Method Article

Ein mehrschichtiges Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopieprotokoll zur Untersuchung von Chromatin in der dichten Kernumgebung

DOI:

10.3791/69868

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June 5th, 2026

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1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir präsentieren ein dreifarbiges Chromatin-Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie-(SMLM)-Färbungs- und Analyseverfahren, das eine reproduzierbare Abbildung von Euchromatin, Heterochromatin und RNAP II für die räumliche Analyse ermöglicht. Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente mehrfarbige Markierung in dichten nuklearen Umgebungen, einschließlich chromatinassoziierter Ziele, und ermöglicht eine zuverlässige gleichzeitige Erkennung.

Abstract

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Die Superauflösungsmikroskopie hat unsere Fähigkeit, biologische Strukturen über die Beugungsgrenze hinaus zu untersuchen, dramatisch verbessert und ist daher unverzichtbar für die Untersuchung dicht gepackter Kernstrukturen wie Chromatin, Kernlamina und Kernkörper wie Nukleoli. Chromatin zeigt eine multiskalige Organisation – von nanometergroßen Nukleosomen bis zu mikrometergroßen Domänen – was Bildgebungsansätze mit hoher Auflösung und molekularer Spezifität erfordert. Die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM), insbesondere die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM), ermöglicht eine präzise Kartierung epigenetischer Markierungen und bietet so wichtige Einblicke in die Chromatinstruktur und -funktion. Die Multi-Label-Bildgebung im Kernmilieu stellt jedoch besondere Herausforderungen dar, darunter eine verminderte Antikörperzugänglichkeit, eine erhöhte unspezifische Bindung und Fluorophorinstabilität. Um diese Probleme zu lösen, stellen wir ein sequentielles Immunlabeling-Protokoll vor, das für hochdichte nukleare Umgebungen optimiert ist und robuste dreifarbige SMLM mit minimalem Übersprechen und weniger Signalverschlechterung ermöglicht. Diese Methode umfasst optimierte Pufferformulierungen, Fluorophor-Auswahl und Antikörpervalidierungsstrategien, um reproduzierbare, hochpräzise Markierung über mehrere Ziele hinweg sicherzustellen. Wichtig ist, dass wir dieses Protokoll in eine computergestützte Analysepipeline integrieren, die Lokalisierungen von einem molekularen Ziel als räumliche Anker (Seed-Punkte) nutzt, um Entfernungen zwischen Zielen, lokale Dichten und Multi-Label-Koaffinität zu quantifizieren. Dies ermöglicht eine detaillierte räumliche Analyse der Chromatinkomponenten im Nanobereich. Dieses Protokoll dient als reproduzierbares Rahmenwerk für mehrkomponentenbasierte Bildgebung und quantitative Analyse in dichten subzellulären Umgebungen und bietet Forschern, die komplexe nukleare Architekturen wie Chromatin untersuchen, ein leistungsstarkes Werkzeug.

Introduction

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Das Aufkommen der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) hat eine beispiellose Erforschung biologischer Strukturen im Nanometermaßstab 1,2,3,4,5 ermöglicht. Über die Einzelzielbildgebung hinaus hat die Erweiterung auf mehrfarbige SMLM das Fachgebiet weiter vorangebracht, indem sie die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Molekularspezies sowie der räumlichen und zeitlichen Beziehungen zwischen Subbeugungsstrukturenermöglichte 6,7,8,9,10,11 . Die Anwendung multiplexierter SMLM auf reichlich verteilte Histonmodifikationen bleibt jedoch aufgrund der dichten, polymeren Natur der Kern-DNA und der begrenzten Zugänglichkeit von Antikörpern in diesem Umfeldschwierig.

Chromatin zeigt eine hierarchische, multiskalige Organisation, die sich über mehrere Größenordnungen erstreckt, von nanometergroßen Nukleosomen-Assemblies bis zu mikrometergroßen Kernarchitekturen. Auf den größten Skalen besetzen Chromosomen unterschiedliche Chromosomenterritorien, innerhalb derer das Genom weiter in A/B-Kompartimente und topologisch assoziierte Domänen (TADs) unterteilt wird, die langfristige regulatorische Interaktionen durch Mechanismen wie Schleifenextrusie 19,20,21,22 einschränken . Auf Skalen unter 200 nm ist Chromatin als ungeordnetes Polymer organisiert, das aus heterogenen Packungsdomänen (PDs) statt diskreten Euchromatin- und Heterochromatinblöcken besteht, wobei transkriptionell aktive Regionen bevorzugt auf PD-Grenzen 23,24,25,26,27,28,29 lokalisieren. Auf den kleinsten Skalen (5–20 nm) besteht Chromatin aus unregelmäßigen Nukleosomenassemblierungen und Nukleosomenkupplungen, was das Fehlen eines einheitlichen höherordnungigen Faltungsmotivs unterstreicht und die emergente, skalenabhängige Natur der Genomorganisation 24,26,30 betont. Mit dem raschen Fortschritt sequenzierungsbasierter Ansätze wie der Chromatin-Immunausfällungssequenzierung und Hochdurchsatz-Chromatin-Konformationserfassung 19,30,31,32,33 wurden verschiedene Merkmale der mesoskaligen Chromatin-Organisationsstrukturen identifiziert 31,32. Diese Techniken gelingt es jedoch im Gegensatz zur Bildbildung nicht, die räumliche Geometrie zu erfassen, die erst nach der Auflösung dieser Strukturen beobachtet wird. Elektronenmikroskopiemethoden wie die Chromatin-Elektronenmikroskopie (ChromEM24) und die Chromatin-Scanning-Transmissionselektronenmikroskopie (ChromSTEM25) haben gezeigt, dass Chromatin heterogen ist und in Packungsdomänen auf Längenskalen von 50–200 nm 25,28,29 organisiert ist. Obwohl diese Techniken eine beeindruckende Auflösung zur Identifizierung von Chromatinpackungsdomänen ermöglichen, können sie keine molekularspezifische Abbildung liefern, die SMLM bietet. Die Akkumulation von DNA-Punkten für Bildgebung in der nanoskaligen Topographie (DNA-PAINT22) und multiplexierte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)19ermöglichen ein hohes Multiplexing; jedoch wird DNA-PAINT stark von erhöhtem Hintergrundrauschen beeinflusst, das durch zufällige Bindungsereignisse in der oligonukleotidreichen Kernumgebung12,34 entsteht, während traditionelle hitzedenaturierende FISH-Methoden eine gestörte native Chromatinfaltung erfordern. Frühere Studien haben Superauflösungs-Bildgebungstechniken angewendet, um Chromatin auf dieser Längenskala zu untersuchen, und eine hybride Zusammensetzung von Packungsdomänen identifiziert, die den früheren Phasentrennmodellen 12,23,34,35 entgegensteht. Dieses Protokoll basiert auf einer zuvor veröffentlichten Arbeit, die die biologische Bedeutung dieser Erkenntnisse diskutiert34. Daher bleibt das immunfärbende dSTORM aufgrund seiner hohen Auflösung und Multiplexing-Fähigkeiten die praktikabelste Strategie für die mehrfarbige Chromatinbildgebung unter nahezu natürlichen Bedingungen.

Dieses Protokoll ist nicht das erste, das die Markierung von mehr als zwei Kernzielen demonstriert, da frühere Studien einzelne Proteinkomplexe oder -gene12,36 markierten. Trotz erfolgreicher Markierung posttranslationaler Histonmodifikationen stellen Multicolor-Chromatin-SMLM-Markierung, Bildgebung und -Analyse erhebliche Herausforderungen dar. Erstens erfordert die Immunfärbung in der dichten Chromatinumgebung eine Optimierung der Antikörperkonzentration, der Inkubationssequenz und der Pufferzusammensetzung, um eine ausreichende Penetration und Bindung ohne übermäßigen Hintergrund sicherzustellen. Zweitens ist eine umfassende Analyse mehrerer Labels notwendig, da die Wechselwirkungen zwischen Euchromatin, Heterochromatin und Enzymen wie RNA-Polymerase wahrscheinlich über einfache binäre Ausschlüsse hinausgehen werden. Bisher bleibt die maximale Anzahl der in der Chromatin-dSTORM-Bildgebung gezeigten Farben bei zwei18, 37, 38, 39.

Hier präsentieren wir ein robustes Protokoll für die Bildgebung und Analyse von Dreifarbenchromatin-SMLM. Unser Färbe-Workflow optimiert die Inkubationszeit von Antikörpern und verwendet verbesserte Bildpuffer40für eine längere Bildgebungssitzung für mehrere Labels. Darüber hinaus beschreiben wir rechnerische Pipelines für die Analyse von Zwei-Farben-Distanzen und die Analyse der Drei-Farb-Joint-Dichte, die eine quantitative Charakterisierung der Beziehungen zwischen Heterochromatin, Euchromatin und Transkriptionsmaschinen ermöglichen. Im Gegensatz zu früheren Zweifarb-Chromatin-SMLM-Studien, die eine Trennung von Heterochromatin und Euchromatin nahelegten, zeigt die Drei-Farbchromatin-Bildgebung, dass das Genom in Packungsdomänen organisiert ist, wobei Euchromatin und aktive Transkription am Rand der konstitutiven Heterochromatinkerne34 lokalisiert sind.

Dieses Protokoll bietet der Gemeinschaft einen reproduzierbaren Rahmen für die Durchführung von Mehrfarbchromatin-SMLM und etabliert Analysestrategien, die für mehrere funktional konjugierte Kernziele geeignet sind. Durch das Überbrücken methodischer Lücken ermöglicht es eine systematische Erforschung der Organisation der Chromatindomäne auf supra-nukleosomaler Ebene und ergänzt Sequenzierungs- und Elektronenmikroskopie-Ansätze bei gleichzeitiger Erhaltung der nativen Kernarchitektur. Dieser Artikel ist ein erweitertes Protokoll eines veröffentlichten Papers34.

Protocol

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HINWEIS: Der anschließende Protokollabschnitt wird in den unten beschriebenen Färbungsprozess und den Erwerbungsprozess unterteilt. Für Datenanalyse-Tutorials siehe bitte die zugehörige Publikation34, die die Analyse von Multi-Label für markierte Histonmodifikationen beschreibt.

1. Färbeprozess:

HINWEIS: Im gesamten Protokoll wird von 35-mm-Schüsseln oder 8 gut gekammerten Platten gesprochen. Dies sind die Gefäße, die unsere Gruppe für die Zellkultur verwendet, jedoch sind kleinere und effizientere Methoden möglich. Stellen Sie sicher, dass bei Verwendung alternativer Materialien die empfohlenen Konzentrationen für Pufferantikörper eingehalten werden. Aufgrund der sequentiellen Natur dieses Protokolls ist die Antikörperauswahl für eine erfolgreiche Markierung wichtig. Wir verwenden Standardargumente, um sicherzustellen, dass unsere Wirt-Antikörper für unsere Ziele unterschiedlich sind, sodass unsere sekundären Antikörper unterschiedliche Wirtsarten gezielt angreifen und so Off-Target-Effekte minimieren können. Die Markierungsreihenfolge wird basierend auf der Zielposition im Kern bestimmt. Da wir die Chromatinpackungsdomänen25, 28, 34, 35 anvisieren und verstehen, dass dies ein diffusionsgetriebener Prozess ist, markieren wir immer zuerst heterochromatische Ziele, gefolgt von Euchromatin und schließlich RNAPII, um sterische Ausschluss in dichten heterochromatischen Regionen zu minimieren. Die Optimierung der Puffer erfolgte empirisch während der Entwicklung des Protokolls. Wir fanden heraus, dass die Einbeziehung von Ziegenserum nach dem ersten Ziel hilfreich war, um die Off-Target-Effekte in den folgenden Schritten zu reduzieren.

  1. Puffervorbereitung
    1. Pufferkomponenten:
      HINWEIS: Weitere Informationen zu den Komponenten, einschließlich Lager- und Vorbereitungszeiten, finden Sie in der Materialtabelle. Wir empfehlen, dass der Nutzer alle Lösungen vor Beginn des Protokolls bereit hat, um experimentelle Fehler zu vermeiden. Die Abschrecklösung sollte zuletzt hergestellt werden.
    2. Erstellen Sie einen Blockpuffer
    3. Wägen Sie das Rinderserumalbumin (BSA) so ab, dass die Endkonzentration im für das Experiment benötigten Puffervolumen 3 % beträgt, und geben Sie sie in ein Zentrifugenrohr ein. Kippe das Rohr in einen Winkel von 45°, sodass die BSA-Kristalle im Rohr verteilt sind, und füge dann phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu. Dies geschieht, um die Bildung von Kristallklumpen zu verhindern, die sich nicht auflösen.
    4. Lass das Rohr bei Raumtemperatur, bis alle Kristalle gelöst sind. Schütteln Sie kein Rohr oder Wirbel – das führt zu Blasenbildung, die Proteine an die Oberfläche zieht und verhindert, dass sich BSA vollständig auflöst.
    5. Nach vollständiger Auflösung fügen Sie Triton X-100 hinzu, sodass die Endkonzentration 0,2 % (v/v) beträgt, gegeben das in Schritt 1,3 gewählte Volumen. Wenn Kristalle nicht vollständig gelöst sind, pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Lösung langsam zu mischen, ohne dass Blasen entstehen.
      HINWEIS: Wenn Sie einen modifizierten Puffer herstellen, fügen Sie das 10%ige Ziegenserum in diesen Prozess ein. Modifizierte Blockpuffer sollten jedoch während der Nutzung frisch hergestellt und nicht über längere Zeit gelagert werden, aber sicherstellen, dass die Endkonzentrationen wie in der Materialtabelle angegeben sind – 3 % BSA, 0,2 % Triton X-100.
    6. Mach einen Waschpuffer:
      Wiederholen Sie die Schritte für den Blockpuffer in 1.1.2, verwenden Sie jedoch die im Materialbereich und hier aufgeführten Konzentrationen für Ihre Bequemlichkeit (0,2 % BSA, 0,1 % Triton X-100 in 1X -DPBS, und für modifizierte Varianten 1 % Ziegenserum).
    7. Machen Sie eine fixative Lösung:
      1. Fügen Sie PBS in eine Zentrifugenröhre hinzu.
      2. Gib der Zentrifugenröhre eine passende Menge von 16 % Paraformaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 4 % zu erreichen.
        HINWEIS: Bereiten Sie frisch und bereit vor, wenn Sie die Zellen aus dem Inkubator nehmen. Obwohl die aktuelle Fixationslösung normalerweise kein Glutaraldehyd verwendet, kann sie enthalten sein und ist aufgrund der robusteren Fixierung und einer länger anhaltenden Fixierung im Vergleich zu Paraformaldehyd nützlich. Die Einrichtung von dSTORM verfügt nicht über die Möglichkeit für Fluoreszenzlebensdauersignale aus Glutaraldehyd (GA), jedoch könnten Nutzer, die die Möglichkeit haben, dies nützlich finden, sich von fluorophor-gekennzeichneten Strukturen zu trennen.
    8. Stellen Sie eine Abschrecklösung her:
      1. Wiege Natriumborhydrid auf dem Wigepapier ab.
      2. Zentrifugenrohr bereiten.
      3. Gib Natriumborhydrid in die Tube.
      4. Fügen Sie PBS in die Tube hinzu.
        HINWEIS: Die Lösung sollte nach dem Zufügen des PBS Blasen haben.
    9. Erstellen Sie Bildpuffer:
      1. Lösen Sie 1,4-Diazabicyclooctan (DABCO) in deionisiertem RNASE- und DNASE-freiem Wasser auf, um eine 13-mL DABCO-Lösung mit einer Konzentration von 1 M herzustellen.
      2. Fügen Sie 12 M HCl (~240 μL) hinzu, bis der DABCO vollständig gelöst ist und der pH-Wert 8,0 erreicht.
      3. Bereite 1 M Natriumsulfit durch Auflösen in 10-fachem PBS vor. DTT erfordert keine Vorbereitung.
      4. Für die Endpräparation verwenden Sie vorherige Vorräte, um 65 mM DABCO mit 30 mM Natriumsulfit und 30 mM DTT (1 M Lager) in deionisiertem Wasser herzustellen.
      5. Stellen Sie den pH-Wert durch Titration mit HCl und NaOH an, bis der pH-Wert 8,0 erreicht. Lagern Sie abgedeckt und mit Parafilm bei 4°C höchstens 2 Monate versiegelt. Überwachen Sie den pH-Wert während der gesamten Nutzung.
  2. Details zum ersten Etikettfärbungsprozess:
    1. Fixierung:
      1. Nehmen Sie lebende Zellen aus dem Inkubator und entfernen Sie das Zellkulturmedium aus der Schale. Entsorgen Sie das Zellkulturmedium in einem Biohazard-Abfallbehälter.
      2. Füge genug PBS hinzu, um die Zellen zu bedecken (1 ml für eine 35-mm-Schale und 500 μL für einen Kammerglas-Objektträger).
      3. Rühre die Schüssel vorsichtig, um die Zellen mit PBS zu waschen, und entferne dann das PBS aus der Schale. Entsorgen Sie das PBS in einem Biohazard-Abfallbehälter.
      4. Füge genug fixierende Lösung hinzu, um die Zellen zu bedecken (1 ml für eine 35-mm-Schüssel und 500 μL für einen Kammerglas-Objektträger), und lasse die Zellen dann 10 Minuten fixieren.
      5. Während die Zellen fixiert werden, wird Natriumborhydrid für die Abschrecklösung abgewogen und in ein Zentrifugenrohr gegeben.
      6. Entferne die fixierende Lösung aus der Schüssel und entsorge sie in den entsprechend gekennzeichneten flüssigen Chemikalienabfallbehälter.
    2. Abschrecken
      1. Fügen Sie der Schale genug PBS hinzu, um die Oberfläche zu bedecken (1 ml für eine 35-mm-Schüssel und 500 μL für einen Glas-Objektträger), dann stellen Sie die Schale für 5 Minuten auf einen Shaker (jeder Standardshaker ist in Ordnung), um die Zellen zu reinigen.
      2. Nimm die Schüssel vom Shaker, entferne das PBS und entsorge es in den entsprechend gekennzeichneten flüssigen Chemikalienabfallbehälter.
      3. Fügen Sie der Schale genügend (250 μL, 8-Well-Schüssel) Abschreckungslösung hinzu, um die Oberfläche zu bedecken (1 mL für eine 35 mm Schüssel und 500 μL für eine Glasblende), dann stellen Sie die Schale für 7 Minuten auf einen Shaker, um die Autofluoreszenz in den Zellen abzuschrecken.
      4. Während die Zellen am Schüttler sind, entsorgen Sie die verbleibende Abschrecklösung in der Zentrifugenröhre im entsprechend gekennzeichneten flüssigen Chemikalienbehälter.
      5. Nimm die Schale vom Shaker, entferne die Abschrecklösung und entsorge sie in den entsprechend gekennzeichneten flüssigen Chemikalienbehälter.
      6. Fügen Sie genug (250 μL, 8-Well-Schüssel) PBS zur Schüssel hinzu, um die Oberfläche zu bedecken (1 ml für eine 35-mm-Schüssel und 500 μL für einen Glas-Objektträger), dann stellen Sie die Schale für 5 Minuten auf einen Shaker, um die Zellen zu reinigen.
      7. Nimm die Schüssel vom Shaker, entferne das PBS und entsorge es in den entsprechend gekennzeichneten flüssigen Chemikalienabfallbehälter.
      8. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.2.6 und 1.2.2.7 noch zweimal (insgesamt 3 PBS-Waschungen).
    3. Blocken
      1. Füge der Schale genügend Blockpuffer hinzu, um die Oberfläche zu bedecken (250 μL, 8-Well-Schale, 1 mL für eine 35-mm-Schüssel und 500 μL für einen Kammerglas-Träger).
      2. Stellen Sie die Schale mindestens 1 Stunde auf einen Shaker, um die Zellmembranen zu permeabilisieren und die Bindungsstellen zu blockieren (besetzen Sie die nicht näher bezeichneten Stellen, damit sie die Zielstellen nicht beeinträchtigen). (Obwohl wir verschiedene Male getestet haben, um die minimale erfolgreiche Blockdauer von 20 Minuten zu bestimmen, empfehlen wir dringend, mindestens eine Stunde oder länger bis zu einer Nacht zu blockieren. Optimierung könnte angesichts des Ziels und der Zelllinie notwendig sein.)
      3. Während die Zellen auf dem Shaker sind, bereiten Sie eine primäre Antikörperfärbungslösung vor (siehe empfohlene Konzentration auf der Website des Anbieters oder siehe Tabelle im Materialbereich).
      4. Um das Gesamtvolumen der zu erzeugenden Färbelösungen zu bestimmen, fügen Sie 0,5 ml dem benötigten Volumen zur Abdeckung der Zellen hinzu (z. B. bereiten Sie für eine 35-mm-Schüssel eine 1,5 mL Lösung vor).
      5. Entferne das in Abschnitt 1.2.3.1 bestimmte Volumen aus dem Blockpuffermaterial und gib dieses Volumen in ein neues Zentrifugenrohr, um die Färbungslösung herzustellen.
      6. Fügen Sie dem Blockpuffer ein angemessenes Volumen primären Antikörperbestand hinzu, um die richtige Endkonzentration zu erhalten. Primäre Antikörperlagermengen für mehrere häufig verwendete Antikörper sind im Materialbereich zu finden.
      7. Nimm die Schale vom Schüttel, entferne den Blockpuffer und entsorge sie in den entsprechend gekennzeichneten flüssigen Chemikalienabfallbehälter.
    4. Primäre Antikörperfärbung:
      1. Fügen Sie der Schale genügend primäre Antikörper-Färbungslösung hinzu, um die Oberfläche zu bedecken (1 ml für eine 35-mm-Schüssel und 500 μL für einen Glas-Objektträger), dann legen Sie die Schale für mindestens 1–2 Stunden bis zur Nachtschicht auf einen Shaker, um die zellulären Ziele zu markieren.
      2. Nimm die Schüssel vom Shaker, entferne die primäre Antikörperfärbungslösung und entsorge sie in den entsprechend gekennzeichneten flüssigen Chemikalienabfallbehälter.
      3. Fügen Sie der Schüssel genug Waschpuffer hinzu, um die Oberfläche zu bedecken (1 ml für eine 35-mm-Schüssel und 500 μL für einen Glas-Kammerglas), dann legen Sie die Schüssel für 5 Minuten auf einen Shaker, um die Zellen zu reinigen.
      4. Nimm die Schüssel vom Schüttel, entferne den Waschpuffer und entsorge sie in den entsprechend gekennzeichneten flüssigen Chemikalienabfallbehälter.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.4.3 und 1.2.4.4 noch zweimal (insgesamt 3 Waschpuffer-Washes).
      6. Während die Zellen beim letzten Waschen auf dem Shaker sind, bereiten Sie eine sekundäre Antikörperfärbungslösung vor (siehe empfohlene Konzentration auf der Website des Anbieters oder siehe frühere Experimente).
      7. Um das Gesamtvolumen der zu erzeugenden Färbelösungen zu bestimmen, fügen Sie 0,5 ml dem benötigten Volumen zur Abdeckung der Zellen hinzu (z. B. bereiten Sie für eine 35-mm-Schüssel eine 1,5 mL Lösung vor).
      8. Entferne das in Abschnitt 1.2.4.7 bestimmte Volumen aus dem Blockpuffer und gib dieses Volumen in ein neues Zentrifugenrohr, um die Färbungslösung herzustellen.
      9. Fügen Sie dem Blockpuffer ein angemessenes Volumen sekundären Antikörper hinzu, um die richtige Endkonzentration zu erhalten. Sekundäre Antikörperbestandsvolumina für mehrere häufig verwendete Antikörper sind in der Materialtabelle zu finden.
      10. Wickle das Zentrifugenrohr mit der sekundären Antikörper-Färbungslösung mit Alufolie um, bis es bereit ist, den Zellen in der Schale zuzufügen.
    5. Sekundäre Antikörperfärbung:
      1. Fügen Sie der Schale genügend sekundäre Antikörper-Färbungslösung hinzu, um die Oberfläche zu bedecken (1 ml für eine 35-mm-Schale und 500 μL für einen Kammerglas-Objektträger), dann setzen Sie die Schale für mindestens 40 Minuten auf einen Shaker, um Fluorophore zu den markierten zellulären Zielen hinzuzufügen.
      2. Achten Sie darauf, dass die Schale mit Alufolie bedeckt ist, um Fluorophorbleiche zu verhindern.
      3. Nimm die Schale vom Shaker, entferne die sekundäre Antikörperfärbungslösung und entsorge sie in den entsprechend gekennzeichneten flüssigen Chemikalienabfallbehälter.
      4. Füge der Schüssel genug PBS hinzu, um die Oberfläche zu bedecken (1 ml für eine 35-mm-Schüssel und 500 μL für einen Kammerglas-Objektträger), dann stelle die Schale für 5 Minuten auf einen Shaker, um die Zellen zu reinigen.
      5. Nimm die Schüssel vom Shaker, entferne das PBS und entsorge es in den entsprechend gekennzeichneten flüssigen Chemikalienabfallbehälter.
      6. Wiederholen Sie die Abschnitte 1.2.5.4 und 1.2.5.5 noch einmal (insgesamt 2 PBS-Washes).
      7. Die Zellen können nun abgebildet oder später für die Bildgebung gespeichert werden. Wenn Sie sofort bildgeben, folgen Sie den Schritten im Bereich Erwerbung. Wenn Sie später für die Bildgebung lagern, folgen Sie weiterhin den folgenden Schritten.
      8. Gib vor der Lagerung genug PBS in die Schüssel, um die Oberfläche zu bedecken (1 ml für eine 35-mm-Schüssel und 500 μL für einen Glas-Objektträger).
      9. Wickle die Schale mit Parafilm und dann mit Alufolie, um sowohl Flüssigkeitsverdunstung als auch Fluorophorbleichen zu verhindern.
      10. Die eingewickelte Schale bei 4°C aufbewahren, bis sie bereit zum Abbilden ist.
        HINWEIS: Für die in diesem Protokoll verwendeten Etiketten können Teller 2–3 Tage gelagert werden, bevor die Bildqualität erheblich beeinträchtigt wird; Allerdings können verschiedene Antikörper unterschiedliche Stabilitäten aufweisen, sind aber mit richtiger Speicherung noch eine gewisse Zeit nach Abschluss des Protokolls stabil. Die Aufbewahrung eines beschrifteten Gerichts länger als eine Woche wird nicht empfohlen, da die fixierende Lösung nicht ausreichend für eine langfristige Stabilität konzentriert ist.
  3. Nachfolgender Etikettfärbungsprozess:
    1. Blocken:
      1. Siehe 1.2.3.1 - 1.2.3.2, aber verwenden Sie den Blockpuffer mit Ziegenserum. Die Inkubationszeit für das Blockieren kann so kurz wie 1 Stunde betragen, empfehlen jedoch längere Zeiten mit einer oberen Grenze von über Nacht (18–24 Stunden) für diese folgenden Etiketten, um die Off-Target-Bindung zu verringern. Bitte beziehen Sie sich auf frühere Experimente.
      2. Bereiten Sie in der Zwischenzeit primäre Antikörperlösungen vor, anstatt den Blockpuffer zu blockieren, mit Ziegenserum.
    2. Primäre Antikörperfärbung:
      1. Bereiten Sie den modifizierten Blockpuffer und Waschpuffer mit Ziegenserum sowie den Waschpuffer mit Ziegenserum vor, wie im Abschnitt zur Puffervorbereitung beschrieben.
      2. Siehe die Schrittabschnitte 1.2.3-1.2.4 (Blockieren und primäre Antikörperfärbung) unter Verwendung der modifizierten Block- und Waschpuffer:
        HINWEIS: Die Inkubationszeit für den primären Antikörper kann so kurz wie 1 Stunde und so lang wie über Nacht (8–24 Stunden) betragen. Obwohl die beste Label-Leistung mit längeren Inkubationszeiten erzielt wurde, insbesondere bei Multi-Labels. Die Daten in diesem Protokoll wurden mit nächtlichen Inkubationsschritten vorbereitet.
      3. Kurz vor Ablauf der Inkubationszeit bereiten Sie sekundäre Antikörperlösungen im modifizierten Blockpuffer 1.1.3 vor.
    3. Sekundäre Antikörperfärbung:
      1. Siehe Abschnitt 1.2.5 (Sekundäre Antikörperfärbung), verwenden Sie jedoch Blockpuffer mit Ziegenserum.
        HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass die Inkubationszeit so kurz wie 1 Stunde sein kann, aber wir haben längere Zeiten (2-4 Stunden) mit ähnlicher Leistung getestet. Für die nächsten Etiketten wiederholen Sie bitte Abschnitt 1.3.

2. Erwerbsprozess

HINWEIS: Für die Datenerfassung verwenden Sie Nikon Imaging Software (NIS) Elements, die mit dem verwendeten Mikroskop kompatibel ist. Jede Software, die Filter, Lichtweg und Kameraeinstellungen steuern kann, ist für dieses Protokoll in Ordnung. Das folgende Bildgebungsprotokoll ist für die Total Internal Reflectance Fluorescence (TIRF)-Beleuchtung der Probe angepasst; das Labeling-Protokoll ist jedoch mit mehreren Bildgebungsformen kompatibel. Nicht-TIRF-Bildgebung ist mit diesem Bezeichnungsprotokoll für STORM möglich und wird für 3D-STORM-Anwendungen benötigt. Bitte verwenden Sie ein Standardprotokoll für alternative bildgebende Methoden.

  1. Nachfolgender Etikettfärbungsprozess:
    1. Schalten Sie die benötigten optischen Komponenten ein und stellen Sie eine Verbindung mit der richtigen Software her. In den meisten Fällen, wie bei NIS, initialisiert die Software nicht vollständig, es sei denn, der Computer kann richtig mit Mikroskop, Kamera und Bühnensteuerung kommunizieren.
    2. Open NIS Software (oder äquivalent).
    3. Live-Ansicht einrichten: Live-Ansicht aktivieren > Auto-Skalierung aktivieren > unter den Kameraeinstellungen die Belichtungszeit auf 30 ms einstellen.
    4. Richte den Datenpfad für Erwerbungen ein.
    5. Navigiere zum oberen Panel Erfassen> Schneller Zeitraffer> Pfad
    6. Wählen Sie den richtigen Dateinamen für die erste Erwerbung aus und stellen Sie die Anzahl der Frames auf 10.000 fest.
      HINWEIS: Diese Maßnahmen dienen dazu, die Zeit zu begrenzen, in der die Probe der Lichtquelle ausgesetzt ist, sobald die Bildaufnahme beginnt.
    7. Stellen Sie sicher, dass der kritische Winkel und der Nullwinkel von TIRF vor der Erfassung voreingestellt sind. Bitte konsultieren Sie Online-Quellen zu Tutorials, wie man dies erreicht. Wie bereits erwähnt, kann dieser Schritt übersprungen werden, wenn Sie keine TIRF-Beleuchtung verwenden.
    8. Wählen Sie den richtigen Lichtweg für die Kamera aus und schalten Sie die Epi-Beleuchtungsoption unter Lampen (auf NIS oder gleichwertiger Software) ein, um sicherzustellen, dass der Spiegel für Weitfeldbeleuchtung durch eine nicht-lasergestützte Standardlichtquelle eingestellt ist.
  2. Probenvorbereitung:
    1. Entnehmen Sie Proben und fügen Sie der Probe einen Bildpuffer (Formulierung beschrieben in Abschnitt 1.1 Puffervorbereitung) hinzu. (Je nach verwendetem Bildpuffer müssen unterschiedliche Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. Schützen Sie Proben vor Licht.)
    2. Nachdem Sie das Objektiv mit Öl gefüllt haben, setzen Sie die Probe mit dem richtigen Halter auf die Bühne, schalten Sie Perfect Focus um und fokussieren Sie anschließend auf die Probe.
  3. Bildnehmende Schritte:
    1. Finde einen Laserpunkt und navigiere zu einem Punkt auf der Schüssel/Platte ohne Zellen.
    2. TIRF-Beleuchtung umschalten.
    3. Filter anpassen, um den passenden Filter zu passen, der rotes (oder welcher Laser auch immer zur Datenerfassung für diese spezielle Probe verwendet) Licht durchlässt.
      HINWEIS: Verwenden Sie einen Multi-Notch-Filter wie in der Materialtabelle beschrieben. Ein Multi-Notch-Filter ist nicht erforderlich, und Nutzer können alternativ imaginge undeutliche Filterwürfel anwenden, die für die in ihrer Färbung verwendeten Fluorophore entwickelt wurden.
    4. Schalten Sie den Laser mit der niedrigsten Laserleistung ~ 1 mW ein (dies hängt von der Lichtquelle ab, dient aber dazu, versehentliches Bleichen zu verhindern) und stellen Sie den Spiegelwinkel auf den kritischen Winkel ein.
    5. Wenn keine Zellen in der Nähe sind, erhöhen Sie die Laserleistung, bis der Laserpunkt in der Live-Ansicht klar sichtbar ist.
    6. Verwenden Sie das Region of Interest (ROI)-Werkzeug, zeichnen, setzen und speichern Sie den ROI, wo sich der Laserpunkt befindet.
      HINWEIS: Für Mehrfach-Label-Proben stellen Sie bitte sicher, dass die Laserpunkte aller notwendigen Lichtquellen für die Probe ausgerichtet sind. In diesem Protokoll verwenden wir drei Laser und stellen sicher, dass alle Punkte ausgerichtet sind. Dies ist unerlässlich, da die Ko-Registrierung räumlicher Daten die Laserausrichtung erfordert.
    7. Kehren Sie zur Epi-Beleuchtung und dem Bright-Field-Filter zurück.
    8. Mit dem ROI-Definitionstool navigieren Sie, um eine geeignete gesunde Zelle zu finden (z. B. sollte eine passende HCT116-Zelle eine adhärentere, polygonale oder ovale Form mit klarer Zellgrenze haben).
    9. Zentriere den ROI am Kern und klicke auf OK, um in die ROI-Position zu zoomen (Führe helle Feldbeleuchtung durch, da der Zellzustand nicht direkt anhand von Weitfeld-Fluoreszenzbildern des Kerns bestimmt werden kann.
    10. Kehren Sie zur TIRF-Beleuchtung mit derselben Methode wie in 2.3.2 zurück.
    11. Wählen Sie den passenden Filter für das längste Wellenlänge markiertes Ziel (in den meisten Fällen ist dies weit rot, z. B. Alexa Fluor 647 markiertes Ziel). In der Regel wird zuerst die längste Wellenlänge ausgewählt, um eine Fotobleichprobe mit kürzeren Wellenlängen zu vermeiden, falls markierte Ziele sekundäre Spektren haben, die sich überlappen.
    12. Bei NIEDRIGER Laserleistung für jeden benötigten Laser (im Fall von mehreren Labels wären das 3 Laser) wird der Laser eingeschaltet und der Kern beleuchtet, um sicherzustellen, dass die Probe richtig ausgerichtet ist.
    13. Verwenden Sie TIRF-Steuerungen, um sicherzustellen, dass die Probe mit TIRF beleuchtet wird.
    14. Wählen Sie die passende Z-Position für die Übernahme basierend auf den Bedürfnissen aus. Dies kann jedoch kurz vor dem Erwerb angepasst werden.
    15. Set exposure time based on needs of the fluorophores (use anywhere between 10‬-30 ms).
    16. Klicken Sie auf Erwerben> schneller Zeitraffer.
    17. Stellen Sie die Frames auf ≥10.000 und klicken Sie auf Anwenden , um die Datei im angegebenen Verzeichnis zu erstellen.
    18. Schalte die Laserleistung auf 50 % ein und mach eine Fotobleichprobe.
    19. Der Kern sollte zunächst bleichen, aber kurz danach (Sekunden später) sollte er anfangen zu blinzeln.
    20. Kehren Sie zum gewünschten kritischen Winkel und zur Z-Position zurück, indem Sie gespeicherte Positionen umschalten oder manuell den Spiegelwinkel und die Z-Position steuern, um einen schnellen Zeitverlauf zu erzielen.
    21. Stellen Sie sicher, dass es keinen Drift in der Stufe gibt, sonst wird die Mitregistrierung von Multikanal-Bildern nicht korrekt durchgeführt. Verwenden Sie fiduciäre Marker (fluoreszierende Mikrokugeln) oder speichern Sie die Z-Position zu Beginn der Erfassung, um sie später zur Driftkorrektur mit der Positionsspeichermethode für die Mehrpunkterfassung im Gerät zu verwenden.
    22. Filter wechseln (oder ihn lassen, wenn man Multi-Notch mit Durchgangsband für benötigtes Fluorophor verwendet) und Abschnitt 2.3.17-2.3.20 wiederholen (Für nachfolgende Etiketten immer mit niedriger Laserleistung starten, Parameter anpassen und aufnehmen).
  4. Datenverarbeitung:
    1. Lade den RAW-Bildstapel mit dem Bio-Formats-Plugin in FIJI. Erzeugen Sie eine Projektion mit minimaler Intensität, indem Sie Image> Stacks> Z Project auswählen und Min-Intensität als Projektionstyp wählen. Ziehen Sie diese minimale Projektion mit dem Process > Image Calculator vom Rohbild-Stack ab. Beim resultierenden Bild wird eine Hintergrundsubtraktion (Prozess > Subtract Background) mit einem rollenden Kugelradius von 5 Pixeln durchgeführt.
    2. Definieren Sie das Interessengebiet (ROI) für einzelne Zellen entweder manuell oder mit dem Nuclei Outline-Plugin (Plugins > GDSC > Cells > Nuclei Outline).
    3. Führen Sie eine Lokalisierungsanalyse auf dem vorverarbeiteten Bildstack innerhalb des definierten ROI mit dem ThunderSTORM-Plugin durch (Plugins > ThunderSTORM > Run analysis). Verwenden Sie geeignete Parameter für eine robuste Lokalisierung (z. B. Bildfilter: B-Spline, Ordnung = 3, Skala = 2; Spitzenintensitätsschwelle = 1,5× std (Welle.F1); Subpixel-Lokalisierungsmethode: Gaußsch, Sigma = 2; Anpassungsradius = 4; Fitting-Methode: maximale Wahrscheinlichkeit). Die resultierenden Koordinaten können verwendet werden, um das Superauflösungsbild zu rekonstruieren.
    4. Für Mehrkanal-Experimente werden Kanäle zusammengeführt, um ein zusammengesetztes Chromatin-rekonstruiertes dSTORM-Bild zu erzeugen (Bild > Farb- > Merge-Kanäle).

Results

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Repräsentative dreifarbige Chromatin-dSTORM-Bilder

Das vorgeschlagene sequentielle Färbungsprotokoll wurde für verschiedene Zelllinien als gültig getestet, darunter BJ-Fibroblast, HCT116, AC16, HeLa, MCF10A usw. Abbildung 1 zeigt die repräsentativen Bilder von BJ-Fibroblast-, HeLa- und MCF10A-Zellen.

Validierung der Analysepipeline mit simulierten Datensätzen

Die Entwicklung eines dreifarbigen Immunfluoreszenzprotokolls erforderte die Entwicklung eines spezialisierten rechnergestützten Ansatzes, der in der Lage ist, die Komplexität von Multi-Target-nuklearen SMLM-Daten zu bewältigen (Abbildung 2A,2 B). Angesichts der dichten Chromatinumgebung, in der mehrere Ziele nebeneinander existieren, haben wir ein Punktwolkenanalyse-Framework implementiert, das Lokalisierungskoordinaten direkt verarbeitet, anstatt rekonstruierte Bilder zu verarbeiten. Dieser Ansatz nutzt die umfangreichen Clustering-Analysetools, die für Punktwolkendaten 40,41,42 verfügbar sind. Wir haben systematisch die Fähigkeit der Analysepipeline bewertet, biologisch bedeutsame räumliche Muster mithilfe kontrollierter simulierter Datensätze zu unterscheiden. Vier Verteilungstypen wurden generiert, um unterschiedliche Chromatin-Organisationsszenarien darzustellen: Normalverteilung für eng gruppierte Modifikationen, gleichmäßige Verteilung für verteilte Muster, toroidale Verteilungsmodellierung von Ausschlusszonen und Zufallsverteilung als organisatorische Kontrolle (Abbildung 2C). Diese simulierten Muster waren an echte Heterochromatin-Clusterpositionen verankert, die aus experimentellen H3K9me3-Daten abgeleitet wurden, wodurch realistische nukleare räumliche Einschränkungen erhalten blieben. Dieses Analyse-Framework verwendet DBSCAN-Clustering (Epsilon = 50 nm, Minimumpunkte = 3), was eine von vielen Methoden zur Clusteranalyse in SMLM-Daten 40,41,42 ist. Um korrekte Clustering-Parameter sicherzustellen, haben wir zuvor eine Optimierungsmethode beschrieben, die speziell für die Detektion der Chromatinpackungsdomänen34 entwickelt wurde. Bitte beachten Sie, dass die Nutzer bei der ersten Analyse die Parameter, die die Auswahl durch Struktur, Umgebung und Funktion ihres Ziels optimieren müssen. Hier werden die Clustergrenzen durch konvexe Hüllenberechnungen bestimmt, wodurch Annahmen über die Domänengeometrie ausgeschlossen werden. Unsere Validierung zeigte eine klare Unterscheidung zwischen allen simulierten Verteilungsmustern durch Histogrammprofile mit unterschiedlichen Distanzen (Abbildung 2D). Jeder räumliche Organisationstyp erzeugte charakteristische Signaturen, wenn Lokalisierungen relativ zu Heterochromatinzentriomiden analysiert wurden. Die Analyse der gemeinsamen Belegung wurde mit Dual-Marker-Simulationen mit kontrollierten räumlichen Beziehungen getestet (Abbildung 2E). Räumlich getrennte Marker (normal-toroidale Konfiguration) führten wie erwartet zu minimaler Gelenkdichte, was zu flachen Verteilungsprofilen führte (Abbildung 2E). Überlappende Markierungsmuster (normal-zufällige Konfiguration) führten zu einer abnehmenden Gelenkdichte mit zunehmender Entfernung zu den Referenzpunkten, was den theoretischen Vorhersagen entspricht. Diese Validierungsergebnisse zeigen die Fähigkeit unseres Frameworks, räumliche Kopplungsbeziehungen in komplexen Multi-Target-Datensätzen zu erkennen und zu quantifizieren. Für weitere Informationen darüber, wie diese simulierten Datensätze erstellt wurden, siehe bitte die vollständige Publikation34.

Repräsentative Ergebnisse aus der Chromatinorganisationsanalyse

Die Umsetzung unseres validierten Analyseansatzes in biologischen Proben zeigt charakteristische räumliche Organisationsmuster, die durch dieses Protokoll erreichbar sind. Mit HeLa-Zellen, die mit unserem Drei-Farb-Färbeverfahren für H3K9me3, H3K27ac und RNA-Polymerase II verarbeitet werden, demonstrieren wir die analytischen Fähigkeiten, die durch diese Methodik ermöglicht werden. H3K9me3-Heterochromatin dient als ideales Referenzsystem, basierend auf etablierten Belegen für die konzentrische Chromatinorganisation auf der 200-nm-Skala aus früheren Superauflösungsuntersuchungen 23,28,35. Die Analyse beginnt mit DBSCAN-basierter Identifikation von Heterochromatin-Domänen, die anschließend nach effektiven Radiusen kategorisiert werden: kleine Domänen (25–40 nm), mittlere Domänen (40–80 nm) und große Domänen (80–253 nm). Diese Größenschichtung erklärt die dokumentierte Heterogenität der DNA-Packungsdomänendimensionen, wobei durchschnittliche Domänen etwa 80 nm im Radius25 messen. Entfernungsmessungen verwenden ein 1,5-faches Cluster-Radius-Suchfenster (Abbildung 2B oben), um proximale Euchromatin- und Polymerasesignale zu erfassen (Abbildung 3A, B).

Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass sowohl H3K27ac als auch RNA-Polymerase II konsistent nahe Heterochromatingrenzen in allen Domänenkategorien lokalisieren, was mit früheren Studien28,44 und Modellen für die Transkriptionsposition relativ zu Chromatindomänen 23,35,45,46 übereinstimmt. Die quantitative Entfernungsanalyse zeigt mittlere Positionen sehr nahe an den Domänenranden: Große Domänen zeigen H3K27ac bei -1,0 nm und RNA-Polymerase II bei 8,4 nm von Grenzen entfernt, während kleinere Domänen vergleichbare periphere Assoziationen mit geringfügigen Positionsunterschieden aufweisen. Diese Messungen zeigen, dass aktive Chromatinelemente sich an der Grenzfläche zwischen repressiven und permissiven Domänen konzentrieren, anstatt vollständig ausgeschlossen zu sein. Die Analyse der Gelenkdichte zeigt die Fähigkeit des Protokolls, räumliche Kopplungen zwischen ko-labelten Zielen aufzuzeigen (Abbildung 3C-F). Eine Analyse im Vergleich zu Heterochromatindomänen zeigt eine Spitzendichte der Gelenke knapp außerhalb der Domänengrenzen (r/r₀> 1), was auf eine bevorzugte H3K27ac-RNA-Polymerase-II-Kolokalisierung in peripheren Regionen hinweist (Abbildung 3G-I). Diese Ergebnisse zeigen, wie diese Färbungs- und Analysepipeline dazu beitragen kann, komplexe räumliche Beziehungen in dichten Umgebungen zu untersuchen.

figure-results-1
Abbildung 1: Drei Farbabbildungen der verwendeten Zellen. Dreifarbige Bilder von (A) BJ-Fibroblast, (B) HeLa und (C) MCF10A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-2
Abbildung 2: Quantitativer Analyserahmen für die räumliche Organisation von Zielen relativ zu Heterochromatinclustern. (A) Analysepipeline für in dieser Studie verwendete Mehrkanal-SMLM-Daten. (B) Schaltplan der Abstandsberechnungen zur Peripherie für identifizierte Heterochromatincluster und Joint Affinity Counting-Methode. Beide Methoden werden verwendet, um die Anordnung zweier Ziele in Bezug auf die Struktur des Heterochromatinclusters quantitativ zu bestimmen. (C) Beispiel-Streuverteilungen um spezifische Heterochromatin-Cluster, die in einerStudie 34 verwendet wurden, um unterschiedliche biologische Organisationen zielgerichteter Strukturen zu bestimmen (innerhalb einer Domäne gruppiert vs. um die Domäne herum vs. nicht assoziiert und zufällig verteilt). (D) Entfernung zum Peripherie-Histogramm für zentral gruppierte, zufällig verteilte und toroidal verteilte Kurven und (E) Gelenkaffinitätskurven für Simulationsfälle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-3
Abbildung 3: Quantitative räumliche Beziehungen von Transkriptionsmarkern um Histondomänen. (A) Ergebnisse des Entfernungs-Peripherie-Histogramms für beispielhafte biologische Daten mehrmarkierter HeLa-Zellen. Für kleine (<40 nm), mittlere (40-80 nm) und große (>120 nm) Domänen für RNAPII und (B) H3K27ac im Vergleich zu H3K9me3-Clustern. (C-E) Beispielbilder für das dreilabelte dSTORM-Bild einer HeLa-Zelle (H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p) mit Einsatz- und Zoombild für eine einzelne Domäne. (F) Konvexe Hülle (rot) Fitting des Definitionsbereichs abgebildet in E mit Analysezone in Grau. (G) Affinitätsdiagramme für RNAPII relativ zu H3K27ac und H3K27ac (H) relativ zu RNAPII in der Analyse-ROI für alle Domänen in den Daten mittlerer Größe im Datensatz. (I) Gemeinsame Dichte von RNAPII und H3K27ac bei der Analyse-ROI für alle mittelgroßen Domänen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Discussion

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Dieses dreifarbige SMLM-Protokoll stellt einen bedeutenden Fortschritt in unserer Fähigkeit dar, die Chromatinorganisation im dichten nuklearen Milieu zu untersuchen. Der sequentielle Immunfluoreszenz-Markierungsansatz, kombiniert mit der Punktwolken-Raumanalyse, bei der Lokalisationsschätzungen als Punkte als Grundlage der Analyse dienen, bietet Forschern ein leistungsstarkes Werkzeug, um nanoskalige Beziehungen zwischen verschiedenen Chromatinmodifikationen und aktiver Transkriptionsmaschinerie zu untersuchen, die zuvor mit herkömmlichen Mikroskopietechniken nicht nachweisbar waren.

Die sequentielle Färbungsstrategie des Protokolls adressiert grundlegende Herausforderungen, die der Multi-Target-Kernbildgebung innewohnen. Im Gegensatz zu zytoplasmatischen oder membranassoziierten Strukturen, die relativ spärlich sind, existieren nukleare Chromatinziele in extrem hoher Dichte mit überlappenden räumlichen Domänen. Unser modifizierter Blockierungsansatz, bei dem nach jeder Markierungsrunde Serum von sekundären Antikörperwirtsarten einbezogen werden, verhindert effektiv Kreuzreaktivität zwischen Antikörperpaaren und erhält gleichzeitig die Ziel-Spezifität. Die nächtlichen Inkubationen bei 4°C gewährleisten eine vollständige Antikörperpenetration im gesamten Kernvolumen, was entscheidend ist, um eine gleichmäßige Markierungsdichte zu erreichen, die für die quantitative SMLM-Analyse notwendig ist. Dieses Protokoll erzeugt zuverlässig Bilder mit einer Auflösung von 15–20 nm über mehrere Zelllinien hinweg, was es für Chromatin-Organisationsstudien breit anwendbar macht.

Im Folgenden finden Sie Tipps zur Fehlersuche für die Bildgebungssitzung. Wenn die Kerne nicht bleichen, ist die wahrscheinlichste Ursache eine unzureichende Laserintensität an der Probe, was auf eine niedrige Leistungseinstellung oder einen falschen TIRF-Winkel zurückzuführen sein kann; in diesem Fall beheben Sie die Fehlersuche, indem Sie die Laserausrichtung überprüfen, die Laserleistung erhöhen und den TIRF-Winkel sorgfältig anpassen. Wenn die Blinzeln im Kern sehr selten sind, aber konstant hell bleiben, deutet dies darauf hin, dass die Kerne nicht ausreichend gebleicht sind. Wenn die Blinzeln sehr selten sind und die Kerne überhaupt nicht sichtbar sind, ist die wahrscheinlichste Erklärung eine erfolglose Färbung, und die Reagenzien und Antikörper sollten vor Wiederholung des Protokolls überprüft werden. Umgekehrt, wenn die Anzahl der nuklearen Blinks sehr hoch ist (ein wünschenswertes Ergebnis), ist eine längere Bleichzeit erforderlich, bis einzelne, gut getrennte Einzelmolekül-Blinks visuell aufgelöst werden können. In herkömmlichen SMLM-Experimenten kann die angemessene Markierungsdichte oft mit gut definierten Referenzstrukturen wie Mikrotubuli geschätzt werden; Chromatin weist jedoch eine hoch heterogene Organisation auf und besitzt keine klar definierte Grundwahrheitsstruktur, was eine solche Schätzung erschwert. Basierend auf empirischer Optimierung und vorherigen Erfahrungen stellen wir daher sicher, dass die effektive Markierungsdichte etwa 100 Lokalisierungen pro μm² erreicht, um eine robuste Rekonstruktion der Chromatinpackungsdomänen zu ermöglichen. In unserem Protokoll haben wir keine treuhänderischen Marker verwendet, empfehlen aber, wenn die Nutzer welche haben. In unseren Experimenten bleiben die seitlichen Verschiebungen innerhalb von 0,2 Pixeln (weniger als ~5 nm), was vernachlässigt werden kann. Deshalb haben wir keine treuhänderischen Marker verwendet.

Die Wahl von H3K9me3, H3K27ac und RNA-Polymerase II liefert ergänzende Informationen über die Chromatinorganisation auf nanoskaliger Ebene. H3K9me3 dient als ideale räumliche Referenz, da es diskrete, wohldefinierte Cluster bildet, die konstitutives Heterochromatin repräsentieren und zuverlässig durch automatisierte Clustering-Algorithmen identifiziert werden können. H3K27ac markiert ein enhancerassoziiertes Chromatin, das aktiv an der Genregulation beteiligt ist, während RNA-Polymerase II direkt auf aktive Transkriptionsstellen hinweist. Zusammen ermöglichen diese drei Ziele die Untersuchung, wie sich Transkriptionsmaschinen und regulatorische Chromatinmodifikationen relativ zu heterochromatischen Regionen innerhalb der Kernarchitektur organisieren.

Das Punktwolkenanalyse-Framework adressiert kritische Einschränkungen früherer Chromatin-Organisationsstudien, indem es eine umfassende räumliche Analyse in dichten nuklearen Umgebungen ermöglicht. Traditionelle paarweise Vergleichsmethoden können die komplexen räumlichen Beziehungen nicht erfassen, die entstehen, wenn mehrere Chromatinmodifikationen innerhalb derselben Kernregionen koexistieren. Unser Ansatz nutzt eine Gelenkdichteanalyse, um herauszufinden, wo H3K27ac und RNA-Polymerase II relativ zu H3K9me3-Clustern kolokalisieren, was quantitative Informationen liefert, die aus separaten Zweifarb-Experimenten nicht gewonnen werden können.

Repräsentative Ergebnisse zeigen durchweg ein kohärentes Organisationsmodell statt einer strikten Chromatintrennung. Sowohl H3K27ac als auch RNA-Polymerase II lokalisieren sich bevorzugt an Heterochromatincluster-Peripherien über verschiedene Domänengrößen, wobei quantitative Messungen eine Positionierung innerhalb von 10 nm der Clustergrenzen zeigen, was Ergebnisse anderer Gruppen mit ähnlichen Methoden und Transkriptionsmodellen unterstützt: 23,28,35,45,46. Die Analyse der Gelenkdichte zeigt, dass aktive Transkriptionsmaschinerie und enhancerassoziiertes Chromatin am häufigsten in Regionen rund um heterochromatische Haufen koppeln. Diese Ergebnisse stellen einfache Phasentrennungsmodelle infrage und unterstützen integrierte Organisationsprinzipien, bei denen verschiedene Chromatinmodifikationen eine enge räumliche Nähe aufrechterhalten, anstatt getrennte Kompartimente zu bilden.

Das modulare Design des Protokolls ermöglicht die Untersuchung vielfältiger chromatinbiologischer Fragestellungen durch Zielsubstitution bei gleichbleibendem analytischen Rahmen. Studien zum Replikationszeitpunkt können Zellzyklusproteine wie Proliferationszell-Nuklearantigen (PCNA) und Mini-Chromosomen-Erhaltung (MCM) ersetzen, während DNA-Schadens-Response-Untersuchungen γH2AX und Reparaturfaktoren anvisieren könnten. Zellzyklusstudien könnten Histonmodifikationen untersuchen, die sich während der Teilung verändern, und die Differenzierungsforschung könnte sich auf epigenetische Merkmale konzentrieren, die mit der Linie verbunden sind. Der sequentielle Markierungsansatz berücksichtigt jede Kombination von Kernproteinen oder Chromatinmodifikationen, für die zuverlässige Antikörper existieren, was hauptsächlich durch spektrale Kompatibilität und Kreuzreaktivität begrenzt ist. Diese Flexibilität ermöglicht es Forschern, grundlegende Fragen zur Chromatindynamik während verschiedener zellulärer Prozesse zu beantworten und dabei quantitative räumliche Analysefähigkeiten beizubehalten.

Disclosures

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Die Autoren dieses Protokolls haben keine offengelegten oder konkurrierenden Interessen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch NIH-Fördermittel U54CA268084, U54CA261694 und R01CA228272, National Science Foundation Fördermittel EFMA-1830961 und CBET-2430743 sowie philanthropische Unterstützung von Rob und Kristin Goldman, Herrn David Sachs und der Christina Carinato Charitable Foundation unterstützt.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Andor iXon Ultra 888 elektronenmultiplizierende CCD AndorDU-888U3-CSO-#BV NA
RinderserumalbuminSigma AldrichA7030Verwendet zum Blocken und Waschen von Puffern. Lagern Sie einen BSA-basierten Blockierungspuffer nicht länger als einen Monat bei 4 °F auf; C
Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd., Modell MGL-FN-532 (532 nm) PSU-H-LED https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htmNA
Kohärente OBIS Laserbox (405 nm, 488 nm, 532 nm, 552 nm, 637 nm)  Kohärent1228877 Laser kollimierten mit 3– 10 kW/cm³ Durchschnittsleistung an der Probe, mindestens 10.000 Bilder pro Wellenlängenkanal mit&NBSP; 10 & Strich; 30  MS&NBSP; Erwerbszeit. 
DABCO (1,4-Diazabicyclo-(2.2.2)-Oktan)SigmaD27802NA
DBPS (1X)Thermo Fisher14190-136NA
Destilliertes WasserNANAJedes destillierte Wasser ist in Ordnung;
DTT (Dithiothreitol), 1 MillionSigma43816NA
Acht gut kammergefüllte DeckglaseCellvisC8-1.5H-NEs kann jede Glasbodenplatte sein, aber das Volumen muss je nach Gefäß angepasst werden.
Ziegen-Anti-Maus AF568Thermo FisherA11004Bestandskonzentration: 2 mg/mL
Stabilität nach der Etikettierung: 2 & Strich; 3 Tage
Ziegen-Anti-Kaninchen AF647Thermo FisherA21245Lagerkonzentration: 2 mg/mL
Stabilität nach der Etikettierung: 4 & Strich; 5 Tage
Ziegen-Anti-Ratten-A488Thermo FisherA11006Bestandskonzentration: 2 mg/mL
Stabilität nach der Etikettierung: 2 & Strich; 3 Tage
H3K27ac PrimärantikörperThermo FisherMA5-23516Aktienkonzentration: 1,0 mg/mL&nbl;
H3K9me3 Primärer Antikörper  AbcamAB1769156Aktienkonzentration: 1,287 mg/mL 
Hochklares Polypropylen-Konische Röhre 15 mL&nbl;  Corning 352096Verwendet für fixative und abschreckende Lösungen 
Hochklares Polypropylen-Kegelrohr 50 mLCorning352070Verwendet für 40 ml Arbeitsbestände von Block- und Waschpuffern
Salzsäure (HCl), 12MSigma258148NA
Nikon Eclipse Ti-E mit perfektem Fokussystem NiikonTI-DH 611392 Invertiertes Mikroskop 
Nikon SR APO TIRF, 100-fache Vergrößerung, 1,49 NA Nikonhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series  NA
Normales ZiegenserumAbcamAB7481-1002Wird nach dem ersten Etikettieren verwendet. Sollte in Block- und Waschpuffern vorhanden sein
Paraformaldehyd 16 % Elektronenmikroskopiewissenschaften15710In fixierender Lösung verwendet, die innerhalb von 2 Wochen nach der Herstellung verbraucht werden sollte. Schützen Sie sich bei 4 °F vor Licht; C
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10XAmbionAM9625NA
Pipettenspitzen 1000 uLSureOne02-707-404Jede Pipettenspitze ist in Ordnung, solange sie s passend für das Volumen
RNAPII-PS2AbcamAB252855Aktienkonzentration: 0,98 mg/mL
NatriumborhydridThermo FisherS678-10Verwenden Sie jedes Mal frisch zum Abschrecken des Puffers. 
Natriumhydroxid (NaOH)Thermo Fisher A16037.36NA
NatriumsulfitSigmaS0505NA
Triton X-100 10%Thermo Fisher 28314NA

References

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