Methodenartikel

Modellierung mitochondrialer Erkrankungen anhand von Hirnorganoiden: Ein Fokus auf mitochondriale Enzephalomyopathie, Laktatazidose und schlaganfallähnliche Episoden

DOI:

10.3791/69303

⸱

10. Oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Kitasato University School of Medicine, 2Molecular Genetics Unit, Kitasato University Graduate School of Medical Science, 3Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Gene Therapy for Hearing Impairment and Deafness, Tübingen Hearing Research Center, University of Tübingen, 4Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 5Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University Medical Center, 6Institute for Disease Modeling, Kurume University School of Medicine, 7Department of Diabetes, Endocrinology and Nutrition, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 8Department of Clinical Biology and Hormonal Regulation, Tohoku University Graduate School of Medicine, 9Keio University Regenerative Medicine Research Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hirnorganoide dienen als wertvolles Modell für Studien zu mitochondrialer Enzephalomyopathie, Laktatazidose und schlaganfallähnlichen Episoden (MELAS), indem sie Einblicke in ihre zugrunde liegende Pathophysiologie bieten und eine Plattform für das Wirkstoffscreening bieten. Organoide, die aus Zelllinien mit unterschiedlichem Grad an Heteroplasmie von krankheitsverursachenden Genen stammen, weisen signifikante phänotypische Unterschiede auf.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale Enzephalomyopathie, Laktatazidose und Schlaganfall-ähnliche Episoden (MELAS) sind mitochondriale Erkrankungen, die am häufigsten durch eine m.3243A>G-Variante in der mitochondrialen tRNALeu verursacht werden. Um die Pathophysiologie von MELAS zu untersuchen, haben wir Hirnorganoide aus mehreren induzierten pluripotenten Stammzelllinien (iPSC) generiert, die von einem Patienten mit MELAS stammen, der die m.3243A>G-Variante trägt. Diese Linien haben einen identischen nuklearen genetischen Hintergrund, unterscheiden sich jedoch in ihren Heteroplasmiegraden, an denen die m.3243A>G-Variante beteiligt ist. Wir beobachteten signifikante Unterschiede in der Größe der Organoide, der Morphologie und der Effizienz der neuronalen Induktion, die mit dem Grad der Heteroplasmie korrelierten. Dissoziierte Neuronen aus den Organoiden wurden in ein 2D-Kultursystem überführt, das praktisch und geeignet für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening ist. Die Organoide zeigten auch signifikante Unterschiede in der Bildung neuronaler Netzwerke, abhängig vom Heteroplasmieniveau. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass patienteneigene iPSC-basierte Organoidmodelle eine nützliche Plattform für die Untersuchung von MELAS-Mechanismen und für das Wirkstoffscreening darstellen. In diesem Video werden umfassende und benutzerfreundliche Methoden vorgestellt, darunter Protokolle zur Generierung von Organoiden und zur Bewertung von Phänotypen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale Myopathie, Enzephalopathie, Laktatazidose und schlaganfallähnliche Episoden (MELAS) sind mitochondriale Erkrankungen, die durch neurologische Dysfunktionen, schlaganfallähnliche Episoden und verschiedene systemische Symptome gekennzeichnet sind. Die häufigste Ursache ist eine m.3243A>G-Variante im mitochondrialen Leucin-tRNA-Gen MT-TL11. Es wird angenommen, dass diese Variante die Taurinmodifikation am Anticodon beeinträchtigt, wodurch die Leucin-Translationseffizienz verringert und zur mitochondrialen Dysfunktion bei MELAS beiträgt 2,3,4. Insbesondere wurde über Verbesserungen der Symptome nach der Verabreichung von hochdosiertem Taurin berichtet 5,6. Das Vorhandensein von Non-Respondern deutet jedoch darauf hin, dass zusätzliche, noch nicht identifizierte pathophysiologische Mechanismen zur Erkrankung bei Individuen beitragen können, die die m.3243A>G-Variante tragen.

Um Krankheitsmechanismen, die durch genetische Varianten verursacht werden, aufzuklären, ist es ideal, experimentelle Modelle zu verwenden, in denen alle Variablen bis auf die ursächliche Variante identisch sind, was genaue phänotypische Vergleiche ermöglicht. Genom-editierte Zelllinien und Tiermodelle mit korrigierten Varianten werden häufig als Kontrollen für nukleare Genstörungen verwendet. Die Reparatur von mtDNA-Varianten bleibt jedoch selbst mit fortschrittlichen Genom-Editing-Technologien eine technische Herausforderung7. Daher bleibt die Etablierung von experimentellen Modellen mit identischem Kernhintergrund eine Herausforderung. Um dieses Problem zu lösen, verwendeten wir zwei induzierte pluripotente Stammzelllinien (iPSC), die von demselben Patienten mit MELAS stammen und sich nur in ihren Heteroplasmiewerten unterscheiden (d.h. dem Anteil der mitochondrialen DNA, die die MT-TL1 m.3243A>G Variante8 trägt), und generierten Gehirnorganoide als Krankheitsmodell. Obwohl die Heteroplasmiespiegel während der Zellpassage oder -differenzierung schwanken können, was möglicherweise die Phänotypen beeinflusst und zu einer Variabilität der experimentellen Ergebnisse von Charge zu Charge führt, bleiben von Patienten stammende Zellen, die mitochondriale Genvarianten tragen, für die Untersuchung der Krankheitspathogenese wertvoll.

In dieser Studie haben wir Hirnorganoide aus iPSCs generiert, die von einem Patienten mit MELAS stammen, und ihre Pathophysiologie untersucht, um die Krankheitsmechanismen besser zu verstehen. Unter Verwendung von zwei iPSC-Linien mit hohem und niedrigem Heteroplasmieniveau beobachteten wir signifikante Unterschiede in der neuronalen Induktionseffizienz, die mit dem Grad der Heteroplasmie korrelierten. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass patienteneigene iPSC-basierte Hirnorganoide eine wertvolle Plattform für die Aufklärung der Mechanismen bieten, die MELAS zugrunde liegen, und für die Erleichterung des Wirkstoffscreenings.

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Protokoll

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Die beiden iPSC-Linien (2-6 und 2-8) wurden mit etablierten Methoden aus den Fibroblasten desselben MELAS-Patienten gewonnen8. Sie unterscheiden sich nur in ihrem Heteroplasmie-Niveau. Die 414C2 iPSC-Linie, die von einer gesunden Person ermittelt wurde, wurde als Kontrolle verwendet. Das in dieser Studie verwendete Protokoll folgte den Richtlinien der Ethikkommission der Kitasato University School of Medicine (#G22-02).

1. Zellkultur

  1. Auftauen von gefrorenen Zellbeständen
    1. Bereiten Sie 6-Well-Platten vor, indem Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Laminin beschichten.
    2. Erwärmen Sie das Nährmedium für Feeder-freie iPSCs, die 10 μM ROCK-Inhibitor enthalten, auf 37 °C.
    3. Nehmen Sie das gefrorene iPSC-Fläschchen aus dem Flüssigstickstofftank (LqN2) und tauen Sie es schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf.
    4. Übertragen Sie die aufgetaute Suspension in 10 mL vorgewärmtes Medium. Bei 120 × g 5 min bei Raumtemperatur (22 °C) zentrifugieren.
    5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig wieder, indem Sie auf das Rohr klopfen. Geben Sie frisches Medium und Samenzellen in 6-Well-Platten, die mit Laminin vorbeschichtet sind. Inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2.
  2. Mittlerer Wechsel
    1. Ersetzen Sie das Medium (ohne ROCK-Hemmer) alle 1-2 Tage.

2. Erzeugung von zerebralen Organoiden

  1. Initiierung der Differenzierung (Tag 0)
    1. Entfernen Sie das Medium von iPSC-Kulturplatten (~70-80 % konfluent). Waschzellen mit PBS.
    2. Enzymlösung zugeben und 5 min bei 37 °C inkubieren.
    3. Füge Medium hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen. Bei 190 × g 5 min bei Raumtemperatur (22 °C) zentrifugieren.
    4. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Differenzierungsmedium, das 30 μM ROCK-Inhibitor, 5 μM SB431542 und 2,5 μM IWP-2 enthält.
      HINWEIS: Das Basismedium ist das gleiche wie das in Schritt 1.1.2 verwendete.
    5. Zählen Sie die Zellen. Seed 3 × 103 Zellen in 100 μl pro Well in U-förmigen 96-Well-Platten mit geringer Anhaftung. 6 Tage bei 37 °C, 5 % CO2 inkubieren.
  2. Mittlerer Wechsel (Tag 6)
    1. Übertragen Sie Organoide (aus Schritt 2.1.5) mit einer Pipette mit breitem Durchgang von einer 96-Well-Platte in eine 10-cm-Schale. Geben Sie 50 μl Medium (DMEM/F12 mit 1 % N2, 1 % Glutaminersatz, 1 % NEAA, 2,5 μM IWP-2, 5 μg/ml Heparansulfat und 1 % PS) in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte.
      HINWEIS: Verwenden Sie während der gesamten Experimente Pipetten mit breiter Bohrung, wenn Sie Organoide übertragen, um eine Störung ihrer 3D-Struktur zu vermeiden. Darüber hinaus sind 8-Kanal-Pipetten hilfreich, um Experimente schnell und genau durchzuführen.
    2. Organoide in 2-ml-Röhrchen sammeln. Entfernen Sie das Medium vorsichtig, um die Organoide nicht zu aspirieren, und fügen Sie 1,5 ml DMEM/F12 hinzu. 3x wiederholen, um die Organoide zu waschen.
    3. Das Medium entfernen und 500 μl frisches Medium in Röhrchen mit Organoiden geben. Übertragen Sie alle Organoide in eine 10-cm-Schale und fügen Sie dann 5 ml Medium hinzu, um die Aufnahme jedes Organoids zu erleichtern.
    4. Nehmen Sie ein einzelnes Organoid mit einer Mikropipette auf, die auf 50 μl eingestellt ist, und übertragen Sie es in eine Vertiefung mit einer 96-Well-Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Organoide auf die 96-Well-Platte (Endvolumen 100 μl) übertragen wurden. 3 Tage bei 37 °C, 5 % CO2 inkubieren.
  3. Mittlerer Wechsel (Tag 9)
    1. (Fakultativ) Übertragen Sie Organoide mit 8-Kanal-Pipetten in eine 10-cm-Schale. Überspringen Sie Schritt 2.3.1, wenn Sie Einkanal-Mikropipetten verwenden, und fahren Sie mit Schritt 2.3.2 fort.
    2. Organoide in 2-ml-Röhrchen sammeln. 3x mit DMEM/F12 waschen wie Schritt 2.2.2.
    3. Resuspendieren Sie in einem Differenzierungsmedium (1:1 DMEM/F12 und neurobasal) mit 1 % N2, 2 % B27 ohne Vitamin A, 100 μM 2-Mercaptoethanol (ME), 2,5 μg/ml Insulin, 1 % Glutaminersatz, 0,5 % NEAA und 1 % Basalmembranextrakt.
      HINWEIS: Bereiten Sie kleine Aliquots von Basalmembranextrakt für den einmaligen Gebrauch vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C. Tauen Sie den Extrakt bei 4 °C auf, ohne dass er 8 °C überschreitet, mischen Sie ihn dann in kaltes Medium und erwärmen Sie das Medium bei Raumtemperatur für ca. 30 min.
    4. Übertragen Sie ~10 Organoide pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte. Passen Sie das endgültige Volumen des Mediums für 1 Vertiefung auf 2 ml an. 6 Tage lang statisch bei 37 °C, 5 % CO2 kultivieren.
  4. Mittlerer Wechsel (Tag 15)
    1. Organoide in 15-ml-Röhrchen sammeln. Lassen Sie die Röhre ungestört, bis sich alle Organoide abgesetzt haben. Überstand entfernen und frisches Differenzierungsmedium zugeben (wie Schritt 2.3.3, jedoch mit B27 + Vitamin A).
      HINWEIS: Normalerweise setzen sich Organoide ohne Zentrifugation am Boden des Röhrchens ab. Kleine Organoide, die aus iPS-Zellen von Patienten gewonnen werden, sinken jedoch möglicherweise nicht effizient ab. In diesem Fall zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 120 × g für 3 min bei Raumtemperatur, um die Organoide zu sammeln.
    2. Übertragen Sie ~10 Organoide pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte. 15 Tage lang statisch bei 37 °C, 5 % CO2 kultivieren.
    3. Ersetzen Sie das Medium alle 5-7 Tage bis zum 30. Tag.

3. Dissoziation von zerebralen Organoiden für die 2D-Kultur (Tag 30)

  1. Beschichtung von Platten mit Poly-L-Ornithin (PO)
    1. Bereiten Sie PO-Stammlösung her, indem Sie 10 mg PO in 66,7 ml H2O auflösen und kleine Aliquote für den einmaligen Gebrauch herstellen. Lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C.
    2. Die PO-Stammlösung 1:5 mit H2O verdünnen und Kulturplatten mit der verdünnten Lösung bestreichen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  2. Laminin-Beschichtung
    1. PO entfernen und Vertiefungen 3 x 5 min mit PBS waschen.
    2. Laminin (1:1.000 in PBS) zugeben und bei 37 °C für 3 h oder über Nacht inkubieren.
      HINWEIS: Die Stammlösung von Laminin beträgt 1 mg/ml. Kleine Aliquots zubereiten und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.
  3. Dissoziation in einzelne Neuronen
    1. Tauen Sie die Dissoziationslösung vor Gebrauch 1 h lang bei 4 °C auf.
    2. Übertragen Sie die Organoide in ein 15-ml-Röhrchen und lassen Sie das Röhrchen ungestört, bis sich alle Organoide abgesetzt haben. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 5 ml PBS hinzu, um die Organoide zu spülen.
    3. Nach der Entfernung von PBS 1 ml Enzymlösung hinzufügen und vorsichtig 1–2x pipettieren. 5 min bei 37 °C inkubieren; mehrmals pipettieren. Falls erforderlich, weitere 2–3 Minuten inkubieren. Pipettieren Sie erneut, um die Dissoziation zu vervollständigen.
    4. Bei 200 × g 5 min zentrifugieren. Überstand entfernen, 1 ml Dispersionslösung zugeben und pipettieren.
    5. Schichtisolationslösung darunter legen und bei 200 × g 5 min zentrifugieren.
    6. 1 ml neuronales Medium (neurobasal mit 1 % B27, 0,25 % Glutaminersatz, 1 % PS) zugeben und mischen. Geben Sie die Suspension durch ein 70-μm-Sieb in ein 50-ml-Röhrchen.
    7. Zählen Sie die Zellen. Samenzellen zu 1 × 105 Zellen/cm2 auf PO/Laminin-beschichteten Platten. Ersetzen Sie das Medium alle 4-7 Tage bis zum 60. Tag.

4. Gewinnung von Zellen und Organoiden für die zelluläre und molekulare Analyse

  1. Organoid-Fixierung für Immunfluoreszenz (Tag 30)
    1. Organoide (Schritt 2.4.3) in Mikroröhrchen ernten.
    2. Entfernen Sie vorsichtig das Medium, um Organoide nicht zu aspirieren, und fügen Sie 1 ml PBS hinzu, um die Organoide zu spülen.
    3. Entfernen Sie PBS vorsichtig, um Organoide nicht zu aspirieren, und fügen Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) hinzu, um es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zu fixieren.
    4. 3x mit PBS waschen.
    5. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
  2. Organoid-Entnahme für die RT-qPCR (Tag 30)
    1. Organoide (Schritt 2.4.3) in Mikroröhrchen überführen. Mit PBS waschen, wie in Schritt 4.1.2 beschrieben.
    2. Lysepuffer zugeben und in flüssigem Stickstoff (LqN2) einfrieren. Bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.
  3. Zellfixierung für Immunfluoreszenz (Tag 60)
    1. Entfernen Sie das Kulturmedium und fügen Sie PBS zu den Waschzellen hinzu.
    2. Fixieren Sie 4% PFA für 15 min bei Raumtemperatur.
    3. Entfernen Sie PFA und fügen Sie PBS zu den Waschzellen hinzu. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
    4. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.

5. RT-qPCR

  1. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus Organoiden gemäß den Anweisungen des Kit-Herstellers.
  2. Synthetisieren Sie cDNA aus 1 μg Gesamt-RNA, die in Schritt 5.1 gemäß den Anweisungen des Kit-Herstellers in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl hergestellt wurde.
  3. Führen Sie eine quantitative PCR mit den folgenden Primern durch: FOXG1_forward: CGCCAGATTTCCATGTGTGC; FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA; ACTB_forward: TGAAGTGTGACGTGGACATC; ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTGAT. Stellen Sie die Endkonzentration für jede Reaktion wie folgt ein: 1x Fluoreszenz-Mastermix, 0,25 μM Forward-Primer, 0,25 μM Reverse-Primer. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 15 μl, einschließlich 0,2 μl cDNA aus Schritt 5.2. Unter folgenden PCR-Bedingungen sind folgende Bedingungen anzuwenden: Erstdenaturierung bei 95 °C für 1 min; 40 Zyklen von 95 °C für 15 s und 60 °C für 30 s.
  4. Normalisieren Sie die FOXG1-Expression auf ACTB als interne Steuerung.

6. Immunfluoreszenz-Färbung

  1. Organoide (Tag 30) in 10 % Saccharose für 1 h bei 4 °C inkubieren, dann 30 % Saccharose für ≥3 h bei 4 °C.
  2. Organoide in Einbettmedium einbinden und Kryosektion (10 μm) mit Kryostat vorbereiten. Lagern Sie die Sektionen bis zur Verwendung auf Objektträgergläsern bei -20 °C.
  3. Entfernen Sie das Einbettmedium durch PBS-Waschen (2 x 5 min).
  4. Permeabilisieren Sie in 0,3% PBST für 10 min. Mit PBS waschen.
  5. 1 h lang 10 % normales Ziegenserum in 0,1 % PBST einbinden. Über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern inkubieren: anti-FOXG1 (1:200), anti-TUBB3 (1:500-1:1.000). 3x mit PBS waschen.
  6. Inkubieren Sie mit Sekundärantikörper (1:500) + Hoechst 33258 (1:500) für 1 h. 3x mit PBS waschen.
  7. Montieren Sie es und beobachten Sie es unter einem konfokalen Mikroskop.

7. Heteroplasmie-Analyse

  1. Ernten Sie iPSCs mit Zellschabern und geben Sie sie in Mikroröhrchen. 0,5 mL PBS zugeben und 5 Minuten lang bei 100 × g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und fahren Sie mit Schritt 7.2 fort.
  2. Extrahieren Sie die Gesamt-DNA gemäß den Anweisungen des Kit-Herstellers.
  3. Stellen Sie die Endkonzentration für jede PCR-Reaktion ein: 1x Fluoreszenz-Mastermix, 0,25 μM Forward-Primer, 0,25 μM Reverse-Primer. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 15 μl, einschließlich 50 ng Gesamt-DNA aus Schritt 7.2. Unter folgenden PCR-Bedingungen sind folgende Bedingungen anzuwenden: Erstdenaturierung bei 95 °C für 1 min; 40 Zyklen von 95 °C für 15 s und 60 °C für 30 s. Die Primersequenzen sind wie folgt: MELASwt_foward: gtttgttaagatggcagagc; MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg; MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; FBXO15_ vorwärts: gccaggaggtcttcgctgta; FBXO15_ Rückseite: aatgcacggctagggtcaaa.
  4. Verwenden Sie Schwellenwerte für den Zyklus, um die Kopienzahl der mitochondrialen DNA zu berechnen (Mutante vs. Wildtyp).
  5. Normalisieren Sie sich auf die Kopienzahl des nukleären Gens FBXO15 .

8. Bewertung der Größe und Form von Organoiden

  1. Erfassen Sie Bilder von Organoiden mit einem Mikroskop im TIFF-Format.
  2. Messen Sie Größe und Zirkularität mit Open-Source-Bildanalysesoftware. Öffnen Sie die in Schritt 8.1 gespeicherten TIFF-Dateien, indem Sie auf Datei | Öffnen Sie die Datei und wählen Sie sie aus. Wählen Sie Freihandauswahl und verfolgen Sie das Organoid. Klicken Sie dann auf Analysieren | Messen. Die in den Ergebnissen enthaltenen Werte für Fläche und Zirkularität wurden für die Analyse in Schritt 8.3 verwendet.
  3. Analysieren Sie die Daten, indem Sie einen t-Test durchführen, um mit Hilfe statistischer Software zu bewerten, ob es signifikante Unterschiede zu den Kontrolllinien gibt.

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Ergebnisse

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Wir erzeugten Gehirnorganoide und führten 2D-Neurokulturen mit einem relativ einfachen Protokoll mit geringfügigen Modifikationen durch, das auf Nakamura et al.9 basierte9 (Abbildung 1). Im vorherigen Protokoll wurden V-förmige 96-Well-Platten verwendet, während wir in dieser Studie U-förmige 96-Well-Platten mit geringer Bindung verwendeten, damit sich die Zellen auf natürliche Weise in der Mitte jedes Wells aggregieren konnten. Unter...

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Diskussion

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Organoide, die aus humanen embryonalen Stammzellen (ESCs)/iPSCs induziert werden, stellen vielversprechende Krankheitsmodelle für seltene, hartnäckige Krankheiten dar, während die Erzeugung von Gehirnorganoiden in der Regel längere Kulturzeiträume von mehreren Monaten10 und den Einsatz teurer Geräte erfordert, wie z. B. eines speziell entwickelten Behälters, der das Kulturmedium kontinuierlich umrührt und stabile Bedingungen für eine langfristige 3D-Zellkultur auf...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Die 414C2 iPSCs wurden von RIKEN BRC bezogen. Die Finanzierung erfolgte durch JSPS KAKENHI (24H00648 bis M.F., 23K08971 bis C.S.) und das AMED Translational Research Network Program (25yf0126001j002 bis M.F.). Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Deutschen Akademischen Austauschdienstes (DAAD) an die F.B.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 cm ZellkulturschüsselCorning353003
6-Bohrloch-Platte mit ultraniedriger BefestigungsflächeCorning3471
70 & mu; M-Zell-SiebCorning352350
AccutaseNacalai-Tesque12679-54Enzyme, die zur Dissoziation von iPSCs verwendet werden
B27-ErgänzungsmittelThermofischer wissenschaftlich17504001
B27-Präparat ohne Vitamin AThermofischer wissenschaftlich12587010
β-Merccaptoethanol (2-ME)SigmaM3148Werfen Sie gemäß den Regeln der Institution ab.
Zellkultur-6-Brunnen-MultiplateCorning353046
ZellensicherungsspitzeBMBio ECOBMT-200WBreite Bohrrohr-Pipettspitze
ZellschaberSUMITOMO BAKELITECO., LTD.MS-93100
KonfokalmikroskopZeissLSM710
KryostatLeicaCM3050
Kultur von Maus-Laminin 1R& D3400-010-02zur Beschichtung von Platten für 2D-Kulturen dissoziierter Neuronen verwendet
DMEM/F12FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.042-30795
Fluoreszenz-MontagemediumDAKOS302380-2Montagemedium
FOXG1-Antikörperabcamab196868
GlutamaxThermofischer wissenschaftlich35050061
Ziegen-Maus-IgG (H+L) hoch kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor plus 488Thermofischer wissenschaftlichA32723
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) hoch kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor Plus 555Thermofischer wissenschaftlichA32732
Heparansulfat (HS)SigmaH7640
Hochkapazitäts-RNA-zu-cDNA-KitThermofischer wissenschaftlich4387406verwendet zur Synthese von cDNA aus RNA
Hoechst 33258Thermofischer wissenschaftlichH3569
ImageJVersion 1.52averwendet zur Messung von Größe und Zirkularität von Organoiden
iMatrix-511 SeideTakara Bio Inc.892021Beschichtung für Platten zur iPSC-Kultur
InsulinFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.  090-06481
IWP2Tocris Bioscience3533
Keyence BZ-X810SchlüsselBZ-X810zur Aufnahme von Bildern für Abbildung 3A verwendet
LSM710Carl Zeiss AGKonfokalmikroskop
LSM980Carl Zeiss AGKonfokalmikroskop
LUNA Universal qPCR Master MixNew England BiolabsM3003
MatrigelCorning354277
N2-ErgänzungThermofischer wissenschaftlich17502001
Neurobasales MediumThermofischer wissenschaftlich21103049
Neuron-Dissoziationslösung FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.291-78001
nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)Nacalai-Tesque06344-56
Normales ZiegenserumJackson ImmunoResearch Inc. 005000121
Nunclon Sphera 96-Well, mit Nunclon Sphera behandelte, U-förmige Mikroplatte am BodenThermofischer wissenschaftlich174929
Paraformaldehyd (PFA)Nacalai-Tesque09154-85Werfen Sie gemäß den Regeln der Institution ab.
PBSNacalai-Tesque14249-24
PBSNacalai-Tesque27575-31
Penicillin/Streptomycin (PS)Nacalai-Tesque26253-84
Poly-L-Ornithin (PO)SigmaP3655
Polyoxyethylen(10) Octylphenyläther (Triton)FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.168-11805
PRISM GraphPadVersion 9.5.0
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN51304verwendet zur Extraktion der Gesamt-DNA
RNeasy Mini KitQIAGEN74104zur Extraktion der Gesamt-RNA verwendet
SB-431542Cayman Chemical13031
RutschgläserMATSUNAMICRE-05
StemFit AK02NTakara Bio Inc.AK02NMedium verwendet für die Kultur undifferentiierter iPSCs und von der Differenzierung Tag 0 bis Tag 6
SucroseFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.196-00015
Tissue-Tek O.C.T.-CompoundSakura Finetek Japan Co., Ltd.4583Kryokonservierungsmedium
TUBB3-AntikörperPromegaG712A
Y27632FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.030-24021ROCK-Inhibitor
ZENCarl Zeiss AG2.3SP1 (schwarze Ausgabe)Software zur Analyse der aufgenommenen Bilder  mit konfokalem Mikroskop (LSM710)
ZENCarl Zeiss AG2.6 (blaue Ausgabe)Software zur Analyse der aufgenommenen Bilder  mit konfokalem Mikroskop (LSM980)

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sproule, D. M., Kaufmann, P. Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: basic concepts, clinical phenotype, and therapeutic management of MELAS syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1142, 133-158 (2008).
  2. Kirino, Y., Suzuki, T. Human mitochondrial diseases associated with tRNA wobble modification deficiency. RNA Biol. 2 (2), 41-44 (2005).
  3. Shaffer, S. W., et al. Role of taurine in the pathologies of MELAS and MERRF. Amino Acids. 46, 47-56 (2014).
  4. Shaffer, S. W., Kim, H. W. Effects and mechanisms of taurine as a therapeutic agent. Biomol Ther. 26, 225-241 (2018).
  5. Rikimaru, M., et al. Taurine ameliorates impaired mitochondrial function and prevents stroke-like episodes in patients with MELAS. Intern Med. 51 (24), 3351-3357 (2012).
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MELAS Syndrominduzierte pluripotente StammzellenOrganoid GenerierungBildung neuronaler NetzwerkeHeteroplasmiegradeHochdurchsatz ScreeningImmunfluoreszenzf rbungRT qPCR Analyse

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