Methodenartikel

Ein Tiermodell der Pulpitis basierend auf einem ausgezüchteten Mäusestamm und seiner histologischen Analyse

DOI:

10.3791/69786

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27. Februar 2026

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1Department of Operative Dentistry, Dow Dental College, Dow University of Health Sciences, 2Dow Institute of Advanced Biological and Animal Research, Dow University of Health Sciences, 3Department of Pathology, Dow International Medical College, Dow University of Health Sciences, 4Department of Oral Pathology, Dow Dental College, Dow University of Health Sciences, 5Qatar University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erstellung eines Pulpitis-Modells bei NMRI-Mäusen (Naval Medical Research Institute) vor. Zusätzlich werden Schritte beschrieben, um einen Kieferrückziehclip herzustellen und Dias für die Histologie aus dem Tierkiefer vorzubereiten. Durch die Einhaltung eines Standardprotokolls können Unterschiede in Methodik und Ergebnissen vermieden werden.

Zusammenfassung

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Die Mäuse des Naval Medical Research Institute (NMRI) wurden bisher nicht für die Entwicklung eines Zahnpulpa-Entzündungsmodells gemeldet. In diesem Protokoll präsentieren wir ein Tiermodell mit NMRI-Mäusen und stellen detaillierte histologische Verfahren für das Pulpitis-Modell bereit, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Wir schlossen 70 NMRI-Mäuse ein, die zufällig zwei Gruppen zugeteilt wurden: Gruppe A (n=35), bei der Pulpitis allein durch die Pulpa-Exposition induziert wurde, und Gruppe B (n=35), die eine Pulpa-Exposition und anschließend eine Zymosan-Anwendung erhielt. Nach der Pulpenfreilegung des rechten Kiefermolar wurden die Tiere in festgelegten Zeitintervallen (0, 6, 9, 12, 24, 48 und 72 Stunden) geopfert. Der Kieferkiefer wurde für die Histologie und quantitative histomorphologische Analyse entnommen. Ein zeitabhängiger, allmählicher Anstieg der Entzündung wurde in der histologischen Analyse für beide Gruppen beobachtet. Beide Tiermodelle ermöglichten die Untersuchung von Entzündungen bis zu 72 Stunden. Die in diesem Artikel vorgestellte Technik ist reproduzierbar und wird helfen, die histologische Untersuchung der Pulpitis zu standardisieren.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschiedene Tiermodelle wurden verwendet, um Pulpitis 1,2,3,4 zu untersuchen. Unter diesen werden Mäusemodelle, die auf C57BL/6 und BALB/c basieren, ausschließlich in der Pulpitis-Forschung 5,6,7,8 berichtet. Beide sind inzucht und haben strenge Zuchtanforderungen 7,9. Die im aktuellen Protokoll verwendeten NMRI-Mäuse sind ein ausgezüchteter Stamm und bieten mehrere Vorteile gegenüber den inzuchtartigen Stämmen. Die Einrichtungs- und Wartungskosten sind gering. Hohe Fortpflanzung, bessere Immunität und niedrige Sterblichkeit führen zu einem früheren und größeren Wechsel der Kolonien10. Daher ist es logistisch und finanziell machbarer11. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass das Krankheitsprofil der in diesem Modell erzeugten Pulpaentzündung ähnlich ist wie die zuvor berichteten Modelle bei Inzuchtmäusen 5,6,8. Darüber hinaus können NMRI-Mäuse bis zu 72 Stunden eine Exposition von Zymosan aushalten, wodurch ein beobachtbares Krankheitsprofil entsteht. Dies ist eine brauchbare Alternative zu anderen Inzuchtlinien zur Untersuchung von Pulpitis12.

Zymosan ist ein Extrakt aus der Zellwand von Saccharomyces cerevisiae und besteht hauptsächlich aus Chitin, Mannans, Mannoproteinen und ß-Glucanen13. Zymosan und Candida albicans teilen eine ähnliche Zellwandstruktur und werden von der angeborenen Immunität des Wirts über einen C-Typ-Lektin, den Pathogen-Erkennungsrezeptor, Dectin-114, nachgewiesen. Dectin-1 wird hauptsächlich von dendritischen Zellen und Makrophagen exprimiert. Es detektiert ß-Glukane in Pilzpathogenen und nutzt den Syk/CARD9-Weg zur Bildung von entzündlichen Mediatoren15. Daher ist Zymosan eine praktikable Alternative zur Untersuchung der Wirkung der Exposition durch C. albicans auf die Pulpa-Krankheit anstelle des Organismus16. Dies wird durch unsere zuvor veröffentlichten Ergebnisse gestützt, die einen frühen Nachweis von Dectin-1-Transkripten in zymosan-exponierten Pulpa zeigen. Ebenso wurden Dectin-1 mit CD68+ve Makrophagen sowie12 beobachtet.

Histologische Techniken, die in früheren Veröffentlichungen beschrieben wurden, reichen oft nicht aus, damit Anfänger sie mit Sicherheit reproduzieren können. Folglich kommt es zu umfangreichem Versuch und Irrtum, was zu unnötigem Tierverlust bei der Optimierung histologischer Verfahren führt. Das vorliegende Protokoll standardisiert die Vorbereitungstechnik der Objektträger und wurde erfolgreich auch bei Rattenangewandt 17. Hier werden alle wesentlichen Schritte des Pulpitis-Modells ausführlich beschrieben, einschließlich einer reproduzierbaren Methode zur Kieferrückziehung, der Induktion der Pulpitis durch Pulpenexposition, der Induktion der Pulpaentzündung mit Zymosan und der anschließenden histologischen Analyse.

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Protokoll

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Die aktuelle Tierstudie wurde gemäß den ARRIVE-Richtlinien entwickelt. Das Institutional Review Board for Animal Research and Ethics der Dow University of Health Sciences genehmigte diese Tierstudie (Brief Nr. AR. IRB-06/DUHS/Genehmigung/2016/05). Das Protokoll umfasste insgesamt 70 NMRI-Mäuse. Die Tiere stammten aus der 'Central Animal House Facility' des Dow Institute for Advanced Biological and Animal Research. Die Stichprobengröße dieses Protokolls basiert auf einer früheren Studie8.

1. Tiere

HINWEIS: Die für die Studie ausgewählten Tiere wogen 26–30 g und wurden unter folgenden Bedingungen in Standardboxen gehalten: einer Temperatur von ±21 °C, relativer Luftfeuchtigkeit von ±55 % und einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Verhältnis mit frei verfügbarem gefiltertem Wasser und Standardfutter (normale Futterdiät). Es wurde regelmäßig auf Anzeichen von Aggression, Unbehagen oder Reizung überwacht. Diclofenac-Natrium (200 μL subkutan, 25 mg/mL) wurde bei Schmerzen oder Unwohlsein verwendet. Sie durften sich zwei Wochen vor jeglichen Experimenten akklimatisieren. Zehn Tiere wurden jeweils in entsprechend beschrifteten Käfigen gehalten. Zur Tierbestimmung wurde ein Marker an seinem Schwanz angebracht.

  1. Teilen Sie die Tiere (n=70) zufällig in zwei Gruppen auf: Gruppe A (n=35), Gruppe B (n=35).
  2. In Gruppe A wird die Pulpitis nur durch die Exposition der Pulpa induziert (siehe Schritt 4.1.1 bis Schritt 4.1.9).
  3. Für Tiere der Gruppe B wird Zymosan-Lösung über freiliegendem Pulpa aufgetragen (siehe Schritt 4.2.1 bis Schritt 4.2.3).

2. Zymosan-Lösung

  1. Folgen Sie einer zuvor veröffentlichten Methode zur Herstellung der Zymosan-Lösung, wie unten18 beschrieben.
  2. Verwenden Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), um eine Lösung von 1 mg/mL aus 1 mL Zymosan herzustellen.
  3. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C für 15 Minuten.
  4. Lass die Lösung 1 Stunde auf Raumtemperatur abkühlen.
  5. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 4 °C und 300 x g für 10 Minuten.
  6. Entsorgen Sie das Überdachungsmittel und waschen Sie das Pellet dreimal durch Wiederzentrifugation mit eiskaltem, sterilem PBS.
  7. Lagern Sie die Lösung bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
    HINWEIS: Die Lösung muss innerhalb von 30 Tagen verwendet werden, danach kann sie verworfen werden.

3. Kiefer-Rückzugsclip

  1. Verwenden Sie 0,7 mm Edelstahl-Kieferdraht, um einen Kieferrückziehclip herzustellen.
  2. Nimm einen Draht von 100 mm Länge und mache in seiner Mitte eine Schlaufe mit 5 mm Durchmesser.
  3. Drehen Sie beide Teile des Drahtes 5 mm von der Schlaufe und insgesamt 15 mm rechtwinklig, ohne scharfe Biegungen.
  4. In einem Abstand von 25 mm von der Kurve machen Sie eine Kerbe und drehen Sie das verbleibende Ende nach außen. Verwenden Sie Abbildung 1A als Orientierung.

4. Tiermodell

  1. Gruppe A (n = 35)
    1. Betäuben Sie Tiere durch eine intraperitoneale Injektion von 0,1 ml/20 g Ketamin-Xylazin-Cocktail (87,5 mg/kg Ketamin + 12,5 mg/kg Xylazin).
    2. Verwenden Sie für alle Eingriffe ein 10-fach geneigtes Langarm-Stereomikroskop (Abbildung 1B). Stellen Sie den geneigten Arm so ein, dass man die zurückgezogenen Oberkieferzähne des Tieres direkt sehen kann. (Abbildung 1C)
    3. Drücken Sie die Klemme zusammen und setzen Sie den eingekerbten Teil zwischen den Kiefer- und Unterkieferschneidezähnen auf beiden Seiten der Klammer.
    4. Nach dem Lösen des Clips sichern Sie die Enden mit Hilfe von Klebeband (Abbildung 1C).
    5. Verwenden Sie eine Zahnpinzette, um die Wangen des Tieres mit Ihrer nicht arbeitenden Hand zu erweitern. (Abbildung 1D,E).
      HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßigen Druck. Die Verletzung durch eine Pinzette kann tödliche Blutungen und den Tod des Tieres verursachen.
    6. Verwenden Sie einen #1/4-runden Hartmetallbohrer mit einem E-Typ-Handstück mit langsamer Geschwindigkeit in einem Elektromikromotor mit 10-facher Vergrößerung bis zur Hälfte seiner Tiefe in der Mitte des rechten ersten Backenzahnen, um eine Klasse-1-Höhle zu erzeugen. Der Schatten der Pulpe könnte in diesem Moment sichtbar sein (Abbildung 1D, E).
    7. Führe den Bohrer vorsichtig mit langsamer Geschwindigkeit in einer schwungvollen Bewegung durch. Verwenden Sie einen Elektromotor, um die Drehzahl zu steuern.
    8. Verwenden Sie eine K-Typ Nummer 15 endodontische Datei, um die Pulpa freizulegen (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Die Verwendung eines #15 endodontischen Handinstruments muss äußerst vorsichtig sein, sonst kommt es zu einer Furkationsperforation, die erst sichtbar wird, wenn histologische Objektträger vorbereitet sind. Der Durchmesser des #1/4 runden Hartmetallbohrers beträgt 0,25 mm, und eine #15K-Feile ist 0,15 mm breit. Daher ist 0,15 mm die Belichtungsgröße in den Pulp (Abbildung 2C).
    9. Lassen Sie die freiliegende Pulpa offen, um die Pulpitis einzuleiten
  2. Gruppe B (n = 35)
    1. Wiederhole alle in Schritt 4.1 angegebenen Schritte mit der Hinzufügung von Folgendem.
    2. Verwenden Sie eine Mikropipette (0,2–2 μL), um 0,2 μL zuvor vorbereitete Zymosan-Lösung über die freiliegende Pulpa zu legen.
      HINWEIS: Bei der Abgabe der Zymosan-Lösung ist Vorsicht geboten. Ein unbeabsichtigtes Verlaufen der Lösung in die Mundhöhle kann zum Tod des Tieres führen. Daher wird Gaze verwendet, um den Zahn abzudecken, sodass überschüssige Zymosan-Lösung vom Gaze aufgenommen wird (Abbildung 2D).
    3. Lassen Sie die behandelte Pulpa offen für die Induktion der Pulpitis mit Zymosan-Lösung.

5. Probenvorbereitung

  1. Opfere fünf Tiere aus jeder Gruppe bei 0, 6, 9, 12, 24, 48 und 72 Stunden durch Kohlendioxidinhalation19.
  2. Verwenden Sie eine 7,25-Liter-Euthanasiekammer.
  3. Laden Sie die Kammer nicht mitCO2 vor.
  4. Platziere die Tiere direkt in die Kammer.
  5. Fügen Sie 100 %CO2 mit einer Füllrate zwischen 30 und 70 % des Kammervolumens pro Minute hinzu.
  6. Halte die CO2-Durchflussrate bei 5 L/min.
  7. Erhitze dasCO2 und lasse es mit der Luft im Kammer vermischen.
  8. Beobachten Sie die Tiere innerhalb von 23 Minuten auf Anzeichen von Bewusstlosigkeit.
  9. Überwachen Sie die Tiere, ob die Atmung aufhört und die Augen grau werden.
  10. Halten Sie denCO2-Fluss mindestens eine Minute nach dem Ende der Atmung aufrecht.
  11. Bestätigen Sie den Tod der Tiere, bevor Sie sie aus der Kammer entfernen. Achten Sie darauf, dass keine Atmung vorhanden ist und die Augen blass erscheinen.
  12. Trennen Sie die Köpfe der Tiere unmittelbar nach der Euthanasie.
  13. Verwenden Sie den unbehandelten ersten Kiefermolar der linken Seite des Tieres, das bei 0 Stunden geopfert wurde, als Kontrollmechanismus.
  14. Verwenden Sie 10 % gepuffertes Formalin in entsprechend beschrifteten 15-ml-konischen Röhren, um die Kieferkiefer für 2 Tage zu lagern.

6. Histologie

  1. Entkalken Sie die fixierten Kiefer für 3 Tage mit 10 % Ameisensäure.
    HINWEIS: Nach dem dritten Tag prüfen Sie, ob eine chirurgische Klinge den Kiefer durchschneiden kann. Wenn es immer noch nicht weich genug ist, tauchen Sie es erneut in 10% Ameisensäure ein und prüfen Sie täglich, bis es mit einer chirurgischen Klinge geschnitten werden kann.
  2. Schneide den Kiefer mit einer Klinge Nr. 22 durch. Machen Sie den Schnitt parallel zur okklusalen Ebene entlang der sagittalen Ebene, wobei die Klinge unmittelbar auf der Gaumenseite der Gaumenspitzen der Maxillarmolaren bleibt (Abbildung 3A).
  3. Markiere die okklusale Oberfläche aller Zähne mit India Ink.
    HINWEIS: Diese Markierung hilft, die okklusale Oberfläche während des Schnitts zu erkennen (Abbildung 3B).
  4. Stecken Sie den durchschnittenen Kiefer in Paraffinwachs in ein Edelstahlgehäuse, indem Sie ihn flach an die Basis der Form legen, wobei die Schnittfläche zur Basis zeigt.
    HINWEIS: Die Einbettung auf diese Weise stellt sicher, dass die Schnittfläche zuerst in das Mikrotom eintritt, die Probeausrichtung korrekt ist und die sagittalen Schnitte wie in Abbildung 3E dargestellt werden.
  5. Entferne die Einbettkassette mit dem eingebetteten Kiefer aus der Grundform und lege sie in ein Mikrotom.
  6. Mach 3 μm dicke sagittale Schnitte und lege sie auf einen sauberen, geladenen Objektträger (Abbildung 3C).
  7. Beobachten Sie unverfärbte Objektträger unter einem Compoundmikroskop.
    HINWEIS: Beobachten Sie die Schnittabschnitte weiterhin, bis die Höhlung auf der Okklusionsfläche sichtbar ist. Wenn die Schnitte korrekt entlang der sagittalen Ebene entlang der Längsachse des ersten Kiefermolars angeordnet sind, sieht man den gesamten Pulparaum mit entweder einer oder zwei Wurzeln und einer Pulpakammer (Abbildung 3E). Ab diesem Punkt kann theoretisch 50 Objektträger aus einem Abschnitt hergestellt werden, da die Belichtungsgröße 0,15 mm beträgt (3 μm = 0,003 mm, 0,003 x 50 = 0,15)
  8. Führen Sie Standardschritte der Hämatoxylin- und Eosin-Färbungsverfahren für die ausgewählten Objektträger durch, wobei entweder eine oder zwei Wurzeln sowie die gesamte Pulpakammer zu sehen sind.
  9. Beobachten Sie die gefärbten Objektträger unter einem Compoundmikroskop.
  10. Wählen Sie pro Zeitintervall fünf beste Dias aus, die die Beobachtung des maximalen Pulparaums ermöglichen.

7. Statistische Analyse

  1. Führen Sie statistische Analysen mit Standard-Statistiksoftware durch.
    HINWEIS: Für die quantitative histomorphologische Analyse wurden die beobachteten Dias aus jedem Zeitintervall nach einem zuvor veröffentlichten Kriterium bewertet (Tabelle 1)8. Der Kruskal-Wallis-H-Test mit Bonferroni-Korrektur bei p=0,0018 wurde verwendet, um Werte verschiedener Zeitintervalle zu vergleichen. Der Mann-Whitney-U-Test wurde bei p ≤ 0,05 verwendet, um die Gruppen A und B zu vergleichen. Alle Vergleiche wurden mit standardisierter statistischer Software durchgeführt.

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Ergebnisse

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In diesem Protokoll präsentieren wir ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren für zwei Tiermodelle der Zahnpulpaentzündung bei NMRI-Mäusen sowie die entsprechenden histologischen Methoden. Der Einsatz geeigneter Ausrüstung ist für den Erfolg des Protokolls unerlässlich. In dieser Hinsicht ist das 10-fach geneigte Langarm-Stereomikroskop das wichtigste Gerät. Die Klasse-1-Hohlraumvorbereitung wurde mit einem Elektromikromotor bei etwa einem Drittel seiner Höchstgeschwindigkeit (35....

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Diskussion

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Das aktuelle Protokoll stellt erstmals in der veröffentlichten Literatur die Entwicklung eines Typ-3-Zahnverletzungsmodells (irreversible Pulpitis) bei NMRI-Mäusen vor. Es beschreibt außerdem die histologische Analyse der durch Zymosan induzierten Pulpaentzündung und bietet eine reproduzierbare Methode zur Herstellung histologischer Objektträger aus Tierkiefern.

Nach diesem Protokoll wurde bei NMRI-Mäusen ein Typ-3-Zahnverletzungsmodell erstellt. Frühere Forsc...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

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Die Studie war selbstfinanziert. Die Autoren würdigen die Unterstützung von Herrn Muhammad Adeel vom Department of Histology der Dow University of Health Sciences für Histologie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BasisformHistolinienlabore, ItalienR4166C2:D23Für das Einbetten der Probe in Paraffin
Karbidbohrer #1/4 RundeMittlerer Westen, Wichita Falls, Texas389101
Komplexmikroskop Motic BA310Motic Inc. Co. Ltd, Hongkonghttps://moticmicroscopes.com/products/ba310e
Diclofenac-Natrium 25 mg/mLIndus Pharma (DYCLO)https://sahar.ph/product/dyclo-diclofenac-sodium-25-mg-ml-im-iv/200µ L subkutan
E-Typ langsames Handstück Rose201-M4Being Foshan, Chinahttps://www.beingfoshan.com/en/h-pd-353.html
Einbettung von Kassetten Histolinienlabore, ItalienR4004
EuthanasiekammerConductScience, Illinois, USACS-EUTH2A7,25 Liter Kapazität, für Mäuse und Ratten [bis zu 500g]
Falkenröhren 15 mlNist188271
Formalin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte Staaten158127buffered 
Ameisensäure  BDH Laborzubehör Poole, England  2842810%
Homogenisierer Omni Mixer Homogenizer, Omni International, Georgia, USAhttps://omni-inc.com/high-shear-lab-homogenizers/omni-th-0-2ml-100ml/omni-tissue-homogenizer-th
India InkSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte Staaten198285
K Typ Nummer 15 endodontische AkteMani, Japanhttps://www.mani.co.jp/en/product/dental_01.html
Ketamin-Xylazin-CocktailBrookes Pharma Pvt Ltd / Mylab (Pvt.) Ltd.87,5 mg/kg Ketamin + 12,5 mg/kg Xylazin
Microtome HM 315 RMicrom, Deutschland901100
Mikromotor-Marathon-IIIBT-Marathon, Saeyang Microtech Co., Ltd. Koreahttps://www.saeyang.com/theme/basic/sub/product/view.php?it_id=1752202111Einsatz mit einem Drittel der Höchstgeschwindigkeit
Mikropipette 0,2-2 & Mikro; L Gilson, Frankreichhttps://www.gilson.com/default/
pipetman-p2-0-2-2-micro-l-metal
-ejector.html?srsltid=AfmBOoobE
0iSWY_902ZHGZ7AoJ6wzN5PI
0H4V4vkxHQgK1mq7Wg2kkbS		0.2-2 & Mikro; L 
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte StaatenP4417
Statistisches Paket für die SozialwissenschaftenIBM, Armonk, New YorkSPSS für Mac Version 23.0   
Stereomikroskop BMK-3 LEDMeiji techno, Japanhttps://meijitechno.com/product/bmk-3-led-stereo-microscope/
Chirurgische Klinge Nr. 22Feder-Chirurgieklinge, Feather Safety Razor Co Ltd., Osaka, JapanFB. 12
Zymosan ASigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte StaatenKat Nr. Z42501 mg/mL von 1 mL Zymosan

Referenzen

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