Spektroskopische Superauflösungsbildgebung von DNA-Molekülen unter Verwendung von intrinsischem Kontrast

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet detaillierte Operationen zur Probenvorbereitung, Datenerhebung und Analyse von DNA-intrinsischen Fluoreszenzspektren.

Zusammenfassung

Die Superauflösungsbildgebung hat die biologische Forschung revolutioniert, indem sie strukturelle Details im Nanomaßstab offenbart hat. Die meisten optischen Superauflösungsmethoden basieren auf der fluoreszierenden Markierung von Biomolekülen, was eine spezifische Markierung von Molekularspezies ermöglicht, aber die zellulären Funktionen stören, Ungenauigkeiten durch Linkermoleküle einführen und nicht die für die Chromatinbildgebung erforderliche konstante hohe Markierungsdichte bei einzelnen DNA-Molekülen liefern kann. Eine Technologie, die eine labelfreie, in situ genomische Bildgebung mit Nanometer-Auflösung ermöglicht, würde die Biologie tiefgreifend beeinflussen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die intrinsische Fluoreszenz der DNA nutzt, um spektroskopische Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (sSMLM) durchzuführen. Das Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung, Datenerfassung und spektrale Analyse. Kurz gesagt: Ein dünnes DNA-Gel wird hergestellt, indem eine Polynukleotidlösung auf Glas aufgetragen und stundenlang trocknen lässt. Nach der Gelbildung wird die Probe in Anwesenheit eines Bildpuffers mit sSMLM abgebildet. Der aufgezeichnete Datensatz besteht aus einem Bild der nullten Ordnung, das räumliche Lokalisierungen bereitstellt, und einem Bild erster Ordnung, das das Emissionsspektrum jeder Lokalisierung kodiert. Räumliche Rekonstruktionen werden aus den Daten der nullten Ordnung erzeugt, danach werden die entsprechenden Spektren aus dem Signal erster Ordnung extrahiert. Abschließend demonstrieren wir die Machbarkeit dieses Ansatzes unter Verwendung mehrerer Anregungswellenlängen und DNA-Moleküle mit unterschiedlichen Längen, Sequenzen und Zusammensetzungen.

Einleitung

Superauflösende Fluoreszenzmikroskopietechniken – darunter strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM), stimulierte Emissions-Depletionsmikroskopie (STED) und Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) wie photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) und stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) – haben die Auflösung der optischen Mikroskopie weit über die Beugungsgrenze ^1,2,3,4 hinaus gebracht^.5,6,7, was einen beispiellosen Zugang zur nanoskaligen Organisation von Chromatin ^8,9,10,11,12 ermöglicht. Derzeit basieren Färbungsmethoden zur Visualisierung von Nukleinsäurestrukturen jedoch auf der Markierung DNA-assoziierter Proteine statt auf der DNA selbst, oder verwenden kleine Molekülfarbe, die die Konfiguration des nativen Chromatins stören und die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigen können^{. 13,14}. Aufgrund dieser Einschränkungen ist die Entwicklung labelfreier optischer Superauflösungsbildgebungsmethoden unter nativen, nicht störenden Bedingungen äußerst wünschenswert. Das hier vorgestellte Protokoll ist für synthetische, gereinigte einsträngige oder doppelsträngige DNA-Nukleotiden gedacht, bei denen intrinsische Fluoreszenz zuverlässig nachgewiesen werden kann; es ist nicht für die Abbildung von Kern-DNA-Molekülen in festen oder lebenden Zellen optimiert.

Da Nukleinsäuren lange Zeit als nicht-fluoreszierend galten, da sie bei Raumtemperatur 15 bei Raumtemperatur^{15 etwa 10−4} und ultraschnellen Fluoreszenzzerfall bei Raumtemperatur 15 zerfallen, waren Studien zur intrinsischen Fluoreszenz der DNA (hauptsächlich der Fluoreszenzlebensdauer) bis zur Entwicklung der Femtosekundenspektroskopie selten. Es ist allgemein anerkannt, dass Nukleotide unter UV-Beleuchtung schwach fluoreszieren, während ihre Absorption im sichtbaren Bereich deutlich schwächer ist. Dennoch wurde kürzlich beobachtet, dass sichtbare, durch Licht angeregte Fluoreszenz unveränderter Nukleinsäuren in physiologisch relevanten Konzentrationen existiert¹⁶. Dieses Phänomen wurde wahrscheinlich übersehen, weil die meisten photochemischen Untersuchungen von Nukleotiden in verdünnten Lösungen (10–100 μM)^17,18,19,20 durchgeführt wurden, während in Kerne und Chromosomen die DNA-Konzentrationen 0,1–1 M^{erreichen können.} Noch wichtiger ist, dass stochastisches Fluoreszenzschalten unter sichtbarer^{Beleuchtung beobachtet} wurde, was den Grundstein für die Verwendung unveränderter Nukleinsäuren als endogene Kontrastmittel für lokalisierungsbasierte Superauflösungsmikroskopie legte.

Die photochemischen Eigenschaften von Nukleotidmonomeren und einzelsträngigen DNA-Molekülen mit einfachen Sequenzen bei physiologischen Konzentrationen unter sichtbarer Lichtanregung wurden²⁴ untersucht. Es wurde außerdem nachgewiesen, dass diese DNA-Moleküle stochastische Fluoreszenz-Switching-Eigenschaften besitzen, was gut mit der Theorie der Grundzustandsdepletion (GSD)^6,7 übereinstimmt, indem die Fluoreszenzrückgewinnung von Nukleotiden unter unterschiedlichen Depletionsbedingungen untersucht wird. Außerdem zeigen Nukleotide relativ hohe Quantenausbeute und geringe Intersystem-Überschneidungswahrscheinlichkeiten, sodass die Photonenzahlen und Blinkdauern einzelner Molekül-Emissionsereignisse mit denen beliebter exogener Farbstoffe in STORM (z. B. Alexa Fluor 647) vergleichbar sind, was unterschiedliche Spektren ^25,26 aufweist und DNA zu einem idealen intrinsischen Kontrastmittel für hochauflösende Bildgebung macht. Zusätzlich ermöglicht die Implementierung des im vorherigen Abschnitt beschriebenen spektralen Regressionsalgorithmus eine subzehn-Nanometer-Superauflösungsabbildung von Polynukleotiden und linearen einsträngigen DNA-Fasern²⁷.

Um das gesamte Spektrum der DNA-intrinsischen Fluoreszenz zu erfassen, verwendeten wir ein Dual-Wedge-Prisma (DWP) für die spektrale Detektion, das eine gleichzeitige hochdurchsatz-Einzelmolekül-spektroskopische Analyse und Bildgebung mit minimalem Übertragungsverlust und Wellenfrontfehler 28,29,30 ermöglicht, sowie eine Open-Source-spektroskopische SMLM-Analysesoftware (RainbowSTORM) für automatische Datenverarbeitung ^31,32. Aufbauend auf dieser Fähigkeit entwickelten wir eine Multi-Laser-SMLM-Plattform, die mit spektroskopischer Detektion und einer dedizierten spektralen Analysepipeline integriert ist. Das hier vorgestellte Protokoll umfasst die Probenvorbereitung, Datenerfassung und -analyse und bietet einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Nutzung der DNA-intrinsischen Fluoreszenz in der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie. Über die Ermöglichung von Proof-of-Concept-Studien zur Bildgebung einzelsträngiger Oligonukleotide und doppelsträngiger DNA-Moleküle mit intrinsischem Kontrast hinaus legte der Ansatz die Grundlage für breitere Anwendungen in der DNA-Bildgebung unter nativen, labelfreien Bedingungen, wie etwa der Sequenzvorhersage auf Basis intrinsischer DNA-Fluoreszenz in Kombination mit computergestützten Methoden.

Protokoll

1. Herstellung von DNA-Gelproben (Abbildung 1A)

1. Lösen Sie das DNA-Pulver (entweder Oligonukleotid oder doppelsträngige DNA) in nukleasefreiem, deionisiertem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 mM auf und lagern Sie die Lagerlösung bei -4 °C.
2. Bereiten Sie 5 μL-Aliquoten vor, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu minimieren. Wenn Sie gefrorene Aliquots verwenden, tauen Sie sie je nach Volumen bei Zimmertemperatur 5-15 Minuten auf.
3. Reinige einen Glasträger vorsichtig mit einem Labortuch. Pipettieren Sie 5 μL der 100 mM großen DNA-Moleküllösung auf den frisch gereinigten Glasträger und lassen Sie ihn 1–3 Stunden verdampfen, wodurch ein DNA-Gel entsteht.
4. Bedienen Sie diese Stufe aus Sicherheitsgründen in einer Abzugshaube. Bereiten Sie den Bildpuffer gemäß der Materialtabelle vor. Sowohl der β-Mercapptoethanol-Puffer als auch der DABCO-Puffer wurden validiert, um stochastisches Fotoswitching von DNA-Molekülen zu unterstützen.
5. Bedienen Sie diese Stufe aus Sicherheitsgründen in einer Abzugshaube. Fügen Sie dem DNA-Gel 5 μL Bildpuffer hinzu und legen Sie unmittelbar vor der Bildabbildung einen Deckzettel darauf. Es könnten Blasen im Inneren der abgedeckten Probe sein. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Blasen im Inneren der abgedeckten Probe zu entfernen,

2. Kalibrierung des sSMLM-Systems und Datenerfassung (Abbildung 1B)

1. Bereiten Sie ein gefertigtes Nanoloch-Array mit einem Lochdurchmesser von 100 nm und einem Abstand von 4 μm vor, angeordnet in 8 Reihen x 5 Spalten, für die folgende Kalibrierung des spektroskopischen SMLM-Systems³³.
   HINWEIS: Alternativ kann auch die 1951 Resolution Chart (R3L1S4N) der United States Air Force (USAF) für die spektrale^{Kalibrierung 33} verwendet werden.
   1. Erzeugen Sie das Nanolocharray durch sequentielles Metallsputtern und fokussiertes Ionenstrahl-(FIB)-Fräsen. Zunächst wird eine 150 nm dicke Aluminiumfolie auf einen 22 x 22 mm großen Borosilikatglas-Deckglied mit DC-Sputterung bei 75 W und 20 Standard-Kubikzentimetern pro Minute (SCCM) Argonfluss bei 3 mTorr aufgetragen.
   2. Führen Sie ein 5 x 8 Nanoloch-Array in die Aluminiumschicht mit FIB-Fräsen, die mit einer Beschleunigungsspannung von 30 kV betrieben wird.
2. Schalten Sie das spektroskopische SMLM-System ein (Abbildung 2), setzen Sie Schmalbandfilter (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm und 750 nm) direkt vor die Kamera ein und verwenden Sie eine weiße Lichtquelle (z. B. die Mikroskoplampe), um die Kalibrierungsprobe zu beleuchten.
3. Sammeln Sie 10 Bilder pro Filter. Stellen Sie die Belichtungszeit für 532 nm, 580 nm, 633 nm und 680 nm auf 200 ms und für 750 nm auf 200 ms und auf 2000 ms für 750 nm ein, aufgrund der niedrigen Intensität der Lampe und der geringen Effizienz der Kamera im Nahinfrarotbereich (Abbildung 3).
4. Laden Sie die DNA-Gelprobe auf das Mikroskop, stellen Sie sicher, dass die Abdeckungsseite zum Objektiv zeigt, und öffnen Sie die Kamerasoftware zur Datenerfassung.
5. Identifizieren Sie die passende Z-Position mit Hilfe des automatischen Fokus-Tracking-Systems und stellen Sie sicher, dass klares stochastisches Blinken sichtbar ist. Dieser Schritt ist entscheidend und erfordert Geduld, da DNA-Gelproben keine offensichtlichen morphologischen Hinweise wie Zellstrukturen aufweisen, was die Navigation zu einem richtigen Signal erschwert.
6. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv die Deckungskante nicht berührt, da dies zu Pufferlecks ins Immersionsöl führen und die Verfolgung beeinträchtigen kann.
7. Erfassen Sie 10.000–30.000 Bilder mit einer typischen Beleuchtungsleistung von 5 kW/cm² und einer Belichtungszeit von 30 ms. Passen Sie die Anzahl der Bilder, die Beleuchtungsleistung und die Belichtungszeit nach Bedarf an. Nach der Übernahme speichert die Software die Daten standardmäßig im nd2-Format.
8. Nach Abschluss des Experiments entsorgen Sie den Glasträger in einem zugelassenen Behälter für scharfe Abfälle (z. B. zerbrochenes Glas oder Scharfmüllbehälter) und entsorgen alle verbleibenden Puffer gemäß den institutionellen Sicherheitsrichtlinien in den vorgesehenen chemischen Flüssigabfallbehälter.

3. Analyse von Kalibrierungs- und Spektroskopiedaten (Abbildung 1C)

1. Laden Sie den aufgenommenen Rohbildstapel der DNA-Probe in FIJI (Windows 64-Bit) mit dem Bio-Formats Plugin.
2. Subtrahieren Sie die minimale Projektion vom Stack, um einen vom Hintergrund subtrahierten Datensatz zu erhalten, und speichern Sie ihn für die spektrale Analyse. Für den geladenen RAW-Bildstapel wählen Sie Bild > Stacks > Z-Projekt und wählen Sie Min-Intensität im Projektionstyp. Dann wähle "Process > Image Calculator , um die minimale Projektion vom RAW-Bildstapel abzuziehen und als TIFF zu speichern.
3. Führen Sie die Lokalisierungsidentifikation auf dem Null-Ordnung-RAW-Bildstapel mit dem ThunderSTORM-Plugin (Version 1.3) durch. Verwenden Sie geeignete Parameter (z. B. Schwellenwert = 1,2 x std (Welle.F1), Sigma = 1,5, Passradius = 3), um das Bild der nullten Ordnung zu rekonstruieren und die Koordinaten des Emissionsereignisses (Einheiten: nm) zu extrahieren. Für den zugeschnittenen Null-Ordnung-Rohbildstack wählen Sie Plugin > ThunderSTORM > Analyse ausführen.
4. Verwenden Sie FIJI und die Open-Source-Software RainbowSTORM (GitHub-Link in³², mit MATLAB-Version neuer als 2020b), um die Kalibrierungsdaten zu verarbeiten und so die Beziehung zwischen horizontalen und vertikalen Verschiebungen sowie den Wellenlängen^31,32 zu erhalten.
   1. Führen Sie die Lokalisierungsidentifikation auf den Kalibrierungsbildern der 5 Wellenlängen mit dem ThunderSTORM-Plugin durch. Verwenden Sie geeignete Parameter (z. B. Schwelle = 5 x std (Welle.F1), Sigma = 1,5, Passradius = 3), um die Lokalisierungen der Nanolöcher in der nullten Ordnung und deren entsprechende spektrale Lokalisierungen in der ersten Ordnung zu rekonstruieren.
   2. Stellen Sie den Schwellenwert an (z. B. im Bereich von 5-10 x std (Welle.F1)), bis es für jedes Kalibrierungsbild 80 Lokalisierungen gibt.
   3. Führen Sie den RainbowSTORM aus, klicken Sie auf Spektralkalibrierung > Durchsuchen und laden Sie die CSV-Dateien für jede Kalibrierungswellenlänge (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm, 750 nm) aus dem vorherigen Schritt. Klicken Sie auf Kalibrierungsdatei speichern.
5. Wandeln Sie die nanometerbasierten Koordinaten in Pixelkoordinaten um und bilden Sie sie auf das entsprechende spektrale Fenster ab, basierend auf den horizontalen und vertikalen Verschiebungen von der nullten Ordnung zur ersten Ordnung, wie sie in der Kalibrierung bestimmt sind (Abbildung 4), um das gesamte Spektrum der DNA-intrinsischen Fluoreszenz zu messen.
   1. Verwenden Sie angepasste Python-Skripte³⁴ (Version 3.11.7), um die Vollspektrumdaten mit den folgenden Schritten zu extrahieren.
   2. Setze korrekte Dateipfade für den hintergrundsubtrahierten Bildstack (.tiff) aus Schritt 3.2, die Lokalisierungs-CSV-Datei (.csv) aus Schritt 3.3 und die Kalibrierungsdatei aus Schritt 3.4 (.mat).
   3. Verwenden Sie 900–950 Pixel als horizontale Verschiebung für die mit dem 3D-DWP erfassten 488-nm-Daten, was einem Spektralfenster von 484–588 nm entspricht, etwas breiter als der 500–550 nm-Filterbereich, um die Abdeckung zu gewährleisten.
   4. Verwenden Sie 925–984 Pixel als horizontale Verschiebung für die mit dem 3D-DWP erfassten 532-nm-Daten, entsprechend einem 525–750 nm-Spektralfenster, das wiederum als breiter als der 590–650-nm-Filterbereich gewählt wurde.
   5. Verwenden Sie 23 Pixel als vertikale Verschiebung für sowohl die 488 nm als auch die 532 nm Daten mit dem 3D DWP.
      Die oben genannten Werte wurden aus der mit RainbowSTORM gewonnenen spektralen Kalibrierungskurve abgeleitet. Die Python-Skripte für die Vollspektrummessung sind in³⁴ zu finden.
6. Linearisieren Sie das nichtlineare Spektrum für die nachfolgende Analyse (Vergleich, Klassifikation usw.) mit einer 3^. Ordnung Polynom-Fitting (Abbildung 3).

Ergebnisse

Der gesamte Prozess – von der Probenvorbereitung bis zur Datenerhebung und -analyse – für einen Bildstapel einer DNA-Probe dauert etwa 120 Minuten, vorausgesetzt, die DNA-Gelbildung benötigt 1 Stunde (Abbildung 1). Die kombinierte Zeit für das Auftauen, die Gelbildung und die spektrale Kalibrierung beträgt etwa 90 Minuten, unabhängig von der Anzahl der Bilder oder Proben im Experiment. Um die Effizienz zu maximieren, empfehlen wir, mehrere Bildstacks über mehrere Proben in einer einzigen Sitzung zu sammeln.

Repräsentative Echtzeitbilder, die nach dem DWP gewonnen wurden, sind in Abbildung 1B und Abbildung 3A dargestellt, wobei Fluoreszenzsignale in die nullte Ordnung (links, mit räumlichen Informationen) und die erste Ordnung (rechts, mit spektralen Informationen) aufgeteilt werden. In Abbildung 1B wurden die Bilder mit der 2D-DWP-Konfiguration aufgenommen, bei der der Abstand zwischen Null- und Erstordnungsbildern relativ gering ist. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 3A Daten, die mit dem 3D-DWP gesammelt wurden, wobei die beiden Beugungsordnungen aufgrund des für die Doppeldecker-3D-Bildgebung erforderlichen technischen Pfadunterschied weiter voneinander entfernt sind. Alle in Abbildung 1C, Abbildung 3 und Abbildung 4 dargestellten Daten wurden mit der 3D-DWP-Konfiguration erhoben. Die Wahl zwischen 2D- und 3D-Bildgebung hängt vom experimentellen Ziel ab: Für intrinsische Fluoreszenzspektralmessungen synthetisierter DNA-Proben wird das 2D-DWP im Allgemeinen bevorzugt, da diese Proben keine relevanten dreidimensionalen strukturellen Merkmale besitzen, obwohl die 3D-DWP-Konfiguration auch verwendet werden kann, wenn axiale Informationen benötigt werden.

Zusammen demonstrieren diese repräsentativen Ergebnisse die Kernfähigkeit der DWP-basierten Bildgebungsplattform, räumliche Lokalisierungs- und Emissionsspektren einzelner DNA-Moleküle gleichzeitig in Echtzeit aufzulösen. Die korrekte Systemleistung wird durch die klare und stabile Trennung zwischen dem Null-Ordnungs-Raumbild und dem spektral dispergierten Bild erster Ordnung angezeigt, wobei jede einzelne Molekül-Lokalisierung in der nullten Ordnung einer eigenen spektralen Spur in der ersten Ordnung entspricht. Die quantitative spektrale Analyse erfolgt durch die Identifizierung isolierter Einzelmolekülereignisse im Bild der nullten Ordnung, die Messung der relativen Pixelverschiebung des zugehörigen Erstordnungssignals und die Umwandlung dieser Verschiebung in Wellenlänge mittels einer kalibrierten Kartierungsfunktion. Da die Beziehung zwischen Pixelverschiebung und Emissionswellenlänge nichtlinear ist, wird eine Polynomanpassung dritter Ordnung angewandt, um lineare Emissionsspektren aus Rohdaten²⁸ genau zu rekonstruieren. Die resultierenden Einzelmolekülspektren können weiter in computergestützte Analysepipelines integriert werden, einschließlich maschinellem Lernen oder Deep-Learning-Modellen, um die spektrale Klassifikation und Schlussfolgerung der DNA-Sequenzzusammensetzung oder der Molekülstruktur basierend auf intrinsischen Fluoreszenzsignaturen unter verschiedenen Beleuchtungsbedingungen und photophysikalischen Zuständen zu ermöglichen.

Alle in diesem Protokoll gezeigten Daten wurden mit dem β-mercaptoethanolbasierten Bildpuffer³⁵ erhoben. Grundsätzlich sollte jeder bildgebende Puffer, der das photoschaltende Verhalten des Fluorophors verbessert, mit diesem Ansatz kompatibel sein, z. B. DABCO-basierter Bildgebungspuffer³⁶. Die getesteten DNA-Moleküle umfassen 20-Basen-Einzelstränge A, G, C, T; 40-Sockel-einsträngige Wechselstromkette (A₁C₁, A₅C₅, A₁₀C₁₀, A₂₀C₂₀); einsträngige Guanine mit 5, 8, 12, 16 Basen; 20-Basen-Paare doppelsträngige GC und AT (siehe Materialtabelle für detaillierte Informationen). Die Auswahl der 20- und 40-Basen-DNA-Konstrukte basiert auf der Beobachtung, dass eine 40-Basen-DNA-Kette eine kompakte Konformation mit einer effektiven Größe von weniger als 40 x 3,4 = 13,6 nm annimmt, was sie unter die Auflösungsgrenze des rekonstruierten SMLM-Bildes legt. Die Anregungswellenlängen (488 nm und 532 nm) wurden nicht eindeutig für bestimmte Sequenzen optimiert, sondern vielmehr ausgewählt, um zu zeigen, dass intrinsische DNA-Fluoreszenz robust über verschiedene Basenzusammensetzungen und Konformationszustände mit beiden Wellenlängen nachgewiesen werden kann. Wir testeten den Bildpuffer, wie in ergänzender Abbildung 1 gezeigt, und stellten fest, dass fast keine stochastische Blinzelsignale erkannt wurden, wodurch Pufferkomponenten und Glasoberflächenbehandlungen ausgeschlossen wurden. Nur das DNA-Gel + Bildgebungspuffer zeigte eine signifikante Anzahl von Blinzeln. Die Glasfolien und Deckfolien waren sauber und sorgfältig gehandhabt, während das Probegel in einer geschlossenen Umgebung geformt wurde. Daher kommen die detektierten Signale wahrscheinlich nicht von Verunreinigungen oder der Autofluoreszenz des Substrats. Wir haben auch das Signal sowohl vom Trocknungsgel als auch von der DNA-Lösung gemessen und festgestellt, dass es keinen signifikanten Unterschied gab, sodass photochemische Artefakte während des Trocknens nicht die Hauptquelle der Signale sind. Photodegradationsprodukte weisen in der Regel weite Spektren auf und besitzen keine Blinkeigenschaften, die in unserer Studie nie beobachtet wurden. Die quantitativen Detektionsgrenzen, die sich in der minimalen Photonenzahl der Lokalisierungen widerspiegeln, liegen bei 30 - 50 [Photonenanzahl]. Dieser Wert bleibt für DNA-Proben und markierte Systeme, wie zum Beispiel AF647-markierte H3K9me3 in fixierten Zellen, gleich. Die durchschnittliche Lokalisationsgenauigkeit der DNA-Intrinsizenz beträgt etwa 15 bis 25 nm, während die AF647 etwa 10 bis 15 nm beträgt.

Im 2D-Szenario hat das rekonstruierte SMLM-Bild eine Pixelgröße von 22 nm. Die Genauigkeit der Lokalisierungen stochastischer Emissionen beträgt durchschnittlich ~20 nm, was das Konfidenzintervall beschreibt, an dem das einzelne Molekül lokalisiert ist. Die auf intrinsische Fluoreszenz getesteten Proben besitzen jedoch keine biologischen Strukturen, sodass die Auflösung der Strukturen nicht interpretiert werden kann. Die kohärente Raman-Streumikroskopie soll eine Auflösung von 250 - 300 nm³⁷ haben, und das UV-Zweiphoton eine Auflösung von 300 nm³⁸. Das Signal-Rausch-Verhältnis der kohärenten Raman-Streubildgebung liegt bei der Größe 10 - 100³⁹, während es bei der UV-2-Photonenmikroskopie ^40,41 als Signal-zu-beider-Standardabweichung (SSDR) 2 - 20 (oft als Signal-zu-beider-Standardabweichung ausgedrückt, SSDR) beträgt. Der SNR für DNA-intrinsische Fluoreszenz mit sSMLM liegt bei etwa 5, bedingt durch die niedrige Photonenzahl und die durch Kamera-Detektionsrauschen verursachten Einschränkungen.

Abbildung 1: Arbeitsablauf mit geschätzten Dauern. (A) Die Probenvorbereitung beinhaltet das Auftauen des Stocks, die Vorbereitung des DNA-Gels und das Hinzufügen von Bildpuffer. Die Gesamtzeit variiert je nach Probe und Umgebung zwischen 1 und 3 Stunden. (B) Jede Aufnahme erfordert einen Kalibrierungsprozess mit einer speziell entwickelten Nanoloch-Array-Probe. Die gesamte Kalibrierungszeit beträgt etwa 20 Minuten, die Datenerfassungszeit für einen Bildstack etwa 10 Minuten, einschließlich Sample-Suche (10.000 Bilder und 50 ms Belichtungszeit). (C) Die Analysepipeline beinhaltet FIJI-Vorverarbeitung und Spektralanalyse in Python. Die Vorverarbeitung in FIJI dauert etwa 10 Minuten, während die spektrale Analyse mit den etablierten Codes schnell ist. Die präsentierten Spektren wurden von 16-Basen-Guanin gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Optischer Schaltplan. Die vier Laserlinien (405 nm, 488 nm, 532 nm, 647 nm) werden per Laserausrichtung zum Invertiertenmikroskop geleitet, wodurch das System stabil und einfach zu bedienen ist. Das DWP wird direkt vor der sCMOS-Kamera platziert, was eine spektroskopische Detektion von Einzelmolekülen ermöglicht. Beim Kalibrieren für das DWP wird ein Filterrad zwischen Kamera und DWP eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Spektralkalibrierung. Die verwendeten Kalibrierungswellenlängen sind 532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm und 750 nm. Durch sequentielles Platzieren von schmalen Bandbreitenfiltern mit diesen zentralen Wellenlängen nach dem DWP und vor der Kamera können die entsprechenden horizontalen und vertikalen Verschiebungen verschiedener Wellenlängen gemessen werden, was die Abbildung einer Kalibrierungskurve zwischen Pixelposition und Wellenlänge ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Spektren ausgewählter doppelsträngiger und einzelsträngiger DNA-Moleküle unter Anregung von 532 nm bzw. 488 nm. (A - B) Die nichtlinearen und linearen Spektren von GC_alter, die sich auf eine Art doppelsträngiges DNA-Molekül beziehen, wobei beide Stränge 20-Base 5'-GCGCGCCGCGCGCGCGCGCGCG-3' sind. Das hervorgehobene grüne Spektrum zeigt die durchschnittliche Kurve. (C - D) Die nichtlinearen und linearen Spektren von A₁₀C₁₀, das sich auf eine Art einzelsträngiges DNA-Molekül mit 40 Basen und wiederholten 10 Adenin und 10 Cytosinen bezieht (5' – AAAAAAAAAAACCCCCCCCCACAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCC-3'). Das hervorgehobene blaue Spektrum zeigt die durchschnittliche Kurve. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Kontrollexperimente für intrinsische DNA-Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Hier präsentieren wir erstmals ein Protokoll zur Erfassung des gesamten Spektrums der DNA-intrinsischen Fluoreszenz sowohl von einsträngigen als auch von doppelsträngigen DNA-Molekülen, das den Arbeitsablauf von der Probenvorbereitung bis zur Datenerhebung und computergestützten Analyse abdeckt. Dieses Protokoll ermöglicht eine labelfreie Superauflösungsbildgebung von DNA-Molekülen, indem intrinsische Fluoreszenz statt exogener Sonden genutzt werden. Prinzipiell könnte dieser Ansatz auf fixierte Zellen und potenziell auf Live-Cell-Bildgebung ausgeweitet werden, da er chemische Markierung und antikörperbasierte Amplifikation vermeidet. Chromatin im Kern umfasst DNA, RNA und verschiedene Arten von Proteinen, was ein viel komplexeres System ist als das DNA-Gel. Derzeit sind aufgrund niedriger Photonenzahlen von DNA-Molekülen stochastische Emissionen aus dem Inneren des Zellkerns in fixierten/lebenden Zellen eine Herausforderung. Für die isolierten Chromosomen oder den Kern wurde jedoch das DNA-intrinsische Fluoreszenzsignal^berichtet: 16,24,27. In seiner heutigen Form ist das Protokoll jedoch auf in vitro-Umgebungen beschränkt, in denen synthetisierte DNA-Proben verwendet werden. Im Vergleich dazu erfordert die Markierung von Kern-DNA oder Chromatin mittels Immunfärbung typischerweise langwierige mehrstufige Verfahren – einschließlich Abschrecken, Blockieren sowie primäre und sekundäre Antikörperinkubationen –, die mehrere Stunden dauern können (oft ~5 Stunden pro ^{Ziel), was} sowohl experimentelle Komplexität als auch potenzielle Störungen der nativen Chromatinstruktur mit sich bringt. Durch das Eliminieren exogener Labels verkürzt intrinsische fluoreszenzbasierte Bildgebung nicht nur die Probenvorbereitungszeit erheblich, sondern vermeidet auch strukturelle Störungen und Verknüpfungsfehler, die mit sperrigen fluoreszierenden Sonden und Antikörpern verbunden sind, wodurch eine genauere nanoskalige DNA-Lokalisierung ermöglicht wird.

Trotz seiner labelfreien Natur und konzeptuellen Einfachheit erfordert die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls sorgfältige Aufmerksamkeit für mehrere kritische experimentelle Details. Beispielsweise verringert während der Probenvorbereitung unzureichende Zeit für die DNA-Gelbildung die Anzahl der nachweisbaren Einzelmoleküllokalisierungen im Vergleich zu vollständig gebildeten Gelen. Normalerweise dauert es etwa 1,5 Stunden, bis sich das Gel bildet. Wenn die Lösung noch nicht vollständig getrocknet ist, warte einfach noch ein bisschen. Für einen 22 x 22 mm großen Deckungsschieber reichen 5 μL Bildpuffer aus, während ein größeres Puffervolumen Leckage verursachen kann, was die Öl-Eintauch-Oberfläche des Objektivs stören und die Bildgebungsleistung negativ beeinflussen kann. Wenn ein Austritt auftritt, kann es vorsichtig mit einem Labortuch entfernt werden. Während des Fokussierens heben Sie das Ziel schrittweise von der niedrigsten z-Position an. Nachdem das Objektiv das Immersionsöl aktiviert hat, verwendet man den Feinjustierungsmodus, um die Brennebene mit häufigen stochastischen Einzelmolekülemissionen zu identifizieren. Wenn große Gelcluster aggregierte Signale mit überlappenden Spektren erster Ordnung erzeugen, wählen Sie ein alternatives Bildgebungsgebiet aus.

Trotz seiner Vorteile hat dieses Protokoll mehrere wichtige Einschränkungen, die bei der Bewertung seiner Anwendbarkeit und Leistung berücksichtigt werden sollten. Erstens beruht die genaue spektrale Extraktion auf einer ausreichenden räumlichen Trennung zwischen einzelnen Einzelmolekülereignissen; hohe Lokalisierungsdichten, wie sie durch große DNA-Gelcluster oder dicht gepackte makromolekulare Assemblierungen entstehen, können zu überlappenden Spektralspuren erster Ordnung führen, die eine zuverlässige Spektrumrekonstruktion erschweren oder ausschließen. Zweitens ist die Methode empfindlich gegenüber optischer Ausrichtung und Fokusstabilität, da kleine Fehlausrichtungen des Doppelkeilprisms oder Abweichungen von der optimalen Brennweite systematische Fehler bei der Wellenlängenkalibrierung verursachen und das Signal-Rausch-Verhältnis verringern können. Drittens implementiert das Protokoll derzeit kein spektrales Demixing, was seine Verwendung in Proben mit hoher Molekulardichte oder mehreren spektral überlappenden Spezies einschränkt. Zusammen definieren diese Faktoren das praktische Funktionsregime der Methode und sollten sorgfältig berücksichtigt werden, wenn das Protokoll auf komplexere oder überfülltere biologische Systeme ausgeweitet wird.

In diesem Protokoll wird RainbowSTORM ausschließlich für spektrale Kalibrierung verwendet, obwohl die Software auch leistungsstarke Werkzeuge für 2D/3D-Kalibrierung, sSMLM-Datenanalyse und Bildrekonstruktion bereitstellt. Solche Analysewerkzeuge eignen sich hervorragend, um räumliche Lokalisierungsinformationen mit spektralen Auslesungen in spektroskopischer Superauflösungsbildgebung zu verknüpfen und könnten in zukünftigen Erweiterungen dieses Protokolls weiter genutzt werden. Schließlich ist dieses Protokoll potenziell für andere Arten biologischer Makromoleküle^wie RNA, Tubulin usw. machbar. Das detektierte Spektrum kann weiter in rechnergestützte Modelle wie Deep-Learning-Modelle⁴⁶ eingespeist werden, um Klassifikationen durchzuführen und so Sequenz- oder Molekularstrukturen aus intrinsischen Spektren unter unterschiedlicher Beleuchtung sowie photophysikalischen Eigenschaften vorherzusagen. Diese Studie ebnet auch den Weg für labelfreie, molekularspezifische Chromatinbildgebung, die externe Markierung oder Denaturierung nativer Strukturen vermeidet.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
488-nm-Emissionsfilter für Bildgebung	Chroma Technology Corp.	ET525/50M
532 nm Bandpassfilter zur Kalibrierung	Thorlabs	FL532-3
532-nm-Emissionsfilter für Bildgebung	Chroma Technology Corp.	ET620/60M
580-nm-Bandpassfilter zur Kalibrierung	Thorlabs	FB580-10
633 nm Bandpassfilter zur Kalibrierung	Thorlabs	FL632.8-3
680-nm-Bandpassfilter zur Kalibrierung	Thorlabs	FB680-10
750-nm-Bandpassfilter zur Kalibrierung	Thorlabs	FB750-10
Beta-Mercapptoethanol	Sigma	M6250
BME-Bildpuffer	NA	NA	7 & mu; L GLOX, 7 & mu; L Beta-Mercapttoethanol und 690 μ L-Glukosepuffer
Catalase aus Rinderleber	Sigma	C100
DABCO (1,4-di-azobicyclo-(2.2.2.)-Oktan)	Sigma	D27802
DABCO-Bildpuffer	NA	NA	65 mM DABCO + 30 mM Natriumsulfit + 30 mM DTT 1 M  in DNAse frei deionisiertes Wasser von RNAse. Der Natriumsulfit sollte 10 Mal in PBS gelöst werden; bis 1 M vor der Erstellung des Bildpuffers.
DNA-Deplex für spektroskopisches SMLM	IDT	NA	20-Basen-Paar doppelsträngige GC_alter, GC_conti, AT_alter und AT_conti, z. B. GC_alter beide Stränge als 5' - GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC - 3'; GC_conti hat einen Strang von 1,5 m - GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG - 3' und die andere als 5' - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3' Alle Proben entsprechen HPLC-Standard.
DNA-Oligonukleotid/doppelsträngige DNA	IDT	NA
DNA-Oligos für spektroskopisches SMLM	IDT	NA	20 Basisen A, G, C, T; 40-Basis-Wechselstromkette (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20);   Einzelsträngige 5-, 8-, 12-, 16-Basis-Guanine. z. B. A10C10 ist 5' – AAAAAAAAAACCCCC CCCCCAAAAAAAAA AACCCCCCCCCCCC – 3' Alle Proben entsprechen HPLC-Standard.
DNase/RNase-freies destilliertes Wasser	Invitrogen	10977015
DTT (DL-Dithiothreitol)	Sigma	43816
GLOX	NA	NA	14 mg Glukoseoxidase, 50 μ L-Katalase (17 mg/ml) + 200 μ L-Puffer A, der 10 mM Tris (pH 8,0) und 50 mM NaCl.  hat;
Glukosepuffer	NA	NA	50 mM Tri (pH 8,0), 50 mM NaCl und 10 % Glukose.
Glukoseoxidase	Sigma	G7141
Glukose, Pulver	Thermo Fisher	15023021
PBS (10X)	Thermo Fisher	J62036. K3
PBS (1X)	Gibco	10010023
Natriumchlorid	Thermo Fisher	424290010
Natriumsulfit	Sigma	S0505
Tris (1M) pH 8,0	Invitrogen	AM9856