Herstellung wirtschaftlicher und universeller Kompensationsperlen, die mit Multi-Spezies-Antikörpern kompatibel sind

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine kosteneffiziente Methode zur Herstellung multispezieskompatibler Kompensationsperlen für die Fluoreszenzkompensation in der Durchflusszytometrie unter Verwendung rekombinanter Protein-A/G/L-GEKOPPELTEN POLYSTYROL-MIKROSPHÄREN.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine kosteneffiziente und reproduzierbare Methode zur Herstellung von multispezieskompatiblen Kompensationsperlen für die Fluoreszenzkompensation in der mehrfarbigen Durchflusszytometrie. Hier wurde das rekombinante Immunglobulinbindungsprotein A/G/L (Protein A/G/L) mit mehreren Immunglobulin-Bindungsdomänen in Escherichia coli (E. coli) exprimiert, mit Nickelaffinitätschromatographie gereinigt und kovalent an carboxylierte Polystyrol-Mikrosphären mittels EDC/NHS-Chemie gekoppelt. Die resultierenden Perlen binden Antikörper verschiedener Arten und Unterklassen und erzeugen starke und deutliche Fluoreszenzsignale, die für die Kompensationseinrichtung geeignet sind. Diese Ergebnisse bieten praktische Hinweise zur Auswahl des Perlendurchmessers und der Proteinbeladung, um Fluoreszenzintensitäten zu erreichen, die für unterschiedliche Kompensationsanforderungen geeignet sind. Die erfolgreiche Durchführung des Protokolls zeigt sich durch eine effiziente Proteinreinigung und einen klaren, hochintensiven Fluoreszenzpeak konjugierter Perlen im Vergleich zu Kontrollperlen während der Durchflusszytometrie. Dieser einfache und skalierbare Ansatz ermöglicht die routinemäßige Vorbereitung stabiler, vielseitiger Kompensationsperlen in Standardlaboren, was Kosten senkt und gleichzeitig die Flexibilität für Durchflusszytometrieanwendungen verbessert.

Einleitung

Die Flowzytometrie ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug in der Immunologie, Zellbiologie und klinischen Forschung für die multiparametrische Analyse von Zellpopulationen^geworden. ^1,2,3. Eine entscheidende Herausforderung in der traditionellen mehrfarbigen Durchflusszytometrie ist der Fluoreszenzüberlauf, bei dem das Emissionsspektrum eines Fluorochroms sich in mehrere Detektorkanäle überlappt, was zu Signalkontamination und fehlerhafter Interpretation^{führt 4,5}. Daher ist eine angemessene Vergütung für eine genaue Dateninterpretation unerlässlich.

Traditionell werden Kompensationskontrollen mit einfarbigen, gefärbten Zellen durchgeführt. Allerdings stellen begrenzte Zellanzahl, variable Antigenexpression und unterschiedliche Bindung von Antikörpern an Zellen Herausforderungen⁶ dar. Infolgedessen sind synthetische Perlen, die zur Bindung von fluorochromkonjugierten Antikörpern modifiziert wurden, als praktikable^{Alternative 7,8} hervorgetreten. Perlen bieten die Vorteile einer konstanten Bindungskapazität, hoher Fluoreszenzintensität und Unabhängigkeit von zellulärer Antigenexpressionsstufe⁹. Im Vergleich zu Einzelarten oder Fc-beschränkten Fangreagenzien erweitert die Einbindung mehrerer Immunglobulinbindungsdomänen (Protein A, G und L) die Abdeckung der Arten und die Kompatibilität des Antikörperformats, sodass eine einzelne Perlenpräparation verschiedene fluorochromkonjugierte Antikörper aufnehmen kann.

Unter den zur Kompensation verwendeten Perlen sorgt die Kopplung von Immunglobulin-bindenden Proteinen wie Protein A, Protein G und Protein L für eine breite Kompatibilität mit Antikörperisotypen verschiedener Spezies. Protein A und G binden an die Fc-Region vieler IgG-Unterklassen, während Protein L an κ-Leichtketten von Immunglobulinen bindet und dadurch die Bindungsfähigkeit an Fab-Fragmente und Einzelketten-Antikörper^erweitert.

Obwohl kommerzielle Kompensationsperlen verfügbar sind, können ihre relativ hohen Kosten für Labore mit begrenztem Budget unerschwinglich sein, was ihre^{breite Anwendung} einschränkt. Angesichts dieser Herausforderungen besteht ein Bedarf an flexiblen, anpassbaren Perlenplattformen, die es Forschern ermöglichen, die Perlengröße, die Antikörperbindungsdomäne und die für Kompensationskontrollen verwendeten Antikörpertypen zu definieren. Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache, wirtschaftliche und reproduzierbare Methode zur Herstellung von multi-artenkompatiblen Kompensationsperlen für die mehrfarbige Durchflusszytometrie bereitzustellen. Dieses Protokoll beschreibt das Design, die Expression und Reinigung eines rekombinanten Fusionsproteins, das mehrere Immunglobulin-Bindungsdomänen aus den Proteinen A, G und L enthält, gefolgt von seiner kovalenten Konjugation zu carboxylmodifizierten Polystyrolperlen mit definierten Durchmessern.

Das Protokoll beschreibt das molekulare Design des Fusionsproteins, seine Expression und Reinigung in E. coli sowie die Herstellung von perlenbasierten Kompensationsreagenzien, die mit mehreren fluorochromkonjugierten Antikörpern kompatibel sind. Dieses Protokoll ist für Labore gedacht, die mehrfarbige Durchflusszytometrie in unterschiedlichen Forschungsumgebungen durchführen, einschließlich Immunologie, Onkologie und translationalen Studien, insbesondere dort, wo Kostensenkungen, Artenübergreifende Kompatibilität und flexible Kompensationskontrollen erforderlich sind.

Protokoll

HINWEIS: Bereiten Sie alle Puffer und Reagenzien frisch vor, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Bereite EDC- und NHS-Lösungen unmittelbar vor der Nutzung vor; Lagern Sie sie nicht. Für alle anderen Puffer (Lysis, Binding, Washing, Elution, MES, PBS, Tris) bereiten Sie Vorrätelösungen im Voraus vor und lagern Sie sie bei 4 °C. Gleiche die gespeicherten Puffer vor der Verwendung auf die passende Reaktionstemperatur (Raumtemperatur oder 4 °C) aus. Stellen Sie sicher, dass FACS-Puffer und Speicherpuffer frisch vorbereitet oder bei 4 °C gelagert werden.

1. Expression und Reinigung des rekombinanten Proteins A/G/L

1. Expression des rekombinanten Proteins A/G/L
   1. Transformieren Sie das pET28-Protein A/G/L-Plasmid in E. coli BL21(DE3)-fähige Zellen mittels eines Standard-Hitzeschockprotokolls.
   2. Die transformierten Zellen werden auf LB-Agar mit 50 μg^·mL-1 Kanamycin plattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
   3. Inokulieren Sie eine einzelne Kolonie in 5–10 mL LB-Brühe mit Kanamycin (50 μg·^mL-1) und kultivieren Sie über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 200 × g.
   4. Übertragen Sie die Übernachtkultur in 200 ml LB mit Kanamycin (Endkonzentration 50 μg·^mL-1) bei einer Verdünnung von 1:100.
   5. Wachsen Sie die Kultur bei 37 °C, bis die optische Dichte bei 600 nM (OD600) 0,6–0,8 erreicht.
   6. Induzieren Sie die Proteinexpression, indem Sie Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 0,5 mM hinzufügen und bei 28 °C für 12–16 Stunden inkubieren.
   7. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 4 °C, 4000 × g für 10 Minuten entnommen.
   8. Entsorge den Supernatant und suspendiere das Zellpellet wieder in den Lysepuffer. Gehen Sie sofort fort oder lagern Sie die Pellets bei -80 °C.
      Pausenpunkt: Zellpellets können mehrere Wochen vor der Lyse bei -80 °C gelagert werden.
2. Zelllyse
   1. Die bakterielle Pellet wird in 10 ml Lysepuffer pro Gramm feuchter Zellmasse wieder suspendiert.
   2. Lyse die Zellen mit einem Hochdruckhomogenisator auf 1000 bar, wobei die Suspension 2–3 Zyklen durchläuft, bis die Lösung weniger viskos und durchsichtig wird.
      Hinweis: Alternativ kann eine Zellstörung durch Sonikation auf Eis im Pulsmodus (5 s AN / 10 s OFF) über 8–12 Zyklen durchgeführt werden, um Überhitzung zu vermeiden. Stellen Sie eine vollständige Lyse sicher, indem Sie einen kleinen Aliquot unter dem Mikroskop untersuchen.
   3. Zentrifugiere das Lysat bei 12.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C.
   4. Sammeln Sie das Supernatant als lösliche Proteinfraktion zur Reinigung.
3. Ni-NTA-Affinitätsreinigung
   1. Säulenausgleich und Probenbelastung
      1. Die Ni-NTA-Säule wird mit 10 Spaltenvolumina (CV) eines Bindungspuffers mit 10 mM Imidazol ausgeglichen.
      2. Filtern Sie das geklärte Lysat durch einen 0,45 μM-Filter, fügen Sie Imidazol zu einer Endkonzentration von 10 mM hinzu und laden Sie es mit 0,5 CV·^min-1 auf die Säule.
      3. Sammeln Sie den Durchflussanteil, um die Bindungseffizienz zu überwachen.
   2. Waschen
      1. Waschen Sie die Säule mit 10 CV Bindungspuffer und Waschpuffer mit 20 mM Imidazol bei einer Durchflussrate von 1 CV·^min-1.
   3. Eution
      1. Elutieren Sie das Zielprotein mit einem Elutionspuffer bei einer Durchflussrate von 1 CV·^min-1.
      2. Sammeln Sie Fraktionen und überwachen Sie A280, um proteinhaltige Fraktionen zu identifizieren.
   4. Pufferaustausch und Proteinspeicherung
      1. Übertragen Sie die gereinigte Proteinlösung in ein 50 kDa Molekulargewichts-Cut-off (MWCO) Zentrifugal-Ultrafiltrationsrohr.
      2. Zentrifugieren Sie bei 3.500 × g für 15–20 Minuten bei 4 °C, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist.
      3. Verwerfen Sie den Durchfluss und fügen Sie dem Retentat für den Pufferaustausch ein gleiches Volumen PBS-Puffer (pH 7,4) hinzu.
      4. Wiederholen Sie die Zentrifugation und den PBS-Austausch 2–3 Mal, um den ursprünglichen Puffer vollständig durch PBS zu ersetzen.
      5. Nach dem letzten Konzentrationsschritt sammeln Sie das Retentat und messen Sie die Proteinkonzentration.
      6. Überprüfen Sie die elutierten Brüche mit SDS-PAGE; das erwartete Molekulargewicht von Protein A/G/L beträgt etwa 90 kDa.
      7. Aliquot das gereinigte Protein und bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung lagern.
         HINWEIS: Das Protokoll kann an diesem Schritt pausiert werden. Gereinigtes Protein A/G/L kann bei -80 °C für spätere Perlenkonjugation gelagert werden. Nach der Konzentration wurden etwa 10 mg gereinigtes Protein A/G/L aus 200 ml Bakterienkultur gewonnen, mit einer Endkonzentration von 2–5 mg·mL⁻¹.

2. Konjugieren Sie die Perlen zu Protein A/G/L

1. Perlenvorwäsche
   1. Wirbelperlen werden bei maximaler Geschwindigkeit 20–30 Sekunden bei Raumtemperatur (20–25 °C) aufgehängt und gleichmäßig wieder aufgehängt. Übertragen Sie 0,2 mL 8 μM Perle (5 mg) in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr.
   2. Pelletperlen durch Zentrifugation, 5000 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur.
   3. Saugen Sie vorsichtig ein und entsorgen Sie das Überlagermittel, ohne das Pellet zu stören.
   4. Fügen Sie 1 ml 0,1 M MES-Puffer hinzu, suspendieren Sie vorsichtig durch Pipetten oder sanftes Vortexen, zentrifugieren Sie erneut 5000 g × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überschussmittel. Wiederhole diesen Wasch einmal (insgesamt zwei MES-Waschen).
2. Aktivierung mit EDC/NHS
   VORSICHT: EDC und NHS sind Reizstoffe und sollten mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung in einer Abzughaube behandelt werden.
   1. Perlen in 0,5 mL MES-Puffer wieder suspendieren und dann nacheinander 50 μL 50 mg·^mL-1 NHS und 100 μL 50 mg·^mL-1 EDC hinzufügen.
      Hinweis: EDC- und NHS-Lösungen müssen unmittelbar vor der Nutzung frisch vorbereitet werden.
   2. Wirbelperlen und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf einem rotierenden Shaker bei Raumtemperatur, um sie zu aktivieren.
3. Entferne die Aktivierungsreagenzien und wasche
   1. Pelletperlen: 5000 × g, 3 min, bei Zimmertemperatur. Entferne vorsichtig das Supernatantant.
   2. 1 ml PBS-Puffer hinzufügen, vorsichtig wieder suspendieren, zentrifugieren (5000 × g, 3 min, bei Raumtemperatur) und Supernatant entfernen. Führen Sie eine PBS-Waschung durch, um Aktivierungsreagenzien zu entfernen.
4. Proteinkopplung
   1. Das aktivierte Perlenpellet wird in 0,4–0,5 mL PBS (Endreaktionsvolumen 0,5–0,6 mL) wieder suspendiert. Halten Sie das Volumen niedrig, um die effektive Proteinkonzentration zu erhöhen.
   2. Gib 100 μg Protein A/G/L dazu. Vorsichtig mischen.
   3. Inkubieren Sie die Reaktion auf einem rollenden Shaker bei Raumtemperatur für 2 Stunden zur schnellen Kopplung, also bei 4 °C über Nacht. Sorgen Sie für sanftes Roll, um ein Perlenabsetzen zu verhindern.
5. Abschrecken/beendende Reaktion
   1. Pelletperlen (5000 × g, 3 min) und Supernatant entfernen.
   2. Fügen Sie 1 ml 0,1 M Tris (pH = 7,4) hinzu, um die verbleibenden NHS-Ester zu löschen. Wieder aufhängen und 30 Minuten auf einem rollenden Shaker bei Zimmertemperatur inkubieren.
   3. Pelletperlen und Waschen mit 1 mL PBS in derselben 1,5-mL Mikrozentrifugenröhre. Zentrifugieren Sie erneut (5000 × g, 3 Min) und entsorgen Sie das Supernatant. Anschließend werden die Perlen mit einem 0,5-mL Speicherpuffer wieder suspendiert.
      Pausenpunkt: Das Protokoll kann an diesem Schritt pausiert werden. Resuspendierte Perlen können bei 4 °C gelagert werden.
6. Mischen und speichern
   1. Zähle konjugierte und unkonjugierte Perlen. Mischen Sie die konjugierten und unkonjugierten Perlen im Verhältnis 25 % zu 75 % im neuen 1,5-mL-Mikrozentrifugenrohr.
   2. Suspendieren Sie die Perlenmischung in 1 ml Speicherpuffer (PBS enthält 1 % BSA und 0,05 % antimikrobielles Konservierungsmittel).
   3. Übertragen Sie die Suspension in ein beschriftetes Rohr und lagern Sie bei 4 °C. Lichtschutz ist nicht erforderlich. Vor der Anwendung vorsichtig wieder aufhängen, um eine gleichmäßige Verteilung der Perlen zu gewährleisten. Unter diesen Bedingungen bleiben die Perlen mindestens 6 Monate stabil.

3. Vertreter QC

1. Inkubieren Sie 10 μL konjugierte Perlen mit 1 μL fluoreszierendem Antikörper in einem 100 μL FACS-Puffer für 15–30 Minuten bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Jede Röhre sollte nur einen fluoreszierenden Antikörper enthalten.
2. Waschen Sie die Perlen mit 1 mL PBS, ziehen Sie sie in 300–500 μL PBS wieder auf und lassen Sie sie mit dem Durchflusszytometer laufen.
3. Stellen Sie den Detektionskanal entsprechend dem mit dem Antikörper konjugierten Fluorophor ein (z. B. 488 nM-Laser mit FITC-Detektor für FITC-konjugierte Antikörper). Ein repräsentativer Photomultiplier-Röhren-(PMT)-Spannungsbereich von 0–200 V kann als Ausgangspunkt verwendet und je nach Instrumentenleistung angepasst werden. Sammeln Sie mindestens 10.000 Ereignisse pro Probe.
4. Gate auf Perlen von FSC/SSC. Positive Perlen sollten einen klaren Einzelgipfel mit hohem MFI im Kanal des Fluorophors zeigen; Negative Control sollte nur den Hintergrund anzeigen.

Ergebnisse

Das rekombinante Fusionsprotein A/G/L besteht aus 816 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 90,5 kDa (Supplementary File 1). Dieses Fusionsprotein behält fünf IgG-bindende B-Domänen von Protein A, zwei IgG-bindende Domänen von Protein G und fünf κ-leichtkettenbindende B-Domänen von Protein L, während die albuminbindende Domäne entfernt wurde (Abbildung 1A, Ergänzungstabelle 1). Ein Cysteinrest wurde am C-Ter...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen praktischen und effizienten Arbeitsablauf zur Herstellung fluoreszierender Kompensationsperlen auf Basis des rekombinanten Proteins A/G/L. Das Verfahren umfasst bakterielle Expression, Ni-NTA-Affinitätsreinigung und kovalente Kopplung des gereinigten Proteins an carboxylmodifizierte Polystyrol-Mikrosphären mittels EDC/NHS-Chemie. Die resultierenden Perlen können Antikörper aus mehreren Spezies und Unterklassen binden und bieten so ein vielseitiges und ko...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AF647 Rat Ig2a	BioLegend	141711
APC-Maus IgG1	BioLegend	353311
BL21(DE3) Kompetente Zellen	Sangon	B528414
BSA	Solarbio	A8010
EDC	Thermo Fisher	22980	CAS: 1892-57-5
FITC Armenischer Hamster IgG	BioLegend	400905
Imidazol	Sigma-Aldrich	I202	CAS: 288-32-4
IPTG	GoldBio	I2481C	CAS: 367-93-1
Kanamycin	Sangon	A600286	CAS: 8063-07-8
KCl	Aladdin	P112134	CAS: 7447-40-7
KH2PO4	Aladdin	P434010	CAS: 7778-77-0
MES	Sigma-Aldrich	M3671	CAS: 145224-94-8
Na2HPO4	Aladdin	S274390	CAS: 7558-79-4
NaCl	Aladdin	C111549	CAS: 7647-14-5
NHS	Thermo Fisher	24500	CAS: 6066-82-6
Ni NTA Perlen 6FF	Smart-Lifesciences	SA005005
PE-Maus IgG2a	BioLegend	362603
ProClean 300	Beyotime	ST853
Tris	Sigma-Aldrich	252859	CAS: 77-86-1
Trypton	Oxoid	LP0042
Ultra-Zentrifugalfilter, 50 kDa MWCO	Millipore	UFC9050
Einheitliche Carboxyl-Polystyrol-Mikrosphären	Tomicro Biotech	10 ml, 25 mg/ml	Shanghai, China
Hefeextrakt	Oxoid	LP0021