Methodenartikel

Zugängliches Silikonchip-zu-Membran-Abdichtungsverfahren für flexible, zuverlässige Bindungen

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DOI:

10.3791/69980

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20. März 2026

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1Department of Pathology and Medical Biology, EXPIRE Lab, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 2GRIAC Research Institute, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Department of Biomaterials and Biomedical Technology, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Tissue Engineering and Cells Therapy Group (GITTC), School of Medicine, University of Antioquia, Alma Mater Hospital of Antioquia, 5Department of Pulmonary Diseases, University Medical Center Groningen, University of Groningen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein neuartiges Dichtungsprotokoll zur Herstellung wasserdichter, silikonbasierter Dichtungen für Membranen von Polydimethylsiloxan-(PDMS)-Chip-Bauelementen. Vorgesehen für Labore zur Einrichtung von Chipmodellen und der Entwicklung von Chip-Plattformen im kleinen Maßstab. Wir demonstrieren das Protokoll mit Kunststoff- und nativen Gewebemembranen. Dieses Verfahren erfordert nur PDMS, Toluol, Schimmel, Membran und eine Vakuumkammer.

Zusammenfassung

Organ-on-Chip-Plattformen sind ein schnell wachsender Aspekt der biomedizinischen Forschung. Die Erweiterung dieses Fachgebiets hat eine Vielzahl unterschiedlicher Materialien und Methoden für deren Bau und Anwendung hervorgebracht. Während die Anzahl der verschiedenen Geräte – entweder kommerziell angeboten oder in der Wissenschaft entwickelt – weiter wächst, bleibt für neue Forscher, die in das Organ-on-Chip-Feld einsteigen, meist noch ein großer Schritt zu unternehmen. Eines der zentralen Themen sowohl in neuartigen als auch in aktuellen Chiptechnologien ist die Schaffung einer sicheren und undichten Abdichtung von Chip-Geräten. In diesem Artikel zeigen wir einen neuen Weg zur Chipentwicklung, indem wir einen Chip-Abdichtungsworkflow präsentieren, der zuverlässige wasserdichte Verbindungen zwischen Silikonchips und drei Kulturmembranen verschiedener Materialien erzeugt. Das vorgestellte Verfahren ist für die Entwicklung neuer Chips mit begrenzten Eingabematerialien verfügbar und bietet eine Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) Organ-on-Chip. Diese Chips sind für Zellkulturen gedacht, die durch eine poröse Membran gespeist und apikal der Luft ausgesetzt sind, wie etwa in einem Darm-, Haut- oder, wie im hier dargestellten Fall, Airway-on-Chip. Wir bieten zwei verschiedene 3D-Designs von Chipformen an, die ihre Bindung an kommerziell erhältliche Kunststoffmembranen sowie an porcine extrazelluläre Matrix (ECM)-Gerüste zeigen. Dieser Airway-on-Chip kann intern produziert werden; die verschiedenen Hürden, denen man begegnen kann, wird hier vorgestellt und zeigt ihre frühere Nutzung als Airway-on-Chip. Dieses neue Versiegelungsverfahren beinhaltet das Vakuumieren von toluolverdünntem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Mörtel, um das Toluol zu entfernen, das zu einer dünnen und starken Silikonschicht führt, die in die poröse Kunststoff- oder native ECM-Membranoberfläche eingebettet ist. Die zweite Neuheit dieses Verfahrens ist das Aushärten des PDMS-Mörtels bei Raumtemperatur, um eine Störung der Membranen durch unterschiedliche thermische Ausdehnung der zusammengeschlossenen Materialien zu verhindern. Dies führt zu einer breit anwendbaren Technik zur Bindung der getesteten Materialien, wodurch mehrkammerige PDMS-Chips mit internalisierten Kulturmembranen entstehen.

Einleitung

Organ-on-Chip-Geräte werden zu einem Grundpfeiler der biomedizinischen Forschung, wobei eine Vielzahl kommerzieller und Open-Access-Modelle in Laboren auf derganzen Welt entwickelt wird. Da diese Modelle zu einem zentralen Forschungsbestandteil werden und weiterhin traditionelle statische Kunststoff- und Tiermodelle 2,3 ersetzen, ist es immer wichtiger, dass diese Modelle weltweit leicht zugänglich und für Forscher unterschiedlicher Herkunft zugänglich sind. Zentral hierbei ist die Zugänglichkeit einer maßgeschneiderten, kleinen Serienentwicklung, unabhängig von Input- und Herstellungskosten4, insbesondere in nicht-kommerziellen oder akademischen Modellen1.

Eine der größten Herausforderungen bei On-Chip-Technologien ist es, eine sichere Abdichtung der Chips ohne Lecks während des Flusses zu gewährleisten. Eine aktuelle Übersicht über Lecktests in Chip-Bauteilen identifizierte Lecks zwischen den Kammern oder zur Umwelt als Top-Modus für Modell- und experimentelle Versagen, sowohl in der Industrie als auch in der Wissenschaft 5,6. Es gibt mehrere Gründe für das Scheitern, eine erfolgreiche Abdichtung zu erreichen: die kleinen Abmessungen der Geräte, der Durchfluss und der angelegte Druck sowie vor allem die Tatsache, dass diese Geräte aus verschiedenen Materialien bestehen, die in Schichten zusammengedichtet und mit unterschiedlichen Prozessen überbrückt werden6. Die Bandbreite der verschiedenen Materialien, die als Kulturmembranen in Chipplattformen verwendet werden, ist so breit wie die Bandbreite ihrer Anwendungsbereiche, darunter Polyethylenterephthalat (PET), Polycarbonat (PC), PDMS undECM-Membranen 1. Daher gibt es zahlreiche verschiedene Verfahren und Methoden, um diese verschiedenen Materialien in die fertigen Geräte einzubinden. Zu diesen Verfahren gehören die Kompression mit Klebstoff/PDMS, plasmavermittelte Silanchemie, chemische Funktionalisierung von Strukturen, Elektrospinning und verdampfte Lösungsmittelbindungen, abhängig von den im Modell7 verwendeten Materialien. Die Tatsache, dass diese Prozesse unterschiedliche Fähigkeiten und Laborumgebungen erfordern, setzt einige Grenzen für die akademische Zugänglichkeit von On-Chip-Forschung. Es wurde festgestellt, dass zwar die Kosten und Einschränkungen für kommerzielle Systeme den akademischen Zugang einschränken, die langwierigen, mehrstufigen Prozesse zur Herstellung von Chips und der benötigten Ausrüstung jedoch deren unabhängige akademische Entwicklungeinschränken. An der Spitze dieser Forschung liegt eines der aktuellen Probleme in der Standardisierung und Validierung von Modellen für ihre Reproduzierbarkeit10,11. Aber es bleibt eine Lücke bei diesem Punkt für viele Labore, die mit der Chipentwicklung beginnen wollen, um spezifische Forschungsfragen zu beantworten, Tierarbeit zu ersetzen und in biologisch relevanteren Modellen12 zu arbeiten.

In diesem Artikel stellen wir einen Chip-Sealing-Workflow vor, der ausschließlich die Fähigkeiten und Ausrüstung erfordert, die den meisten Forschungsumgebungen zur Verfügung stehen. Dieses Verfahren erzeugt wasserdichte PDMS-Chip-Membran-Schnittstellen für drei verschiedene Membranmaterialien. Der Prozess erfordert nur begrenzte aktive Arbeitszeit, kann auch in nicht-chipbasierten Laborumgebungen eingesetzt werden und kann von kleiner bis mittelgroßer Chipproduktion skaliert werden.

Das vorgestellte Versiegelungsverfahren kann mit porösen Kunststoff- oder ECM-Membranen durchgeführt werden; Die bereitgestellten Beispielchips sind mit diesem Verfahren für die Anwendung als Airway-on-Chip-Gerät mit Luftexposition gebaut. Dieses Verfahren kann für andere vergleichbare Geräte verwendet werden, vorausgesetzt, die Membranen enthalten Poren, die für den Eingriff unerlässlich sind. Die Hauptanwendung der bereitgestellten Chips ist die ALI-Kultur und Atemwegepithelzellen, kann aber auch für andere Anwendungen und Kokulturmodelle mit mesenchymalen Zellen oder Darmzellen verwendet werden, zum Beispiel 8,13. Der erste bereitgestellte Chip ist ein Standard-Airway-on-Chip mit einer großflächigen Kulturfläche (92 mm²) und zwei Kulturkammern, einschließlich einer apikalen Kammer für die Luftexposition, die durch eine poröse Membran von der Basalkammer getrennt ist, die Medium und optional einen weiteren untergetauchten kultivierten Zelltyp (z. B. Fibroblasten, Endothelzellen) enthält. Für ALI-Anwendungen ist es unerlässlich, dass die apikal gesaateten Zellen in der Lage sind, eine dichte Barriere aufrechtzuerhalten, um das Auslaufen von Medien in den oberen Kanal zu verhindern. Der zweite Chip hat dasselbe Design wie der erste, mit zwei zusätzlichen Kammern auf jeder Seite der Membran, hier unter Verwendung von Schweine-ECM, um die Dehnung der Kulturmembran durch Anwendung von Unterdruck zu erleichtern, wodurch die Dehnung eines natürlichen Atemwegs nachgeahmt.

Unser Versiegelungsprozess vereint mehrere Elemente aus dem Bereich der PDMS-Chipentwicklung mit neuartigen Bedingungen, die zweifach sind. Erstens fördert die schnelle Anwendung von Vakuum auf den toluolverdünnten PDMS-Mörtel, der einen chemischen Angriff des Toluols auf die Membranen verhindert, das Eindringen von Silikon in die Poren oder Oberflächenmerkmale der Membran und führt zu einer dünnen, verdrängungsbeständigen Oberfläche. Toluol führt zu Aufwellungen und Verformungen an festen PDMS-Oberflächen, wirkt jedoch bei hohen Konzentrationen als Lösungsmittel, weshalb es in diesem Verfahren zur Verdünnung von flüssigem PDMS verwendet wird. Bei Kunststoffen wie den hier verwendeten PC- und PET-Membranen verursacht das Toluol Verformungen und Spannungsrisse, wenn es nicht schnell entfernt wird. Es ist unerlässlich, beim manuellen Auftragen des Mörtels darauf zu achten, dass er nur über die Wand des vorgefertigten Chip-Half aufträgt und niemals etwas im Kulturbereich bekommt, da dies die Poren der Kulturmembranen blockiert und PDMS-Bereiche erzeugen, die Störungen und Variationen der Zellkulturfähigkeit verursachen. Zweitens verhindert das Aushärten des PDMS-Mörtels bei Raumtemperatur (RT) über 72 Stunden die Verschiebung der Membran sowohl von der Chip-Hälfte als auch vom Mörtel, was auftreten kann, wenn die Materialien nach der thermischen Ausdehnung unterschiedlich stark schrumpfen.

Wir bieten zwei Chipform-Designs an, die mit einem 3D-Drucker oder Mikrofräser hergestellt werden können (wie in der Supplementary File 1, Supplementary File 2 beschrieben), sowie die Methode zur Herstellung eines dünnen Mörtels aus PDMS und Toluol14. Mit dieser Methode kann kommerzielle Kunststoffmembranen (PET, PC) innerhalb eines Geräts versiegelt werden. Zusätzlich testeten wir den Anwendungsbereich dieses Verfahrens, indem wir denselben Chip mit einer porcinen nativen ECM-Membran erzeugten, um einen biologischen Chip mit zyklischer Dehnung zu erzeugen. Da Organ-on-Chips darauf ausgelegt sind, die physiologischen Eigenschaften der in vivo-Umgebung zu replizieren, sind Airway-on-Chips, die in der Lage sind, die mechanischen Kräfte des Körpers während der Atmung zu erzeugen, wie die Scherspannungen durch Luftströmung und die mechanische Landschaft der sich verengenden Atemwege, biologisch sehr relevant16. Die verwendete Membran besteht aus der Basalmembran, Lamina propria sowie Kollagen, Laminin und anderen umgebenden Matrixproteinen. Soweit wir wissen, ist dies der erste native basalmembranbasierte Chip und der erste mit der Möglichkeit der Dehnung, wodurch die mechanische Belastung von z. B. Atmung auf einer nicht-silikonbasiertenECM-Membran 15 nachgeahmt werden kann. Diese neuartige Anwendung hebt die Funktion unseres Dichtungsverfahrens mit Kunststoff und ECM hervor. Abschließend präsentieren wir die Anwendung dieses Chip- und Membranversiegelungsverfahrens als Airway-on-Chip, das für ALI-Zellkultur8 verwendet werden kann.

Protokoll

Diese Studie war gemäß dem Experiment on Animals Act von der Genehmigung durch das Ethikgremium ausgenommen, da die Materialien post-mortem bezogen wurden und keine Tiere für wissenschaftliche Zwecke geopfert wurden (Wet op de dierproeven). Das Isolationsprotokoll der primären menschlichen Atemwegsepithelzellen entsprach dem Forschungscode des Universitätsmedizinischen Zentrums Groningen (https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg abgerufen am 14. Januar 2025) sowie den nationalen und ethischen Fachleitlinien zur Verwendung menschlichen Körpermaterials (https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf abgerufen am 14. Januar 2025). Diese Studie war von der Genehmigung des Ethikausschusses ausgenommen, da das Tracheobronchialgewebe von Transplantationen übrig geblieben und gemäß dem niederländischen Zivilgesetzbuch und dem Wet op de orgaandonatie (Spendergesetz) vollständig anonymisiert wurde.

1. Chip-Half und Membranvorbereitung

  1. Chipproduktion
    1. Download . STL-Designdateien für die obere und untere Hälfte des Chips aus Supplementary File 1 und Supplementary File 2 dieses Papers. Die obere Form erzeugt eine 5 mm tiefe Spanhälfte, die untere Form eine 3 mm tiefe Spanhälfte; Beide Spänhälften haben 1 mm tiefe Kulturkammern. Alternativ kann man mit geeigneter CAD-Software ein Chipdesign erstellen.
    2. Bereiten Sie entweder eine Slice-Datei für den 3D-Druck oder einen Fräsweg zum Mikrofräsen der Chipformen vor. Mikrogefräste Formen werden einsatzbereit sein; Harzbedruckte Formen benötigen zwei 24-Stunden-Waschen mit 99,9 % Ethanol, bevor UV-Vernetzung durchgeführt wird, um sie angemessen für die Verwendung als PDMS-Form vorzubereiten.
  2. PDMS-Chip-Halbproduktion (Abbildung 1)
    1. Mische die flüssige PDMS-Basis gründlich mit dem Härtemittel im Verhältnis 10:1 und entfette sie in einer Vakuumkammer, bis alle Luftblasen entfernt sind.
    2. Fülle die Formen mit einer breiten Düsenspritze, entgase dich ~10 Minuten in einer Vakuumkammer, bis alle Blasen entfernt sind. Stelle die Formen in einen Trockenofen, bis sie 2 Stunden bei 65 °C ausgehärtet sind.
    3. Entfernen Sie feste Chip-Hälften aus den Formen mit einem Skalpell und schneiden Sie die Abdeckungen an den Kanten ab. Fügen Sie an jedem Ende der Kammer vier Einlässe in die obere Hälfte und die beiden angrenzenden Ringe hinzu, die mit einer Biopsie den Standort der unteren Kammereinlässe anzeigen.
      HINWEIS: Für die präsentierten Ergebnisse wurde ein 2-mm-Biopsie-Stanz verwendet, und 2-mm-Silikonschlauch wurden für den Mittel- und Luftstrom während der Kultur eingesetzt. Einlässe von 1 mm und 2 mm erleichtern das Säen der Zellen mit einer Pipette, die der Größe von 200 bzw. 1000 μm Spitzen entspricht. Andere Lochgrößen können für verschiedene Rohr- oder Pumpsysteme verwendet werden.
  3. Membranpräparation (Abbildung 2)
    1. Download . STL-Designdateien für die Membranschablone stammen aus Supplementary File 3 in diesem Artikel. Bereiten Sie die Schablone durch 3D-Druck oder eine vergleichbare Fertigungsmethode vor, um eine gleichbleibende Membranform zu gewährleisten.
    2. Legen Sie die Schablone über die PET- oder PC-Membran und halten Sie sie fest, während die Membran mit einem Skalpell in Form geschnitten wird.
      HINWEIS: An diesem Punkt können Membranen mit Matrixproteinen für die Zellkultur in einer Petrischale beschichtet werden, ohne die Membranbindung zu stören. Dies stellt sicher, dass nur die Membran für das Zellwachstum funktionalisiert ist, sodass die PDMS-Wände wiezuvor beschrieben zellfrei bleiben.

2. Membranbindung

  1. PDMS-Mörservorbereitung
    1. Mische flüssiges PDMS (Schritt 1.2.1) mit Toluol im Verhältnis 7:5 und vermische gründlich mit einer Spritze mit breiter Düse, wie zuvorbeschrieben 14. Für jeden Chip sind nur 8 Tropfen erforderlich; 1,4 ml PDMS mit 1 ml Toluol pro Mörtelcharge werden empfohlen und ausreichen für 8 Chips dieser Größenordnung. Ein gleichmäßiges Mörtelmischen ist wichtig für eine zuverlässige Membranbindung.
      VORSICHT: Toluol ist flüchtig und hochentflammbar. Eine Exposition kann Schäden am Nerven- und Atmungssystem verursachen. Verwenden Sie ausschließlich eine Abzugshaube, fern von jeglicher Zündquelle, und kontrollieren Sie Verschüttungen mit saugfähigem Material und Belüftung. Tragen Sie beim Handling Schutzbrillen zum Schutz vor Spritzern sowie undurchlässige (Nitril-)Handschuhe. Lassen Sie alle Labormaterialien (Pipettenspitzen, Behälter usw.) rund um die Uhr in der Dampfhaube, danach ist Toluol verdampft und alle Materialien können in zugelassenen, gekennzeichneten Behältern über spezialisierte Abfalldienste entsorgt werden. Entsorgen Sie niemals Toluol in einem Waschbecken. Für weitere Informationen konsultieren Sie das Sicherheitsdatenblatt (SDS).
      HINWEIS: Bereiten Sie den Mörtel am Anwendungsort vor, um vorzeitige Verdunstung von Toluol und Kunststoffkontamination zu verhindern, in einem nicht-glasbasierten Behälter, vorzugsweise Einwegbehälter, und entsorgen Sie ihn direkt nach der Verwendung. PDMS härtet die Glasoberfläche aus und ist teilweise unentfernbar; Toluol löst sich auf und beschädigt die meisten im Labor üblichen Kunststoffe.
  2. PET/PC-Membranbefestigung (Abbildung 2)
    1. Tragen Sie den Mörtel schnell auf die Oberfläche der PDMS-Chip-Hälfte auf, wo die Membran mit einer Pipettenspitze platziert wird.
      HINWEIS: Der gesamte Bereich unter der Membran muss mit Mörtel benetzt sein. Mit der Spitze sollte ein fester Halt angewendet werden, um die dünnste Schicht zu erzeugen. Die Mikroskopie zeigt Schichten zwischen 3 und 5 μm an.
    2. Halten Sie die vorbereitete Membran (Schritt 1.3) an einem Ende mit einer sauberen Pinzette, legen Sie die Spitze an der richtigen Position für den Chip auf den feuchten Mörtel und lassen Sie die Membran an ihren Platz fallen.
      HINWEIS: Lassen Sie die Membran nach diesem Punkt nicht verschieben; Nasses PDMS, das in die Kammer eintritt, erzeugt unregelmäßige, unbrauchbare Wände auf der Membran. Wenn eine Verschiebung auftritt, bedeckt Silikon den Kulturbereich, was das Zellkulturpotenzial auf beiden Seiten der Membran stört, die Membran abwirft und den vorherigen Schritt wiederholt.
    3. Halten Sie die Membran vorsichtig mit der Pinzette fest und legen Sie den PDMS-Mörtel erneut auf die Membran auf, wobei Sie sich bei jedem Schlag sanft von der Kammer entfernen, um Blasen zu entfernen und die Membran zu sichern, ohne sie aus ihrer ursprünglichen Position zu bewegen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, PDMS nicht in den inneren Kulturbereich der Membran aufzutragen; Dies ist unerlässlich, da Silikon Zelladhäsion verhindert und die natürliche Oberfläche der Kulturmembran stört.
    4. Setze die Chip-Hälften mit Membranen unmittelbar nach dem Nass-Mörtel in eine Vakuumkammer und härte sie bei Raumtemperatur unter 25 mBar Vakuum für 72 Stunden aus.
      HINWEIS: Chip-Hälften mit angebrachten Membranen müssen bei Raumtemperatur ausgehärtet werden. PET/PC und PDMS erleben unterschiedliche Grade der thermischen Ausdehnung, und Wärmehärtung lässt das Silikon sich ausdehnen und dann beim Abkühlen schrumpfen, wodurch eine aufgeblähte Membran entsteht (Abbildung 3).
  3. Komplette Chipkonstruktion
    1. Membrangebundene Chip-Hälften können nun an die zweite Hälfte des Chips befestigt werden. Für die gleichmäßigsten Ergebnisse setzen Sie beide Hälften einerO2-Plasmabehandlung (320 mBar, 30 s) aus und drücken Sie sie unter leichtem Druck schnell von Hand zusammen.
      VORSICHT: Sauerstoffplasmaöfen erzeugen sauerstoffgesättigte Umgebungen, gefährliche Oxide wie Ozon und intensive UV-Strahlung. Öfen sollten in einem gut belüfteten Bereich oder einer Abzugshaube installiert werden. Das Ofenfenster sollte alle UV-Strahlung blockieren, aber eine Schutzbrille wird empfohlen. Brennbare Materialien und Metalle sollten aus dem Bereich des Sauerstoffplasmas ferngehalten werden, um eine beschleunigte Verbrennung oder die Freisetzung giftiger Dämpfe zu verhindern. Der Bezug auf das SDS-Dokument für Sauerstoffplasma ist für die Verwendung mit allen anderen Materialien als den in diesem Protokoll genannten wesentlich erforderlich.
      HINWEIS: Wenn kein Plasmaofen verfügbar ist, kann eine ähnliche Bindung mit einem Plasmastab oder durch das Aufbringen von PDMS-Mörtel auf die zweite Hälfte und das Aushärten der Hälften bei Raumtemperatur unter leichter Kompression für 72 Stundenund 13 Stunden erreicht werden. Obwohl sie im Vergleich zu einem vollwertigen O2-Plasmaofen weniger effektiv sind, können diese Optionen verwendet werden, wenn keine Öfen verfügbar sind.

Ergebnisse

Membrandichtungs-Integritätstest
Um die Integrität des versiegelten Chips zu testen, wird die Top-Kulturkammer mit Demi-Wasser mit blauem Farbstoff und der Boden mit reinem Demi-Wasser gefüllt. Die Chips werden über Nacht gelassen, um ein mögliches Austreten von blauem Farbstoff aus der oberen Kammer um die Membran in die untere Kammer zu prüfen.

Vollständig konstruierte Silikonchips, die mit unserer Methode hergestellt wurden, können längs bis zu 35° verformt werden, ohne die Membranintegrität zu beeinträchtigen, und sind nun mit flexiblem PDMS-Mörtel an der oberen Hälfte auf beiden Seiten umhüllt und mit flexiblem PDMS-Mörtel verbunden. Die Verformung von PDMS-Chips ist ein normaler Teil der Nutzung, zum Beispiel wenn die Hälften oder Chips an einer Petrischale haften.

Die Chips wurden an ein bidirektionales Spritzenpumpensystem angeschlossen, um ihre Leistung mit strömungsbedingtem Druck zu testen. Chips mit PET- und PC-Membranen können ohne Leckage zwischen den Kammern oder ohne Bruch der Chips bis zu und einschließlich 30 kPa (dem maximalen Druck, den die Pumpen liefern) betrieben werden. In früheren Studien werden die Chips standardmäßig mit 150 μL/h betrieben, was 0,7 Pa Druck auf die Kammern jedes Gerätsausübt.

Visualisierung der Membranbindung
Um das Eindringen des flüssigen PDMS-Mörtels in die 0,4 μm-Poren der Membran unter dem Mikroskop infolge der RT-Vakuumversiegelung zu visualisieren, wurde PDMS-Mörtel mit Nile Red gefärbt. Nile Red wurde ausgewählt, da es ein hydrophober Farbstoff ist und sich gut mit PDMS in seiner flüssigen Form vermischt. Die Färbe wurde hergestellt, indem 1 % Nilrot gründlich in flüssiges PDMS gemischt wurden, um unter Lichtmikroskopie eine rote Farbe zu erzeugen. Das RT-Aushärtungsverfahren wurde wie oben beschrieben wiederholt. Membranen mit gefärbtem Mörtel wurden in Paraffin eingebettet und mit einem Mikrotom durchschnitten. Membranscheiben wurden auf Glasobjektträger montiert und mit einem Lichtmikroskop abgebildet (Abbildung 4). Um die Notwendigkeit sowohl der Verdünnung von PDMS zu Mörtel mit Toluol als auch der Anwendung eines Vakuums für das Eindringen des PDMS in Membranporen zu validieren, ist ein Vergleich von Membranen mit und ohne diese Methoden in ergänzender Abbildung 3 zu sehen.

Zellviabilitätstest
In einer früheren Studie wurde die potenzielle chemische Toxizität durch den Einsatz von Toluol beim Bau der Geräte getestet. Die Chips wurden mit und ohne Toluol in einem PDMS-Mörser hergestellt, menschliche Lungenadenokarzinom-epithelale Calu-3-Zellen wurden über 2 Tage bis zur Konfluenz gezüchtet und wie zuvor beschrieben1 Tag lang in den Chips kultiviert. 8. Der Zelltod wurde durch Trypan-Blaufärbung, Entfernung aller Zellen aus dem Gerät und das Zählen toter Zellen (blau) gegen ungefärbte lebensfähige Zellen bewertet. Die Proliferation wurde bewertet, indem die Reagenzien im Chipmedium inkubiert wurden, bevor ein AlamarBlue-Test durchgeführt wurde, wobei die fluoreszierende Absorption mittels eines Plattenlesers abgelesen wurde, was die Proliferation widerspiegelt (Abbildung 5)8.

ECM-Basementmembranbefestigung
Um die allgemeine Anwendbarkeit dieses Verfahrens bei der Erzeugung einer starken und flexiblen Bindung mit verschiedenen Membranen zu demonstrieren, wurde das Protokoll mit einer vollständig extrazellulären Matrix (ECM) basierender Membran wiederholt (Abbildung 6). Basementmembranen mit ECM-Gerüsten wurden aus Schweinblasen hergestellt, wie zuvor17 beschrieben. Kurz gesagt: Schweineblasen von weiblichen Tieren im Alter von 4 bis 8 Monaten wurden in einem örtlichen Schlachthof (Kroon Vlees b.v., Groningen, Niederlande) gewonnen und innerhalb von 3 Stunden nach der Entnahme verarbeitet. Bindegewebe und Fett wurden aus der Blase entfernt, die Blase wurde von innen nach außen gedreht und die Epithelschicht stumpf dissektioniert, während das Gewebe bei Raumtemperatur in PBS gehalten wurde. ECM-Gerüste wurden für das Membrananheftungsverfahren17 dehydriert. Vorbereitete Gerüste wurden zugeschnitten und an PDMS-Chip-Hälften gebunden, wie im obigen Protokoll beschrieben. Eine neue Form wurde mit zusätzlichen Kammern für die Membrandehnung im Gerät hergestellt, um zu zeigen, dass die vakuumierten Silikonbindungen auch horizontalen mechanischen Belastungen standhalten können (Supplementary File 2).

ECM-Membranintegritätstest
Der Test der Membrandichtung wurde wie oben durchgeführt. Anschließend wurde der Dehnchip an Spritzenpumpen angeschlossen, die ein Vakuum an den Seitenkammern des Geräts zogen, um über Nacht 1 mm horizontale Dehnung auf der ECM-Membran zu erzeugen (Abbildung 7).

Differenzierung von Epithelzellen und Fibroblast-Kokultur im Standard-Airway-on-Chip mit PET-Membran
Um die Leistung des bereitgestellten Chips als Airway-on-Chip für ALI-Zellen zu validieren, wurden menschliche Lungenadenokarzinom-Epithelzellen Calu-3 (ATCC, Manassas, VA, USA) in einer früherenStudie gezüchtet und in der Luft ausgesetzt 8. Nach 10 Tagen apikaler Luftexposition können Calu-3-Epithelzellen in schleimproduzierende Zellen differenziert werden, was durch die Schleimbildung demonstriert wird, gemessen durch Alcian-Blaufärbung (Abbildung 8)8.

Um unser Verfahren für einen verlängerten leckfreien Fluss und Kokultur zu validieren, kann ein Beispiel aus einer früheren Veröffentlichung gesehen werden; Für die vollständige Zellkulturmethodik siehe diesen Artikel8. Menschliche Epithelzellen wurden 21 Tage lang in der apikalen Kulturkammer des Chips unter konstantem Luftstrom kultiviert, wobei die primären Atemwegsfibroblasten kopfüber auf der gegenüberliegenden Seite der Membran kultiviert wurden. Kurz gesagt, primäre Atemwegepithelzellen wurden durch Protease-Behandlung (0,2 mg/mL in HBSS, 2 Stunden, 37 °C), Zellabkratzen und Kryokonservierung von Zellen, die aus verbliebenem Tracheobronchialgewebe von drei gesunden Lungenspendern entfernt wurden, isoliert, von denen keine weiteren Informationen vorlagen. Humane Atemwegsfibroblasten (AFs) wurden auf ähnliche Weise aus dem Bronchialgewebe des transplantierten COPD-Lungengewebes eines einzelnen Spenders isoliert.

In Abbildung 9 ist eine Grafik des Chips zu sehen und wie die oben genannten Zellen sowohl durch als auch entlang der Kammern des Geräts erscheinen.

Kultur von Epithelzellen in Kokultivierung mit Fibroblasten auf der ECM-Membran
Das basalmembranhaltige Gerüst ermöglicht die Epithel- und mesenchymale Zellkultur. Immortalisierte humane Keratinozyten (HaCaT-Zellen) wurden mit einer Dichte von 60 x 103 Zellen/cm² auf der epithialen (inneren) Seite der Membran ausgesät, und die Lebensfähigkeit betrug 95 % nach 24 Stunden im Vergleich zu 91 % in einer Kunststoffzellkulturflasche (Abbildung 10A). Anschließend wurden normale MRC-5-Fibroblasten der menschlichen Lunge mit einer Dichte von 60 x 103 Zellen/cm² auf der stromalen (äußeren) Seite ausgesät und 14 Tage lang in Kokultur mit den HaCat-Zellen gezüchtet, um die langfristige epithelial-mesenchymale Lebensfähigkeit für Kokultivierung auf der nativen ECM-Membran zu bewerten (Abbildung 10D). Die Epithelzellen bildeten eine konfluente Monoschicht auf der Innenseite der Membran, während die Fibroblasten weniger dicht über die äußere Oberfläche der ECM-Membran verteilt waren, aber ihre charakteristische spindelartige Morphologie beibehielten (Abbildung 10C). Das 3D-Rekonstruktionsvideo ist in Supplementary File 417 zu sehen.

Die aktuelle Studie präsentierte ein verbessertes Membranversiegelungsverfahren, das eine starke PDMS-Membranverbindung erzeugt, die Störungen durch manuelles Handhaben des Chips widerstehen kann und eine Langzeitkultur unter Durchfluss mit Drücken von bis zu 0,7 Pa ermöglicht. Wir zeigten, dass diese Membranen durch Silizium gebunden sind, das durch ihre Poren in die Kulturmembranen eingedrungen ist und so kovalente Silanbindungen zwischen den beiden Chiphälften und dem vakuumierten PDMS-Mörtel ermöglicht. Außerdem induziert das vorgestellte Verfahren keine Zytotoxizität, sofern der Mörtel korrekt angewendet wird. Darüber hinaus ermöglichten die produzierten Chips langfristige epitheliale mono- und epithelial-mesenchymale Kokulturen. Obwohl dieses Verfahren nur auf poröse Membranen anwendbar ist, bleibt es ein Verfahren mit geringem Input zur Herstellung zuverlässiger und zellkulturbereiter ALI-Chips.

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Abbildung 1. Grafiken der PDMS-Chip-Halbproduktion und Membranvorbereitung. Für die Herstellung von PDMS-Chip-Hälften (Schritt 1.2) werden Chipformen mit flüssigem PDMS mit einer breiten Düsenspritze gefüllt, 4,4 ml in der oberen Form und 2,4 ml in der unteren Form. Die PDMS-Hälften werden 2 Stunden bei 65 °C ausgehärtet, danach werden an den Enden der Kammer 4 Einlässe in der oberen Spanhälfte gestanzt und die Spitzen sind in der Form angegeben. Für die Membranpräparation (Schritt 1.3) wird die gedruckte Membranschablone fest auf der Membranoberfläche befestigt. Mit einer neuen Klinge schneidet man um die Schablone herum und entfernt die Splittermembran vom umgebenden Material. Membranen können für die Zellkultur beschichtet oder direkt in Schritt 2 verwendet werden. Erstellt in BioRender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2. Membranbindungsverfahren. PDMS-Mörtel wird wie oben beschrieben unmittelbar vor der Verwendung gemischt. Mörtel wird auf die vier Ecken rund um die Kulturkammer getropft und sanft mit dem schrägen Ende einer Pipette um die Membranbindungsstelle verteilt. Ein Ende der Membran wird auf den Mörtel gelegt und dann, sobald es mit der Kulturkammer ausgerichtet ist, sanft an seinen Platz fallen lassen. Mörtel wird tropfweise erneut aufgetragen und mit großer Sorgfalt über die Ränder der Membran aufgetragen, wobei große Sorgfalt darauf geachtet wird, dass kein Silikon die Membranoberfläche im Kulturbereich berührt. Chip-half-gebundene Membranen werden sofort in eine Vakuumkammer gelegt, um Mikroblasen zu entfernen, das Eindringen von Silikon in Oberfläche und Poren sicherzustellen und Toluol zu entfernen, um einen chemischen Angriff auf die Membran zu minimieren. Erstellt in BioRender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3. Beispiele für Membranplatzierung. (A) Erfolgreiche Membranplatzierung, Aushärtung bei RT. (B) Membranbindung, die in einem Ofen ausgehärtet wird (65 °C statt bei RT), die Membran ist sichtbar, dass sie sich in die Kammer ausgedehnt hat, als das Silikon nach dem Erhitzen zusammengezogen ist. (C) Komplette Chips mit korrekter PET- und PC-Membranplatzierung. (D) Eine falsche Membranplatzierung führt dazu, dass sich das Volumen beider Seiten des Chips mit der Membranbewegung ändert, was zu variablem Durchfluss führt und Spannung auf die Zellen im Chip sowie auf die am Chip angeschlossenen Pumpen ausübt. Erstellt in BioRender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4. Lichtmikroskopbilder von aufgeschnittenen und montierten PET- und PC-Membranen. Es zeigt eine Silikoninvasion in Membranporen infolge unseres Vakuum-RT-Aushärtungsverfahrens. (A) Bilder derselben Membran ohne PDMS auf die Membran zu sehen, klare Poren sowie eine saubere Oberfläche im polarisierten Bild. (B) PDMS-Mörtel wurde mit Nile Red gefärbt, und in Magenta ist Silikon zu sehen, das erfolgreich in die Poren eingedrungen und die Oberfläche unter Vakuum dünn beschichtet hat. In weißen/magentafarbenen Formen hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5. Die Zellviabilität in den Chipgeräten wurde durch die Konstruktion mit oder ohne Toluol als Verdünnungsmittel im PDMS-Mörtel nicht verändert. Calu-3-Zellen wurden mit 6,5 × 104-Zellen pro Chip ausgesat und nach Erreichen der Konfluenz über Nacht inkubiert, bevor ein AlamarBlue-Test am Supernatant und TrypanBlue an den Zellen durchgeführt wurde. Unterschiede zwischen Gruppen (n=4), die mit und ohne Toluol hergestellt wurden, wurden durch den ungepaarten Schüler-t-Test getestet, p > 0,05 = ns (nicht signifikant)8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 6. Kellermembransplitter. (A) Die Membranintegrität ist ausgefallen, da der PDMS/Toluomörtel nicht schnell genug abgesaugt wurde; Dies hat die Matrixproteine beschädigt und die Chip-Versiegelung gestört. (B) Membran- und Chip-Abdichtungen sind erfolgreich, aber die Membran wurde in einem lockeren Zustand versiegelt. (C) Erfolgreiche Membran- und Chip-Abdichtung, der Chip ist funktional für Fluss und Dehnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 7. Zwei Bilder des ECM-Chips unter Dehnung. (A) Absplitter in Ruhe. (B) Absplitter unter 1,2 mm horizontaler Dehnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 8. Alcian Blue (Kerne in Magenta, Schleim in Blau) Färbung menschlicher Lungen-Calu-3-Epithelzellen, die nach Luftexposition im Gerät in den Chips gewachsen sind. Calu-3-Zellen wurden bis zur Konfluenz gezüchtet und 10 Tage lang unter einer kontinuierlichen Durchflussrate von 150 μL pro Stunde im Basalkompartiment kultiviert und entweder mittel- oder luftexponiert von der apikalen Seite ausgesetzt. Der Fluss wurde mit einer peristaltischen Pumpe in einem Inkubator bei 37 °C und 5 %CO2 erzeugt. Am Ende der Kultivierung wurden die Membranen entfernt und gefärbt. Queransicht der Alcian-Blue-Färbung von Calu-3-Zellen, die 10 Tage lang unter Wasser (A) und in der Luft ( B)8 gezüchtet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 9. Visualisierung primärer menschlicher Epithelzellen und Fibroblasten in ausgedehnter Kokultur innerhalb des Geräts. Atemwegsfibroblasten wurden in das Gerät eingesat und über Nacht anhaftet, bevor sie das Gerät invertierten und Epithelzellen auf der anderen Seite der Membran aussäten. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz gezüchtet, in der Luft exponiert und 21 Tage lang unter einer kontinuierlichen Durchflussrate von 150 μL/h kultiviert, die mit einer peristaltischen Pumpe in einem Inkubator bei 37 °C und 5 %CO2 erzeugt wurde. Die Membranen wurden nach der Kultur entfernt, fixiert, eingebettet und auf Objektträgern montiert, bevor sie gefärbt wurden. Epithelzellen wurden auf Mucin 5AC (MUC5AC)18, eine Komponente des Schleims, und das Forkhead-Box-Protein J1 (FOXJ1)19, einen Transkriptionsfaktor, der an der Signalübertragung für die Cilienproduktion beteiligt ist, gefärbt. Fibroblasten wurden mit Weizenkeimagglutinin (WGA) gefärbt, um die zellulären Phospholipid-Doppelschichten sichtbar zu machen. Die Zellen wurden 15 Minuten lang mit 5 μg/mL in HBSS inkubiert und vor der Bildgebung dreimal mit PBS gewaschen. Alle Zellkerne wurden mit DAPI visualisiert. (A) Querschnittsansicht: erzeugt aus einer Z-Stack-Projektion von Bildern von (B) und (C). (B) Epithel-MUC5AC/FOXJ1/DAPI-Fleck auf einer Chipmembran. (C) Vollständige äußere Struktur der Fibroblastschicht in der Basalkammer8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 10. Zelllebensfähigkeit und Kokultur auf dem Basalmembrangerüst. (A) LEBENDE/TOTE Lebensfähigkeit von HaCaT-Zellen, die auf der Epithelseite ausgesät wurden, 3 unabhängige Proben wurden getestet, 3 zufällige Felder wurden von jeder Probe erfasst (n = 3). Ein gewöhnlicher Einweg-ANOVA-Test mit Tukey-Korrektur wurde durchgeführt. Das Diagramm zeigt den Mittelwert mit der Standardabweichung. Kokultur von (B) HaCaT-Zellen auf der epithelialen Seite und (C) MRC-5-Lungenfibroblasten auf der stromalen Seite des von Kollagenfasern umgebenden Basalmembran-Gerüsts, Schuppenbalken sind 50 μm groß. (D) 3D-Ansicht der Kokultur von oben und unten isometrisch aus, Skalenbalken sind 100 μm, animierte Visualisierung ist in ergänzender Abbildung 4 zu finden. (E) Die Dicke des Basalmembrangerüsts vor und nach der Decellularisierung wurden 14 Mukosen gemessen, und daraus wurden 6 (dargestellt durch Dreiecke) für die Decellularisierung entnommen. Auf jeder der Stichproben wurden drei zufällige Felder gescannt und mindestens 10 Punkte pro Feld wurdenals 17 gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1. Chipformentwürfe für die obere und untere Hälfte des Standard-PET/PC-Chips. (A) Bild der unteren Form des Chips, das aus dem hergestellt werden kann. STL in Ergänzungsakte 1. (B) Bild der oberen Form des Chips, das aus dem hergestellt werden kann. STL in Ergänzungsakte 2. (C) Bild der Membranschablone zum Schneiden von Membranen für den Chip, das aus dem hergestellt werden kann. STL in Ergänzungsakte 3. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2. Chipform-Entwürfe für die obere und untere Hälfte des Stretch-ECM-Membranchips. (A) Bild der unteren Form des Chips, das aus dem hergestellt werden kann. STL in Ergänzungsakte 4. (B) Bild der oberen Form des Chips, das aus dem hergestellt werden kann. STL in Ergänzungsakte 5. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3. Validierung des Versiegelungsverfahrens: Vergleich der PDMS-Eindringung in Poren ohne Toluol, um die Viskosität des Mörtels zu senken, und ausgehärtet bei RT ohne Vakuum. Alle Erkrankungen liegen bei PET-Membranen (0,4 μm Poren) auf, nach der PDMS-Behandlung (Nile Red 1 %) wurden die Membranen vor der Montage und der Lichtmikroskopbildgebung in Paraffin eingebettet. (A) Unverdünntes PDMS auf eine PET-Membran abgesaugt. Eine dicke Schicht PDMS ist auf der Oberfläche der Membran zu sehen, während kein PDMS in die Poren eingedrungen ist (mit weißen Feldern markiert). (B) Verdünnter PDMS-Mörtel, abgesaugt auf eine PET-Membran. Eine Schicht von PDMS ist auf der Oberfläche der Membran zu sehen, während kein PDMS in die Poren eingedrungen ist (mit weißen Feldern hervorgehoben). (C) Verdünnter PDMS-Mörtel, abgesaugt auf eine PET-Membran. Eine dünne Schicht PDMS ist auf der Oberfläche der Membran sichtbar sowie ein Eindringen in die Poren entlang der Membran (mit weißen Kästchen hervorgehoben). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4. 3D Visualisierung von Kokultur-HaCat (epithelial) und MRC-5 (stromale) Zellen auf dem porcinen ECM-Gerüst. Eine animierte 3D-Ansicht der Kokultur aus oberen und unten isometrischen Ansichten, deren Bilder in Abbildung 10D zu sehen sind, die Maßstabsbalken sind 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 1. 3D . STL-Feile der unteren Form. Die Form kann verwendet werden, um die untere Hälfte des Standardchips durch 3D-Druck oder eine vergleichbare Fertigungsmethode herzustellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 2. 3D. STL-Feile der oberen Form. Die Form kann verwendet werden, um die obere Hälfte des Standardchips durch 3D-Druck oder eine vergleichbare Fertigungsmethode herzustellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 3. 3D . STL-Datei der Membranschablone. Die Schablone kann verwendet werden, um Membranen der richtigen Größe für den bereitgestellten Chip herzustellen und kann durch 3D-Druck oder eine vergleichbare Fertigungsmethode hergestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 4. 3D . STL-Feile der unteren Form des Stretchchips. Die Form kann verwendet werden, um die untere Hälfte des Dehnchips durch 3D-Druck oder eine vergleichbare Herstellungsmethode herzustellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 5. 3D. STL-Feile der oberen Form des Stretch-Chips. Die Form kann verwendet werden, um die obere Hälfte des Dehnchips durch 3D-Druck oder eine vergleichbare Fertigungsmethode herzustellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Das hier bereitgestellte Chip-Versiegelungsprotokoll stellt eine neue Möglichkeit dar, wasserdichte PDMS-Membran-Chip-Dichtungen herzustellen, die für eine langfristige Kultur unter Fluss geeignet sind, mit begrenzter Ausrüstung hergestellt werden können und keine speziellen Fähigkeiten erfordern. Wir zeigen das Verfahren zur Herstellung von Chipwafern mit Membranen (PET, PC, ECM), die mit Silikonmörtel an der Oberfläche gebunden sind, und zeigen, dass die schnelle Anwendung von Vakuum das Eindringen des PDMS in die Poren und über die Oberfläche von Kunststoffmembranen erleichtert. Wir zeigen außerdem, dass die resultierenden Chips gut versiegelt sind und für eine Vielzahl von Kulturanwendungen geeignet sind.

Es gibt verschiedene Herangehensweisen an die PDMS-plastische Bindung, eine gängige Bindungsstrategie aufgrund der vorteilhaften Eigenschaften der Zellkultur von PDMS, wie Gaspermeabilität oder Musterbarkeit, sowie Kunststoffmembranen für deren Zellkultur-Viabilität7. Dazu gehört die Oberflächenaktivierungmit O2-Plasma-, Korona- oder Ozonbehandlung, die die Bildung kovalenter Bindungen zwischen Silikon oderGlas-20 erleichtert. Andernfalls werden chemische Klebetechniken mit Organosilanen wie APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilan) oder MPTMS ((3-Mercaptopropyl)trimethoxysilan) funktionalisiert, um die Oberfläche der beiden Materialien durch Hinzufügen der reaktiven Gruppen21 zu funktionalisieren. Alternativ können PDMS und Kunststoffsubstrate mit einer Klebstoffmethode mit Epoxidharz oder anderen Klebstoffen22 geklebt werden. Wir präsentieren eine Mischung aus Oberflächenaktivierung und chemischem Kleben, wobei poröse Membranen und Vakuum verwendet werden, um eine physikalische Verbindung durch die Membran herzustellen, die alleindurch O2-Plasma-Oberflächenaktivierung gebunden werden kann. Durch das Verdünnen des PDMS mit Toluol ermöglichen wir die Invasion des PDMS durch die Poren einer Membran unter Vakuum, wodurch verschiedene Membranen kovalent durch PDMS-PDMS-Bindungen über die Chiphälften und die mit Mörtel eingebettete Membran gebunden werden können. Durch die Herstellung eines physikalischen Silikonnetzwerks durch diese Poren umgehen wir die Notwendigkeit einer Oberflächenchemischen Behandlung oder der Wärme und des Drucks durch eine heiße Prägungsmaschine, die diese Techniken oft unterstützt23.

In der aktuellen Studie wird ein großflächiger zweikammeriger Chip bereitgestellt (Supplemental File 1), der eine Vielzahl von Funktionen haben kann. Zweitens ein Chip, der zyklische horizontale Dehnung kann (Supplemental File 2). Diese Geräte funktionieren als Airway-on-Chip, während das Modell auch als Gut-on-Chip verwendet werden kann, wie zuvor gezeigt13. In erster Linie wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung mit einer Reihe verschiedener Optionen für Formproduktion, Membranvorbereitung und Chip-Herstellung bereitgestellt, die je nach Wunsch der Forscher auf weitere neuartige Chipplattformen angewendet werden können. Es wird empfohlen, für die endgültige Abdichtung einen O2-Plasmaofen zu verwenden. Dennoch wurde auch ein Handplasmagerät oder manuelle Kompression mit PDMS-Mörser als erfolgreich für diesen Schritt24 erwiesen. In diesem Protokoll für dieses Versiegelungsverfahren wurden an jedem Punkt wichtige Hürden und Spezifikationen hervorgehoben. Dazu gehören die Möglichkeit, die Membranen vorzubeschichten, die Bedeutung der sofortigen Verwendung des PDMS/Toluomörtels, die Bedeutung, dass der Mörtel nicht in den Kulturbereich gelangt, und wie wichtig es ist, dass die Membran nach der Verbindung mit dem Mörtel nicht bewegt wird.

Die Reproduktion dieses Versiegelungsverfahrens wurde wiederholt von Forschern mit einem schriftlichen Protokoll durchgeführt; nur die folgenden Klarstellungen waren notwendig, um bei einem zweiten Versuch erfolgreich zu versiegeln. Bei dem Auftreten von Lecks während Stresstests oder längerer Zellkultur können einige Optionen in Betracht gezogen werden. Zunächst sollte der Forscher sicherstellen, dass der Mörser frisch aus PDMS-Flüssigkeit hergestellt wird, die noch nicht ausgehärtet ist und gründlich mit Toluol vermischt ist. Die geringe Viskosität des Mörtels ermöglicht eine dünne, glatte Schicht, die durch das Vakuum der Luft in die Membranporen strömen kann. Zweitens sollte man genug Mörtel auftragen, um den gesamten unteren und oberen Teil der Membran zu bedecken; während zu viel dazu führt, dass der Mörtel unter Kompression in den Kulturbereich fließt, entstehen zu wenig Lücken, die einen Weg für Zwischenkammerlecks bieten. Drittens müssen die Membranen vor und während des Ansatzes flach sein. Schließlich müssen die Chips trotz des manuellen Aufwands weitgehend schmutzfrei bleiben, um eine vollständige endgültige Haftung zu gewährleisten, daher ist schnelles und sauberes Arbeiten unerlässlich.

Obwohl wir in diesem Artikel die Anhaftung von drei verschiedenen Typen poröser Membranen gezeigt haben, kann die Funktion dieser Methode für andere Membranen nicht vorhergesagt werden. Dies liegt daran, dass unterschiedliche chemische Beständigkeiten gegen Toluol sowie andere Dichten und Porengrößen das Ergebnis dieses Versiegelungsverfahrens beeinflussen. Wir zeigen jedoch die erste dehnbare, vollständig ECM-basierte Membranbindung, was auf eine hohe Vielseitigkeit des Protokolls hindeutet. Die Konsistenz der Dehnungsleistung wurde jedoch nicht zuverlässig überprüft, da verschiedene Basalmembranregionen, Organe und Quellen mechanische Unterschiede verursachen. Darüber hinaus ist auch die Lebensfähigkeit für Zellkultur der ECM-Membranen anfällig für Veränderungen im Laufe der Zeit, sowohl in der Kultur als auch in der Lagerung19. Obwohl dieses Verfahren bei verschiedenen Membranen und Chip-Setups funktioniert, erfordert es eine manuelle Bemalung des Mörtels, was relativ wenig Zeit benötigt, aber bei größeren Modellen wie denen, die wir anbieten, häufiger erfolgreich ist. Schließlich erfordert der Membranbindungsprozess zwar nur PDMS, Toluol, eine Membran und eine Vakuumkammer, während die endgültige Abdichtung des Chips von der Anwendung vonO2-Plasma abhängt, das nicht überall verfügbar ist.

Trotz der Einschränkungen ist das bereitgestellte Protokoll neuartig und erfordert keine spezialisierte Fähigkeit, um es zu erreichen. Nach unserem besten Wissen ist die Herstellung von Silikonnetzwerken durch die Membranporen durch das Vakuumieren des niedrigviskosen PDMS-Mörtels die erste ihrer Art. Im Gegensatz zu anderen chemischen oder mechanischen funktionalen Brücken zwischen den verschiedenen Materialien, die einem funktionalen Chip zugrunde liegen, ist diese Lösung in den meisten Laborumgebungen möglich.

Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Konsortium Precision Medicine for More Oxygen (P4O2) sowie von der Stichting Proefdiervrij unterstützt. Mein tiefster Dank gilt Isadora Kraguljac für die Idee, Nile Red Lack zu verwenden, da sie sich mit dem PDMS zur Visualisierung der Silikonnetzwerke vermischen würde, und an Marjan Reinders-Luinge für ihr talentiertes Schneiden und Montieren der Membranen. Die Autoren sprechen der Abteilung für pharmazeutische Analyse und Sabeth Verpoorte ihren tiefsten Dank aus, die Zugang zu ihrem Sauerstoffplasmaofen ermöglicht haben – ohne diesen wäre der Prozess nicht möglich gewesen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 mL Spritze mit breiter ÖffnungBD Emereld307727
2mm Biopsie-PunchKAI medizinischBP-20F
Calu-3-ZelllinieATCCHTB-55RRID:  CVCL_0609
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Gibco14170112
O2 PlasmaofenHarrick PlasmaPDC-002
PC-Track-ZellkulturmembranenipCELLCULTURE1000M25/620N403/47
PET-Spur-geätzte ZellkulturmembranenipCELLCULTURE2000M23/610N403/47
Polydimethylsiloxan/Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Base und HärtemittelDow CorningDOWC25100445
Polymethylmethacrylat (8 mm)ColltecN/A
Standard-Photopolymerharz (Grau)(1 kg)ElegooN/A
ToluolMerck 1,08,325
VakuumkammerFisherScientific12080253

Referenzen

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