraft und der Proteinpeak bei 280 nm . figure-protocol-3 Der Extinktionskoeffizient des Proteins ist figure-protocol-4 (berechnet aus dem Molekulargewicht des Proteins), während figure-protocol-5 und figure-protocol-6 vom Farbstoffhersteller bereitgestellt werden.

3. Herstellung von 25 mm Durchmesser Quarz-Deckschlüpfen

HINWEIS: Im Folgenden sind zwei verschiedene Methoden aufgeführt:

  1. Säurewaschen
    HINWEIS: Es gibt mehrere veröffentlichte Säure-Waschverfahren, darunter Piranha- und Basenätzungen. Wir haben festgestellt, dass das untenstehende Verfahren eine äußerst saubere und hydrophile Oberfläche ohne Ätzung bietet, was für Einzelmolekülstudien mit Fluoreszenzbildgebung vorzuziehen ist.
    1. Die Säure-Waschmethode erfordert eine Abzugshaube beim Erhitzen der Lösung und der PSA (Schutzbrille, Laborkittel, Handschuhe). Eine Spritzflasche mit Natriumbicarbonat sollte im Dunsthaube verfügbar sein, falls es verschüttet wird.
    2. Füllen Sie die Deckblätter in ein Becherglas und füllen Sie sie mit nanoreinem Wasser, 30 % Wasserstoffperoxid und konzentrierter Salpetersäure in gleichen Teilen nach Volumen (1:1:1 Lösung).
    3. Erhitze die Überdeckfolien in dieser Lösung 30 Minuten, bis die Lösung zu blubbern beginnt.
    4. Überprüfen Sie die Lösung und vermischen Sie sie alle 10 Minuten sanft, um zu verhindern, dass die Deckfolien zusammenkleben. Beim Wirbeln der Lösung beobachten Sie, wie die Rutscher auseinanderrutschen und sich dann trennen. Sobald sie getrennt sind, verlangsamen Sie sich allmählich, um sie auseinander zu halten, damit die blubbernde Lösung die Glied umhüllen kann.
      HINWEIS: Die Lösung sollte nicht zu stark erhitzt werden, da die Reaktion Wärme erzeugt. Stelle die Heizplatte auf ein sanftes Blubbern ein, meist auf der niedrigsten Stufe. Bei diesen Einstellungen bleibt die Lösung bei ~70 °C. Frisches Wasserstoffperoxid wird ebenfalls empfohlen.
    5. Sobald 30 Minuten vergangen sind oder die Lösung aufhört zu blubbern, lassen Sie die 1:1:1-Lösung auf Zimmertemperatur abkühlen und spülen Sie die Überdeckfolien gründlich mit gereinigtem Wasser und sanftem Wirbeln ab.
  2. UV-Ozon
    1. Reinigen Sie die Quarz-Überdeckfolien mit N-Hexan, dann Methanol und verwenden Sie Linsengewebe.
    2. Legen Sie die Überdeckfolien in einen UV-Ozonreiniger, wobei die zu behandelnde Oberfläche zur Lampe zeigt.
    3. Sauerstoff mit 5 psi für 5 Minuten in die Kammer leiten lassen; Dann schalten Sie den Sauerstofffluss ab.
    4. Als Nächstes schalten Sie die UV-Lampen für 15 Minuten ein und lassen Sie die Überdeckfolien mindestens 10 Minuten wirken, damit das Ozon entweicht.
    5. Nach der Anwendung einer der Reinigungsmethoden sollten Sie die gereinigten Deckschichten sofort verwenden. Wenn Sie zuvor gereinigte Schlüpfe verwenden, wiederholen Sie den Vorgang, um die Oberfläche zu regenerieren.
      HINWEIS: UV-Ozonisierung erfordert eine konstante Zirkulation, um das Ozon aus der Luft zu entfernen. Das System sollte unter einem Luftschnorchel oder in einer Abzugshaube untergebracht werden.

4. Bildung und Einbindung von AQP4 in eine Doppelschichtmembran

HINWEIS: Der in dieser Studie verwendete Puffer bestand aus 100 mM HEPES, 5 mM CaCl2 und 140 mM NaCl bei pH 7,4.

  1. Lege den frisch gereinigten Deckdeckel in einen 25-mm-Probenhalter mit einem 1/4-Zoll-SM1-Objektivrohr. Dann schneiden Sie eine 8 mm durchmessige, doppelschichtige Parafilmdichtung und positionieren Sie sie in der Mitte des Probenhalters (siehe Abbildung 3).
  2. Tragen Sie einen 50-μL-Tropfen der SUVs in die Mitte der 8-mm-Dichtung auf, dichten Sie sie ab und inkubieren Sie dann 1 Stunde bei 37 °C.
    HINWEIS: Dies ermöglicht es, dass die Liposomen mit der hydrophilen Quarzoberfläche verschmelzen und platzen, wodurch eine kontinuierliche Doppelschicht entsteht.
    Es ist höchstwahrscheinlich, dass die Menge an Liposomen, die dem Dichtungsbereich zugesetzt werden, variieren kann, und eine größere Dichtung benötigt möglicherweise mehr Liposomen, um eine kontinuierliche Doppelschicht zu bilden. Die in Schritt 4.2 angegebenen Mengen fördern jedoch fast immer die Bildung einer kontinuierlichen Doppelschicht.
  3. Nach der Inkubation spülen Sie die Probe mit einer Pipette ab, um die Lösung zu entfernen. Dann fügen Sie 50 μL frischen Puffer zur Doppelschicht hinzu. Dann wiederholen Sie den Vorgang insgesamt zehnfach.
    HINWEIS: Es ist entscheidend, dass die Pipettenspitze die Lipiddoppelschicht nicht berührt und eine Lösung verbleibt, um die Doppelschicht hydratisiert zu halten. Wenn du die Spitze an die Spitze des Tropfens bringst, wirst du sehen, wie sie Kontakt hat. Du kannst die Lösung entfernen, ohne die Doppelschicht zu beschädigen, indem du minimalen Kontakt zur Tropfenoberfläche aufrechterhältst. Schließlich dreht sich der Tropfen um und zieht sich in Richtung der Dichtung; Dies ist der ideale Zeitpunkt, um die Lösung nicht mehr zu entfernen. Das reflektierte Licht sollte sich an diesem Punkt ändern und kann als Signal zum Stoppen dienen. Wenn du befürchtest, zu viel Lösung zu entfernen, senke die Pipetteneinstellung beim Waschen, um eine angenehme Puffermenge über der Lipiddoppelschicht zu haben.
    Die Integrität der Lipiddoppelschichtbildung unter diesen Bedingungen kann im Voraus mittels der Fluoreszenzrückgewinnung nach der Photobleaching (FRAP) bewertet werden. Dies erfordert eine Komponente in der Lipidmischung, die fluoreszierend markiertist mit 6,7,24,25.
  4. Nach Abschluss der Endreinigung entferne ich den Puffer erneut und gib ein 50 μL Aliquot des gewünschten Proteins in Waschmittel bei oder unter der kritischen Mizellenkonzentration hinzu. Planen Sie mindestens 1 Stunde für die Proteinaufnahme bei 37 °C ein.
    HINWEIS: Das Waschmittel macht die Doppelschicht sanft weich und hilft dem Protein, sich in die Membran einzugliedern. In diesem Protokoll wurde 50 μM n-Dodecyl-beta-D-thiomaltosid (DOTM), ein nicht-ionisches Waschmittel, verwendet, und die Proteinkonzentration betrug 2 nM.
  5. Nach einer Stunde spülen Sie die Probe mit einem Puffer ab, um nicht integriertes Protein und Waschmittel zu entfernen.
  6. Gib der Probe 5 mg Condition-Polystyrolperlen (Bio-Beads) hinzu und lasse sie mindestens 1 Stunde vor dem Entfernen stehen. Die Probe ist dann für die Bildgebung bereit (siehe unten).

5. Antifade-Zusatzstoff

  1. Lösen Sie 5 mg Trolox und 80 mg D-Glukose in 10 ml Puffer auf (siehe oben). Schütteln und Wirbeln, bis keine Feststoffe mehr übrig sind. Über Nacht im Dunkeln nutieren und dann die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter filtern. Bereite wöchentlich frisch vor.
  2. 6,5 mg Glukoseoxidase (1650 U) und 8 μL Catalase (29.200 U/mL im Puffer) in 92 μL Puffer auflösen. Mische die Lösung vorsichtig ohne Vortex, dann zentrifugiere und übertrage den Überstandsstoff in ein neues Rohr. Lagere bei 4 °C und schütze vor Licht.
    HINWEIS: Diese Lösung kann mehrere Monate im Kühlschrank gelagert werden; Sollte jedoch Trübung auftreten, entsorgen Sie sie und bereiten Sie eine neue Lösung vor.
  3. Mischen Sie 99 μL Lösung aus 5,1 mit 1 μL aus Schritt 5,2 in ein neues Rohr. Nach der abschließenden Spülung der Probe wird die Antifade-Lösung auf die Probe gegeben (die sogenannte Bildgebende Lösung).
    HINWEIS: Antifadelösungen können die Funktionen von Transmembranproteinen verändern; Es ist wichtig, die Kompatibilität mit dem System zu überprüfen.

6. Mikroskop-Aufbau und -einstellungen

HINWEIS: Für diese Einzelmolekülstudie wurde ein maßgeschneidertes TIRF-Mikroskop verwendet. Dieser Abschnitt beschreibt die Hauptkomponenten und wichtigsten Ausrichtungstechniken für ein grundlegendes Fluoreszenzmikroskop, das für schnelle Zeitrafferbildgebung geeignet ist (Abbildung 4), das ein zuverlässiges Instrument ist.

  1. Verwenden Sie einen 633 nm He:Ne-Laser, um die Proben anzuregen. Der Laser durchläuft einen Bandpassfilter und eine 1/4-Wellen-Platte, um die Laserlinie zu verfeinern und die Anregung von linear polarisiertem Licht in zirkular polarisiertes Licht umzuwandeln.
    HINWEIS: Zirkulare Polarisation verringert die Wirkung der Ausrichtung der Sonde.
  2. Der Strahl durchquert ein 300-mm-Objektiv und einen 633 nm Laserlinienfilter, reflektiert von einem 633 nm langpassigen dichroischen Spiegel und wird auf die Rückseite eines 100x, 1,45 N/A-Ölmikroskopobjektivs fokussiert. Richten Sie den Balken so aus, dass er glatt durch die Mitte des Objektivs fliegt und beim Verlassen des Objektivs gerade bleibt.
    HINWEIS: An diesem Punkt ist das Mikroskop auf Epifluoreszenz (Epi) konfiguriert. Eine kleine Menge Milchpulver kann einer Cuvette mit klarem Boden hinzugefügt werden. Die Cuvette wird dann auf das Mikroskopobjektiv gelegt, mit einem Tropfen Immersionsöl dazwischen. So kannst du beobachten, dass der Strahl direkt durch das Ziel hindurchläuft.
  3. Die Emission der fluoreszenzmarkierten Proteine passiert das Objektiv, den dichroischen Spiegel, den Langpassfilter und ein 300-mm-Objektiv und wird dann auf eine EMCCD-Kamera abgebildet. Verwenden Sie Röhrenobjektive mit längerer Brennweite, um Bilder auf der Kamera zu vergrößern und die Superlokalisierungsgenauigkeit zu verbessern, was für langsam bewegende transmembranale Proteine und Aggregate vorteilhaft ist. Kalibrieren Sie unbedingt die Kamerapixel auf Nanometer.
    HINWEIS: Die 1-fache Vergrößerung wird jedoch mit der vom Hersteller des Objektivs angegebenen Röhrenlinse erreicht, die das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht, indem die Fluoreszenz auf weniger Pixel fokussiert wird. Gängige Brennweiten sind 200 mm, 180 mm, 165 mm und 164,5 mm. Wir empfehlen die Verwendung eines USAF Vergrößerungsziels von 1951. Mit einem 300-mm-Objektiv in diesem Setup wurde eine Pixelkalibrierung von 74 nm bei einer Gesamtvergrößerung von 170-fach gemessen.
  4. Kontrolle der Temperatur der Probe mit einem Objektivhalsband und einem Probehalter mit einem Peltier-Heizer/Kühler 26.
    HINWEIS: Die Aufrechterhaltung einer stabilen Temperatur ist entscheidend, um die thermische Stabilität des Mikroskops zu gewährleisten und präzise, temperaturabhängige Messungen sowie Instrumentenfokussierung zu ermöglichen.
  5. Piezo-Aktuatoren bewegen die Probe in XYZ-Richtungen. Sobald eine Probe scharf ist, stellen Sie den Strahl an den Rand des Mikroskopobjektivs an (siehe Abbildung 4) mit der am Enddrehspiegel befestigten Stufe ein, bis ein kritischer Winkel erreicht ist. Dies erzeugt ein evaneszentes Anregungsfeld. Das Mikroskop ist jetzt im TIRF eingestellt.
    HINWEIS: Man kann feststellen, dass das Mikroskop im TIRF ist, wenn die Rückreflexion des Lasers eine Linie (nicht ein Fleck) ist und der Hintergrund der Probe an Intensität abnimmt und sich verlängert.

7. Datenerhebung

HINWEIS: Die Kamera muss für eine schnelle Datenerfassung eingerichtet werden.

  1. Stellen Sie die vertikale Pixelverschiebungsgeschwindigkeit auf etwa 600 ns ein und übertakten Sie die vertikale Taktspannung (typischerweise +4). Stellen Sie dann die horizontale Pixelanzeige auf ihre maximale Einstellung ein (30 MHz bei 16 Bit in diesem Beispiel). Stellen Sie die Vorverstärkerverstärkung auf 2 ein und konfigurieren Sie den Verstärkerausgang für die Elektronenmultiplikation. Stellen Sie schließlich die Verstärkung des Elektronenmultiplikators auf das höchste Niveau.
  2. Stelle die Belichtung auf 25 ms ein. Bei 25 ms Belichtung sollten Sie darauf achten, dass die Bildrate etwas länger ist (25,802 ms auf der hier verwendeten Kamera).
  3. Stellen Sie die Laserleistung so an, dass das Signal klar über dem Hintergrund liegt.
    HINWEIS: Die Einstellung der Laserleistung kann herausfordernd sein. Zu hoch, und die Sonde bleicht zu schnell; zu niedrig, und das Signal-Rausch-Verhältnis erschwert das Tracking. Wir empfehlen, die Leistung so einzustellen, dass das Signal den Hintergrund bei den Teilchen mit dem schwächsten Signal um das 3-5-fache übersteigt. Abschnitt 2 erklärt, warum molekulare Helligkeit eine Verteilung zeigt.
  4. Sammeln Sie genug Daten, um mindestens 1.000 Spuren pro Sample bereitzustellen.

8. Tracking-Analyse

HINWEIS: In unseren Laboren wird die Einzelteilchen-Tracking-Analyse typischerweise mit benutzerdefinierten Skripten in MATLAB durchgeführt, die auf Arbeiten von Crocker und Grier basieren und von den Autoren 3,26,27 modifiziert wurden. Nachfolgend eine Beschreibung mit ImageJ, einer frei verfügbaren Software für die Forschungsgemeinschaft. Beide Methoden liefern identische Ergebnisse.

    9. Datenverarbeitung

    HINWEIS: Hier wird erläutert, wie man die repräsentativen Daten verarbeitet und wie man Schrittgrößenverteilungen berechnet und eine durchschnittliche Diffusionskonstante bekommt.

    1. Ziehe und lasse den Bildstapel in FIJI fallen; Dann wenden Sie die Kalibrierung an (74 nm/Pixel).
    2. Subtrahieren Sie den Hintergrund mit der Rolling-Ball-Subtraktion mit einer Breite von 5 Pixeln. Schneiden Sie das Feld in vier separate Abschnitte von 11 μm x 11 μm und analysieren Sie es separat.
      HINWEIS: Dies dient dazu, jegliche Schwellenschwankung durch das Anregungsfeld beim Tracking von Membranproteinen zu minimieren.
    3. Starte das TrackMate-Plugin . Überprüfen Sie, dass die Kalibrierung auf die Pixel angewendet wird (siehe Supplemental File 3) und dass die Zeit den gewünschten Bereich abdeckt.
      1. In TrackMate wählen Sie den Laplace-Operator des Gaußschen (LoG) als Detektionsmethode für die Partikel mit einem geschätzten Durchmesser von 350 nm mit dem Vorprozess-Medianfilter. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Vorschau", um zu überprüfen, ob die detektierten Teilchen angemessen sind.
        HINWEIS: Einige Teilchen können eindeutig im Hintergrund sein; Machen Sie sich keine Sorgen – sie werden im nächsten Schritt beseitigt.
      2. Wenn Sie mit den Zähleinstellungen zufrieden sind, verarbeiten Sie den Rest des Stacks, gefolgt von der Schwellenwertung. Verwenden Sie automatische Schwellenwerte oder ziehen Sie das Auswahlfeld, um die Schwelle anzupassen.
      3. Nachdem Sie gewählt haben, wie die detektierten Partikel visualisiert werden, wählen Sie für diesen Datensatz die Tracking-Methode: Advanced Kalman Tracker , mit folgenden Einstellungen: 350 nm für die Suchradien und einer maximalen Bildabstand von 2 Bildern.
        HINWEIS: Es ist auch möglich, Strafen, Gleisaufteilung und Gleiszusammenführung hinzuzufügen. Für diesen Datensatz wurde nur eine Nachverfolgung durchgeführt.
      4. Entscheide, wie du die Spuren filterst und visualisierst.
        HINWEIS: In diesem Datensatz werden nur erkannte Flecken angezeigt (siehe Supplemental File 4).
      5. Nach der Verarbeitung der einzelnen Spuren exportieren Sie die Tracking-Daten als XML-Datei für die Verwendung in einer Tabellenkalkulations-Bearbeitungssoftware (siehe Supplemental File 5).

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Wie in Protokollabschnitt 2 beschrieben, wurden Lysine mit NHS-Estern etikettiert, die mit einem fluoreszierenden Farbmolekül (NHS-Farbstoff) konjugiert waren. Nach der Konjugation mit dem Protein misst man das DOL mit einem UV-Vis-Spektrometer. Für dieses Experiment betrug der DOL der AQP4-Tetramere 4,12. Bestimmen Sie anschließend die Wahrscheinlichkeit, dass jedes AQP4-Tetramer mindestens ein Farbstoffmolekül besitzt, anhand der unten angegebenen Poisson-Verteilung.

    figure-results-1(2)

    Wobei P die Wahrscheinlichkeit ist, dass jedes AQP4 beschriftet ist, beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass jedes AQP4-Tetramer ein fluoreszierendes Etikett besitzt, mit Gleichung 2 98 %. Die Verteilung der Labels pro Tetramer ist in Abbildung 2 dargestellt und spiegelt die in der Probe beobachtete Helligkeitsverteilung wider.

    Das in diesem Beispiel erreichte Signal-Rausch-Verhältnis betrug 8–9x über dem Hintergrund für einen einzelnen Fluorophor und über 15–20 für die hellsten Teilchen. Diese Varianz ergibt sich aus der Position im Anregungsstrahl und dem in Protokollschritt 2 beschriebenen DOL.

    Innerhalb der generierten XML-Datei sind die interessanten Spalten J, K, L und M, die der Partikelnummer-ID, dem Frame, in dem das Teilchen erkannt wurde, der X-Position des Teilchens und der Y-Position des Teilchens entsprechen (siehe Supplemental File 6). Im zweiten Blatt der Datei werden die Schrittgrößenverteilung und der durchschnittliche Diffusionskoeffizient berechnet, wobei die Schrittweiten die Distanzen sind, die ein Teilchen zwischen den Frames zurücklegt, und die durchschnittliche Diffusion durch Gleichung 3 gegeben ist:

    figure-results-2(3)

    Dabei ist Dave der durchschnittliche Diffusionskoeffizient und Δt die Bildrate. Diese Gleichung setzt eine Brownsche Bewegung voraus, die im Allgemeinen für kleine Verschiebungen gilt und durch die Analyse des Mittelwert-quadratischen Verschiebungs-gegen-Zeit-Tags aus einer Stichprobe einzelner Spuren 3,30,31 bestätigt werden kann.

    Ein Histogramm der Schrittweiten zeigt eine Verteilung der diffusen Teilchen, die auf unterschiedlich große OAPs zurückzuführen ist (Abbildung 5).

    figure-results-3
    Abbildung 1: Lipid-Trocknungsgerät. Das Gerät besteht aus einem 10 ml Rundbodenkolben mit einem Vakuumdestillationsanschluss. Stickstoff gelangt bei niedrigem Druck durch einen 0,2-μm-Spritzenfilter mit einer Nadel, die an einer gelben Synthesekappe befestigt ist, welche mit einem Vakuumdestillationsstecker verbunden ist. Der Druck wird durch Tygon-Schläuche, die an einer Spritze mit einer abgeschnittenen Nadel befestigt sind, abgegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

    figure-results-4
    Abbildung 2: Erwartete Verteilung der fluoreszierenden Markierungen auf jeder AQP4-Einheit unter Verwendung von Gleichung 2. Die wahrscheinlichste Anzahl von Fluorophoren beträgt 4, und 98 % aller AQP4 haben ein fluoreszierendes Etikett. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

    figure-results-5
    Abbildung 3: Probenhalter-Montage. Die Baugruppe besteht aus einem 1" SM1-Linsenrohr, bei dem die Außengewinde entfernt und abgeschrägt sind, um Interferenzen mit dem Mikroskopobjektiv zu vermeiden. Enthält einen Quarz-Deckmantel und eine Parafilm-Dichtung. Die gesamte Baugruppe ist mit einem SM1-Haltering gesichert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

    figure-results-6
    Abbildung 4: Mikroskop. Auf der rechten Seite ist ein vereinfachtes Diagramm des Mikroskops zu sehen; Die grüne Linie zeigt das Anregungslicht, das vom Laser ausgeht. Ausgehend von rechts passiert das Laserlicht eine 1/4-Wellenplatte und wird dann von einem 300-mm-Objektiv fokussiert. Das Licht wird von einem langdurchgehenden dichroitischen Spiegel auf das Objektiv reflektiert, wo es auf die hintere Öffnung fokussiert wird. Durch die Verwendung eines Translationsspiegels zur Verschiebung des Anregungsstrahls wird der Strahl am Rand der Blende des Objektivs positioniert und erzeugt so ein evaneszentes Feld in der Probe. Das scharf ausgesendete Licht wird vom Objektiv erfasst und durch die rote Linie dargestellt. Das ausgestrahlte Licht durchläuft dann den Dichroic, dann einen Langpassfilter, und wird mit einem 300-mm-Objektiv auf die Kamera fokussiert, was eine 1,7-fache optische Vergrößerung (170-fache Gesamtvergrößerung von Objektiv und Röhrenobjektiv) ermöglicht. Auf der linken Seite ist ein Bild des Mikroskops zu sehen. Beachten Sie, dass zusätzliche Drehspiegel verwendet werden, um den Laser korrekt zu positionieren. Gleichzeitig ist der Nachweisarm so angeordnet, dass die Photonensammlung aus den fluoreszenzmarkierten transmembranen Proteinen maximiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

    figure-results-7
    Abbildung 5: Histogramm der Schrittweiten. Die blaue Linie mit roten Kreisen ist ein Histogramm aller Schrittgrößen. Die schwarze Linie passt zu mehreren Diffusionskoeffizienten. Die Schrittgrößen-Wahrscheinlichkeitsverteilung ergibt sich durch: figure-results-8 wobei fi die fraktionale Population jedes Typs diffusierender Teilchen ist, unter der Annahme, dass jedes eine Brownsche Bewegung durchläuft. Das Histogramm und die Passung zeigen eine heterogene Verteilung langsamer und schneller bewegender Partikel, die auf eine Verteilung mehrerer OAP-Größen zurückzuführen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

    Ergänzungsakte 1: Tabellenkalkulationsrechner, der verwendet wird, um Mol%-Zusammensetzungen, Gesamtfettmengen und optionale fluoreszierende/FRAP-Komponenten für SUV-Präparation zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

    Ergänzungsdatei 2: Roher Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie-Zeitraffer-Bildstack, der bei der Trajektorienverfolgung verwendet wird (Quelldatei für das TrackMate-Tutorial). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

    Ergänzende Datei 3: Animierte Vorschau der rohen Einzelmolekül-Fluoreszenzdaten, die Intensität und Hintergrund vor der Verarbeitung zeigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

    Ergänzende Datei 4: Animation gefilterter Teilchenpfade (nach der Schwellenwertzahl), die repräsentative AQP4-Bahnen über die Zeit zeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

    Supplemental File 5: Animierte Überlagerung, die die vollständige Partikelverfolgung von AQP4-Molekülen mit TrackMate-Ausgabe zeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

    Ergänzende Datei 6: Tabelle mit extrahierten Trajektorienkoordinaten und berechneten Schrittgrößenverteilungen für die Diffusionsanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    In diesem Artikel stellen wir eine Einzelteilchen-Tracking-Methode vor, um einzelne Membranproteine direkt zu beobachten, wie sie sich durch eine festgestützte Lipiddoppelschichtmembran bewegen und miteinander interagieren. AQP4 wurde als repräsentatives Beispiel gewählt, weil es in der Lage ist, dynamische Selbstversammlungen zu bilden, die durch seine verschiedenen Isoformen 32,33,34 reguliert werden. Oben skizzieren wir eine zuverlässige Methode zur Probenvorbereitung und wichtige Parameter zur Verfolgung von Single-Membran-Proteinen auf Millisekundenzeitskalen. Die Schritte umfassen: (1) Vorbereitung von SUVs, (2) Bestimmung des geeigneten Niveaus der fluoreszierenden Markierung, (3) Vorbereitung fester Unterlagen, (4) Herstellung transmembraner Proteinproben innerhalb einer fest unterstützten Lipiddoppelschicht, (5) Herstellung von Antifade-Mitteln, (6) Bau eines einfachen Einzelmolekülmikroskops, (7) Erfassung von Einzelmolekül-Trackingdaten und (8) Analyse der Tracking-Daten mit ImageJ.

    Die beschriebene Schritt-für-Schritt-Methode ist konzeptionell unkompliziert; Allerdings hat jeder entscheidende Schritt seine eigenen Fallstricke und Einschränkungen. Unter diesen ist die Probenvorbereitung die herausforderndste (Schritte 1–5). Daher sollten mehrere Details im Hinterkopf behalten werden. Die erste ist, wie man eine fest getragene Lipiddoppelschicht erzeugt. Es gibt drei Hauptmethoden: (1) Langmuir-Blodgett (LB), (2) SUV-Fusion und -Ruptur und (3) Spin-Coating 35,36,37,38,39. Jede Methode hat ihre Vor- und Nachteile. Beispielsweise bietet die Langmuir-Blodgett-Methode eine größere Kontrolle über die Eigenschaften und chemische Zusammensetzung von Doppelschichten, einschließlich asymmetrischer Zusammensetzungen zwischen den beiden Blattblöchern, und ermöglicht die Bildung von Mehrschichten auf kontrollierte Weise. Die Nutzung eines LB-Trogs ist jedoch technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig und kostspielig,35 zu beschaffen. Spin-Beschichtung ist eine relativ einfache Technik zur Herstellung von Lipid-Doppelschichten; Allerdings erzeugt es tendenziell Mehrschichten und benötigt einen großen Überschuss an Material, oft eine unpraktisch großeMenge 39. Vesikelfusion und -ruptur sind einfache Prozesse, die nur eine geringe Menge Material benötigen. Allerdings ist die Schaffung einer hydrophilen Oberfläche entscheidend, und einige Lipidzusammensetzungen bilden Doppelschichten durch Vesikelfusion leichter als andere (z. B. haben wir in unserem Labor festgestellt, dass Vesikel mit einer netto negativen Ladung nur durch Vesikelfusion mit der Zugabe divalenter Kationen und verlängerten Inkubationszeiten Doppelschichten bilden)40. Neben der Festlegung einer hydrophilen Oberfläche (Schritt 3) gehören weitere wichtige Überlegungen bei der Bildung einer fest getragenen Doppelschicht durch Vesikelfusion das Waschen der neu entstandenen Doppelschicht sowohl vor als auch nach der Einbindung des Membranproteins. Die Voreinführungswasche entfernt überschüssige SUV- und größere multilamellenare Vesikel (MLVs), während die letzte Waschung nach der Membraneinführung das nicht inkorporierte Protein entfernt. Unzureichende Wäsche kann während der Verfolgungsstudien Hintergrundsignale erzeugen.

    Wir haben zahlreiche Reinigungsmittel getestet, um festzustellen, ob sie für die Transmembranproteineinführung in festgestützte Lipiddoppelschichten geeignet sind, darunter C12E9, Tween-20, TritonX-100 und viele andere. Unser bevorzugtes Waschmittel ist DOTM, weil es leicht zu entfernen ist und am sanftesten für die Membran ist (es stört die Membranintegrität geringer). Die zugesetzte Proteinmenge ist entscheidend. Zu viel, und es wird unmöglich sein, einzelne Spuren zu beobachten. Bei der Anpassung dieses Verfahrens an andere transmembrane Proteine muss die Menge durch Versuch und Irrtum angepasst werden. Die in diesem Verfahren angegebenen Mengen sind jedoch ein ausgezeichneter Ausgangspunkt. Die Menge des Waschmittels muss bei oder unter der kritischen Mizellenkonzentration gehalten werden; ansonsten wird die Doppelschicht gelöst und vom Quarzsubstrat entfernt.

    Die Einfügung von Membranproteinen in die unterstützte Lipiddoppelschicht muss für jede Menge experimenteller Bedingungen optimiert werden. Es gibt jedoch einige gängige Methoden, um dies zu erreichen, darunter die Verwendung von Proteoliposomen und die direkte Einbindung von Membranproteinen in eine vorgefertigte Doppelschicht41. Ein Proteoliposom ist ein Liposom, wie zum Beispiel ein SUV, mit einem eingebetteten Protein. Diese Proteoliposome können mit einer vorgefertigten, fest getragenen Lipiddoppelschicht fusionieren oder gleichzeitig mit den SUVs während der Doppelschichtbildung42 integriert werden. Die Verschmelzung verursacht einen Riss, wodurch das Protein in die Membran freigesetzt wird. Sie ist einfach zu implementieren, führt aber zu einer zufälligen Ausrichtung der Membranproteine. Dies kann zu starken Wechselwirkungen mit dem festen Träger führen, was je nach Orientierung des Proteins zu unterschiedlichen Diffusionseigenschaftenführt. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die direkte Inkorporation nutzt und eine orientalische Präferenz für AQP4 und andere Membranproteine mit großen hydrophilen Domänen auf einer Seite des Proteins 2,5,43,44 liefert.

    Direkte Beobachtung ist ein mächtiges Werkzeug bei wissenschaftlichen Entdeckungen. Die dynamische Einzelmolekülbildgebung ist besonders wichtig in der Membran-Protein-Biophysik, wo die Beobachtung der Bewegung und Wechselwirkungen einzelner Proteine genutzt wird, um Hypothesen zu testen oder neue zu entwickeln, die das Verhalten eines Proteins besser beschreiben. Das hier beschriebene Protokoll und die beschriebenen Methoden sind ideal für zweidimensionale, fest getragene Lipiddoppelschichten, können aber auf komplexere Umgebungen mit mehreren Komponenten2, lebenden Zellen34, 45, 46, 47 und drei Dimensionen48 ausgeweitet werden. Das Einzelmolekül-Tracking öffnet viele weitere Experimente, darunter zweifarbige Einzelmolekül-Tracking49, Einzelmolekül-FRET 50,51 und dynamische Superauflösungsbildgebung wie Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) und Point Accumulation Imaging Nanoscale Topography (PAINT). Durch die Erweiterung des Instruments um Temperaturregelung können auch die thermodynamischen Eigenschaften von Membranproteinen erforscht werden.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Diese Arbeit wurde vom Air Force Office of Scientific Research FA9550-20-1-0324, FA9550-23-1-0583 (J.A.B. und G.P.N.) und FA9550-1-1-0395 (J.A.B.) unterstützt.

    G.P.N. erkennt folgende Förderorganisationen an:
    (1) NEXTGENERATIONEU (NGEU), finanziert vom Ministerium für Universität und Forschung (MUR), National Recovery and Resilience Plan (NRRP), Projekt MNESYS (PE0000006) – Ein multiskaliger integrierter Ansatz zur Untersuchung des Nervensystems in Gesundheit und Krankheit (DD Nr. 1553, 11.10.2022)
    (2) NEXTGENERATIONEU (NGEU), finanziert vom Ministerium für Universität und Forschung (MUR), National Recovery and Resilience Plan (NRRP), Projekt CN_00000041 – Nationales Zentrum für Gentherapie und Medikamente auf Basis von RNA-Technologie (DD Nr. 1035, 17.06.2022).

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    1/4 WellenplatteThorlabsWPQ05M-633Achte darauf, dass der Laser abgestimmt ist
    100-faches Öl-ZielOlympus12-563-6591,45 N/A apochromatisch
    16:0-18:1 PCAvantipolare Lipide850457POPC-Phospholipide
    18:0 PEG2000 SportunterrichtAvantipolare Lipide880210Ammoniumsalz
    300mm-ObjektivThorlabsAC254-300-A-ML
    633 nm He:Ne-LaserMelles Griot05-LHP-927Kann auf andere Quellen und auf andere Wellenlängen umgestellt werden.
    633-nm-BandpassfilterChroma Tech633/10XÜbereinstimmung mit dem verwendeten Laser
    655-nm LangpassfilterChroma TechET655lpÄnderung an die Wellenlängen des Farbstoffs/Lasers anzupassen
    Andor Solis IAndor Andor Solis ISoftware zur Bildaufnahme
    ATTO 655 ATTO-TEC655 n. Chr.NHS-Ester-Modifikation, jeder Farbstoff mit der Modifikation, die für die Arbeit an einzelnen Molekülen geeignet ist, kann verwendet werden. ATTO wird empfohlen, aber Cy5/7 kann verwendet werden
    Bioperlen SM-2 HarzBioRad1523922
    CalciumchloridMillipore SigmaC4901
    CatalaseSigma-AldrichC3155-50MGAus Rinderleber, wässrige Soltion, ≥ 30.000 Einheiten/mg
    ChloroformFisher Scientific C547-1HPLC- oder spektroskopische Qualität
    CholesterinSigma-AldrichC8667-500MG
    DeckzettelESCO OptikR52500025mm Quarz
    Dichroischer StrahlteilerSemrockFF545/650-Di01-25x36Änderung an die Wellenlängen des Farbstoffs/Lasers anzupassen
    EMCCD-KameraAndor iXon Ultra 888
    Falcon-Röhren 15 ml Greiner Bio-one188261Cellestar-Zellkulturröhren
    GlukoseoxidaseSigma-AldrichG2133-50KUaus Aspergillus niger, Typ VII, ≥ 100.000 Einheiten/g Feststoff (ohne zugesetzten Sauerstoff)
    HeißluftpistoleHarbor Freight56434Bei der Erhitzung des Parafilms konnte in der Regel jede Heißluftpistole verwendet werden
    HEPESFisher-BioreagenzienBP310-500
    Niedrigfluoreszenz-ImmersionsölThorlabsMOIL-30
    MethonalFisher Scientific A452-1HPLC- oder spektroskopische Qualität
    Mikro-ZentrifugenröhreVMR525-11261,5 mL 
    Mikro-PipettersEpendorfVerschiedene; 1000 & Mikro; L, 100 & Mikro; L und 10 & Mikro; L werden vorgeschlagen
    Ø 1,5" ObjektivröhrenThorlabsSM1.5L10Der externe Thread wird für die Sample-Vorbereitung abgeschnitten
    Optische TabelleNewportRPR RelianceDie Größe der Tabelle hängt vom verfügbaren Speicherplatz ab
    Optische GewebeThorlabsMC-50EReinigung verschiedener Bauteile
    ParafilmMillipore SigmaP7669Überprüfen Sie während des Prozesses, dass keine fluoreszierenden Gase ausweichen
    Piezo-AktuatorNewportPZA12
    Pneumatische SchwingungsisolatorenNewportI-2000-Seriezur Stabilisierung der optischen Tabelle bei jeglichen Ungleichheiten 
    KühlbadFisher Scientific Isotemp 3016
    VerschlussreglerThorlabsSC10Verknüpft mit der Bildgebungssoftware
    NatriumchloridMillipore SigmaS988
    Steritop-FilterMillipore SigmaS2GPT05RE
    Switchbox-Treiber und Controller NewportPZC200Stage-Controller
    SpritzenfilterJ.T. BakerSF01-98PES 25mm 0,2 & Mikro; M
    TEC-ElementThorlabsTEC3-2.5Wird verwendet, um die Peltirer-Wärmepumpe mit dem Probehalter und dem Objektivhalsband zu verbinden
    TemperaturkontrolleurMeerstetter EngineeringTEC-1091
    TemperaturdetektorThorlabsTH100PT
    ThermistorThorlabsTH10K
    Tube-O-DialysatorG Biosciences786-6114K MWCO
    UV-OzonreinigerNovascanPSDP_UVPro Series – Digital 
    Zoom Optics ThorlabsSM1NR1

    References

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