Hochdurchsatz-Screening von L-Milchsäure-hyperproduzierenden Bacillus-Coagulans-Mutanten mittels einer automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattform

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Hochdurchsatz-Screening-Workflow für industrielle Mikroorganismen. Dabei wird eine mutierte Bibliothek mittels ARTP-Mutagenese erstellt, ein positives Tröpfchenscreening mit automatisierter Mikrofluidik durchgeführt und anschließend die Ergebnisse überprüft. Die Zuverlässigkeit des Workflows wurde durch das Screening von Hochleistungs-B . coagulans-Stämmen bestätigt.

Zusammenfassung

Die industrielle Bioproduktion ist auf Mikroorganismen angewiesen, um Zielprodukte unter technischen Bedingungen effizient zu synthetisieren. Wildtyp-Stämme haben jedoch aufgrund ihrer eigenen Stoffwechselnetzwerke oft nicht die Fähigkeit dazu. Daher ist das schnelle und genaue Screening von Hochleistungsstämmen aus groß angelegten mutanten Bibliotheken ein entscheidender Schritt in der industriellen mikrobiellen Züchtung. In den letzten Jahren hat die tropfen-mikrofluidische Technologie wegen ihres hohen Durchsatz, geringen Verbrauchs und der Fähigkeit zur Einzelzell-Kompartimentierung erhebliche Aufmerksamkeit erregt, was zur Entwicklung zahlreicher Einzelzell-Sortiersysteme geführt hat. In dieser Studie wird ein Hochdurchsatz-Screening-Protokoll für industrielle mikrobielle Stämme unter Verwendung einer automatisierten Tröpfchen-Mikrofluidik-Plattform vorgestellt. Der integrierte Arbeitsablauf besteht aus vier Hauptstufen: dem Aufbau einer mutierten Bibliothek mittels atmosphärischer und raumtemperatur-Plasma-(ARTP)-Mutagenese; hocheffiziente Einzelzell-Verkapselung und kontrollierte Mikrokultivierung in Tropfen im Pikolitermaßstab; präzise Pico-Injektion eines fluoreszierenden Biosensors, gefolgt von fluoreszenzaktivierter Tröpfchensortierung (FADS) zur Isolierung von Tröpfchen, die hochproduzierende Varianten enthalten; und die Validierung der sortierten Kandidatenstämme durch Mikroplatten- und Shake-Flask-Fermentation. Ein vollständiger und integrierter Screening-Workflow ist als standardisierte Vorlage gedacht, und seine Validierung wird durch die Isolierung von hochproduktiven, L-Milchsäure-produzierenden Mutanten von B. coagulans demonstriert, als konkretes Beispiel. Diese automatisierte Hochdurchsatz-Screening-Plattform bietet eine leistungsstarke technische Lösung mit erheblichem Potenzial, die industrielle Zucht von Hochleistungsstämmen zu beschleunigen.

Einleitung

Die industrielle Biotechnologie nutzt Mikroorganismen und Enzyme als Biokatalysatoren, um wertvolle Produkte in großem Maßstab herzustellen. Dieser Ansatz gilt als umweltfreundlicher und effizienter als die traditionelle chemische Herstellung. Die natürlichen Stoffwechselnetzwerke von Mikroorganismen haben sich jedoch so entwickelt, dass sie ihr eigenes Überleben und ihre Fortpflanzung priorisieren statt auf die effiziente Produktsynthese, die der Mensch begehrt. Daher ist oft eine hochdurchsatzfähige mikrobielle Züchtung notwendig, um den Anforderungen industrieller Produktionsumgebungen mit strengen Bedingungen ^1,2,3 gerecht zu werden. Dieser Prozess beinhaltet den schnellen Aufbau groß angelegter mikrobieller mutantenbibliotheken durch physikalische oder chemische Mutagenese, gefolgt von der Kultivierung und phänotypischen Detektion von Mutanten mit unterschiedlichen Genotypen. Nur ein kleiner Bruchteil der oberen Stämme wird dann ausgewählt. Traditionelle plattenbasierte und mikroplattenbasierte Screening-Technologien werden jedoch durch umständliche Verfahren, geringen Durchsatz und hohe Kosten behindert. Dieser Engpass zusammen mit dem erheblichen Verbrauch von Verbrauchsgütern und Reagenzien führt zu einer insgesamt niedrigen Effizienz der mikrobiellen Zucht ^4,5.

Tröpfchenmikrofluidik hat sich kürzlich als transformative Lösung für diese Herausforderung etabliert. Im Gegensatz zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS), die sich aufgrund der schnellen Diffusion von Molekülen von der Zelle nicht für das Screening ausgeschiedener Produkte eignet, kapselt fluoreszenzaktivierte Tröpfchensortierung (FADS) einzelne Zellen in Pikoliter-Skala, kompartimentierten Mikroreaktoren ^6,7,8. Diese physikalische Isolation verhindert Stammwettbewerb, ermöglicht die lokale Ansammlung ausgeschiedener Metaboliten und ermöglicht deren quantitative Detektion durch fluoreszierende Biosensoren. Daher hat sich FADS als ideale Plattform für Hochdurchsatz-Screening verschiedener extrazellulärer Produkte erwiesen, darunter Aminosäuren, organische Säuren und Enzyme. Ein Team entwickelte den genetisch codierten fluoreszierenden Biosensor GECFINDER, und in Kombination mit FADS wurden Stämme mit hohem Phenylalanin erfolgreich gescreent und die Screening-Effizienz um mehr als das 1000-fache^verbessert. Eine weitere Gruppe etablierte eine fluoreszenzaktivierte Tröpfchensortierplattform, die mit einem genetisch codierten Biosensor für Hochdurchsatz-Screening von 3-Dehydroshikimsäure-produzierenden Stämmen in E. coli gekoppelt war, und das optimierte FADS-System verbesserte die Screening-Effizienz erheblich und ermöglichte die Isolierung mutanter Stämme mit deutlich erhöhter Produktion¹⁰. Einige Forscher wandten FADS-Technologie bei der Entwicklung der Bst-DNA-Polymerase an, und die erworbenen Mutanten mit stark verbesserter Thermostabilität und Strängverschiebung wurden weiter zur LAMP-Erkennung angewandt, was die Reaktionszeit von 40 Minuten auf 10 Minuten verkürzte.

Die Umsetzung dieser technologischen Fortschritte in routinemäßige Arbeitsabläufe zur Entwicklung industrieller Belastungen bleibt jedoch eine Herausforderung. Viele kommerzielle tropfen-mikrofluidische Systeme fehlen trotz ihrer ausgefeilten Hardware ein vollständiges, intuitives und reproduzierbares Standardvorgehen, das speziell für mikrobielle phänotypische Screenings entwickelt wurde. Um diese Lücke zu schließen, wurde eine automatisierte tropfenmikrofluidische Plattform eingeführt, die modulare fluidische Steuerung, benutzerfreundliche Software und standardisiertes Chipdesign integriert und damit die ideale technische Grundlage für die Etablierung eines vollständig integrierten Screening-Workflows schuf. Diese Studie verwendet das Hochdurchsatz-Screening von hocherträglichen, L-Milchsäure produzierenden B. coagulans als Validierungsfall. Basierend auf einer tropfen-mikrofluidischen Plattform wurde folgender Workflow etabliert, der aus vier wesentlichen sequentiellen Schritten besteht: (1) Aufbau einer vielfältigen mutanten-Bibliothek mittels atmosphärischer und raumtemperatur-Plasma (ARTP)-Mutagenese; (2) hocheffiziente Einzell-Einkapselung und kontrollierte Mikrokultivierung in Tröpfchen unter Bedingungen, die für das Wachstum von B. coagulans und die Produktion von L-Milchsäure optimiert sind; (3) präzise Pico-Injektion eines L-laktatspezifischen fluoreszierenden Biosensors, gefolgt von Hochgeschwindigkeitssortierung der Tröpfchen, die übergeordnete Produzenten einkapseln; und (4) eine rigorose Validierung der sortierten Kandidaten durch Shake-Flask-Fermentation, um verbesserte Produktion und genetische Stabilität zu bestätigen. Dieses Protokoll richtet sich an Forscher und Ingenieure, die in der industriellen mikrobiellen Züchtung tätig sind und eine Hochdurchsatz-Screening von extrazellulären Produkten benötigen. Sie eignet sich besonders für kultivierbare Bakterien, die kleine Molekülmetaboliten oder Enzyme absondern. Die Screening-Plattform muss mit Sensoren ausgestattet sein, die mit der Tröpfchenmikroumgebung kompatibel sind, um eine spezifische Detektion der Zielmetaboliten zu ermöglichen. Für Sorten mit besonderen Kultivierungsanforderungen (z. B. strenge Anaeroben) können die Kultivierungsparameter angepasst werden, um eine eigene Kultivierungsstrategie zu optimieren und zu etablieren. Durch die Etablierung dieses geschlossenen, standardisierten Screening-Workflows zielt diese Studie darauf ab, eine leistungsstarke und übertragbare Lösung zur Beschleunigung der industriellen Zucht von Stämmen bereitzustellen.

Protokoll

Für diese Studie war keine ethische Genehmigung erforderlich. Alle Experimente wurden mit reinen mikrobiellen Kulturen durchgeführt, und an dieser Forschung waren weder menschliche Probanden noch Labortiere beteiligt. Siehe die Materialtabelle für Details zu allen im folgenden Protokoll verwendeten Materialien.

1. Vorbereitungen

VORSICHT: Befolgen Sie Biosicherheitsmaßnahmen. B. coagulans ist ein Biosicherheitsorganismus der Stufe 1. Trage Handschuhe und einen Laborkittel. Führen Sie alle offenen Manipulationen innerhalb einer laminaren Flusshaube durch. Alle Materialien, die mit lebenden Zellen in Kontakt kommen, kommen bei 121 °C für 20 Minuten vor der Entsorgung.

1. Abstammungsquelle und Pflege
   1. Kaufen Sie B. coagulans ATCC 7050 in einem kommerziellen Kultursammlungszentrum als Schrägkultur der zweiten Generation.
   2. Strebe eine Schlaufe der Schrägkultur auf den Samen-Medium-Agar und brüte bei 50 °C 24 Stunden lang. Wähle eine einzelne Kolonie, impfe sie in flüssiges Saatmedium und lasse sie bei 50 °C, 200 U/min für 12 Stunden wachsen.
   3. Die resultierende Kultur wird mit sterilem 40%-Glycerol zu einer Endkonzentration von 25% (v/v) gemischt und als gefrorene Brühe bei –80 °C gelagert. Für jedes Experiment tauen Sie einen frischen Aliquot auf, streichen ihn auf Samen-Medium Agar und inkubieren Sie bei 50 °C 24 Stunden lang.
   4. Dann wählen Sie eine einzelne Kolonie, inokulieren sie in flüssiges Saatmedium und kultivieren Sie sie bei 50 °C, 200 U/min für 12 Stunden, bevor sie für Mutagenese und Screening verwendet werden (ergänzende Abbildung 1).
2. Milchsäuresensor
   1. Sprengen und reinigen Sie den eLACCO1.1-Sensor, wie in den Supplementary Materials¹² beschrieben (ergänzende Abbildung 2).
   2. Ergänzen Sie den gereinigten Sensor mit 5 % (v/v) Glycerol und lagern Sie es bei –80 °C. Für jedes Experiment taut man einen Aliquot auf Eis auf und verdünnt ihn sofort mit sterilem 10 mM PBS (pH 7,4) auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 0,1 mg/mL.
3. Vorbereitung von Kulturmedien
   1. Samenmedium (g/L: Glukose 20, Hefeextrakt 5, Trypton 10, Natriumacetat 2, Natriumcitrat 2, K₂HPO₄ 2, MgSO_{4,7H 2}O 0,2, MnSO₄· H₂O 0,05, FeSO₄·7H₂O 0,01). Sterilisiere Glukose separat als 200 g/L Fond bei 115 °C für 20 Minuten.
      1. Autoklav der restlichen Komponenten bei 121 °C für 15 Minuten. Nach dem Abkühlen wird steriler Glukosebestand auf eine Endkonzentration von 20 g/L hinzugefügt und anschließend Spurenelemente filtersterilisiert.
      2. Lagern Sie das gesamte Medium bis zu einer Woche bei 4 °C. Für die nächtliche Aktivierung verwenden, Inokulumpräparation.
   2. Screeningmedium (g/L: Glukose 20, Hefeextrakt 6,66, NaCl 0,333, NH₄Cl 0,665, KH₂PO₄ 2, Na₂HPO₄ 4,46, MgSO₄ 0,12, CaCl₂ 0,074).
      1. Sterilisiere die Glukose separat bei 115 °C für 20 Minuten. Die Salz-/Hefeextrakt-Mischung bei 121 °C für 15 Minuten autoklavieren.
      2. Nach dem Abkühlen geben Sie die sterile Glukosebrühe zu 20 g/L. Lagern Sie bis zu einer Woche bei 4 °C. Verwenden Sie sie als wässrige Phase zur Tröpfchenbildung und als Kulturmedium in Tröpfchen während der 10-stündigen Brutzeit.
   3. Gärmedium (g/L: Glukose 90, Trypton 13,33, Hefeextrakt 13,33, Natriumacetat 0,67, NaCl 0,0133, MgSO_4,7H₂O 0,0133, MnSO₄· H₂O 0,0133, FeSO_{4,7H 2}O 0,0133).
      1. Sterilisiere Glukose als 500-g/L-Brühe bei 115 °C für 20 Minuten. Autoklaven der anderen Komponenten bei 121 °C für 15 Minuten.
      2. Nach dem Abkühlen geben Sie den sterilen Glukosefond zu 90 g/L. Fügen Sie kurz vor der Impfung steriles CaCO_3-Pulver (4 % W/V) hinzu, um den pH-Wert zu puffern. Bereiten Sie täglich frisch zu. Verwendung für Mikroplatten-Primärscreening und Shake-Flask-Validierung.
         HINWEIS: Bereiten Sie alle Medien mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 L vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 bei 1 M HCl ein.

2. Aufbau einer Mutantenbibliothek mit ARTP

VORSICHT: Der ARTP-Betrieb umfasst ein Hochfrequenzplasma und eine UV-Lampe. UV-Strahlung kann Augen- und Hautschäden verursachen. Plasmaentladung erzeugt Ozon und hohe Temperaturen. Halte die Kammertür immer geschlossen, solange das Plasma eingeschaltet ist. Trage einen Laborkittel und eine UV-blockierende Schutzbrille. Verwenden Sie nur 99,999 % reines Helium; Sorgen Sie für ausreichende Belüftung. Nach jeder Mutagenese-Operation wischen Sie die Werkbank und die Innenwände der Mutagenesekammer mit einem fusselfreien Tuch ab, das in 75 % (v/v) Ethanol getaucht ist. 75 % Ethanol ist hochentzündlich. Halten Sie sich von offenen Flammen, Funken und heißen Oberflächen fern.

1. Stellen Sie eine Standardkurve fest, die OD₆₀₀ mit der lebensfähigen Zellkonzentration korreliert.
   1. Inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von B. coagulans in ein Samenmedium und inkubieren Sie bei 50 °C, 200 U/min für 12 Stunden, bis die Kultur die mittlere logarithmische Phase erreicht.
   2. Serielle Verdünnungen der bakteriellen Suspension bei Gradienten von 10⁴, 10⁵ und 10⁶ vorbereiten.
   3. Pipette 100 μL jeder Verdünnung und verteilt dreimal gleichmäßig auf die Agarplatten des Saatmittels.
   4. Inkubieren Sie alle plattierten Agarplatten bei 50 °C für 24 Stunden.
   5. Zählen Sie die koloniebildenden Einheiten (CFU) für jede Verdünnung.
      HINWEIS: Die Kalibrierung zeigt, dass OD₆₀₀ = 0,5 ungefähr 1 × 10⁸ CFU/mL entspricht. Verwenden Sie diese Beziehung, um die anfängliche Zelldichte für die Tröpfchenkapselung zu bestimmen (ergänzende Abbildung 3).
2. Kultivieren Sie B. coagulans in die mittlere bis späte logarithmische Phase und verdünnen Sie anschließend die frische Saatgutkultur auf OD₆₀₀ = 0,05 im frischen Saatgutmedium.
3. Innerhalb einer laminaren Flusshaube bereiten Sie acht sterile kleine Metallscheiben und eine große Metallscheibe vor. Feuere die acht kleinen Scheiben 1 Minute über einem Alkoholbrenner, lege sie auf die sterile große Scheibe und lasse sie 10 Minuten abkühlen.
4. Mit einer Mikropipette wurde 10 μL der verdünnten bakteriellen Suspension gleichmäßig auf jede der acht gekühlten kleinen Scheiben verteilt.
5. Übertragen Sie die große Scheibe mit den geimpften kleinen Scheiben in eine sterile Petrischale.
6. Schalten Sie das ARTP-Instrument ein und aktivieren Sie den Hauptkontrollbildschirm. Schalten Sie die UV-Lampe in der Mutagenesekammer ein. Starte den Kühler und kühle 20 Minuten vor, bis sich die Temperatur bei 20 °C stabilisiert.
7. Öffne schnell die Tür zur Mutagenesekammer und lege die kleinen Scheiben hinein.
8. Mit steriler Zange wird jede kleine Scheibe sequentiell auf die ARTP-Probestufe übertragen.
   HINWEIS: Die HF-Leistung, die Heliumgasflussrate, der Abstand von Düse zu Probe und die Heliumreinheit wurden auf 120 W, 10 SLM, 2 mm bzw. 99,999 % festgelegt. Die Heliumbestrahlungszeit wurde auf 5, 10, 15, 20, 25 bzw. 30 Sekunden eingestellt.
9. Unterziehen Sie jede kleine Scheibe der ARTP-Mutagenese gemäß den Setparametern. Nach der Bestrahlung werden alle Scheiben in ein 50-mL-Zentrifugenrohr mit 10 mL Rückgewinnungsmedium übertragen. Inkubieren Sie bei 50 °C und schütteln Sie bei 200 U/min für 4 Stunden, um die Zellerholung und das Auswachsen der Zellen zu ermöglichen.
10. Bestimmung der Tödlichkeitsrate.
    1. Verdünnen Sie die gewonnene Kultur seriö auf einen Gradienten von ^10-2 bis ^10-6.
    2. Verteilen Sie 100 μL jeder Verdünnung auf Agarplatten des Saatmittels und bereiten Sie für jede Verdünnung drei Replikate vor.
    3. Inkubieren Sie alle Platten bei 50 °C für 24 Stunden.
    4. Zähle die Kolonien und berechne die entsprechende CFU/mL.
    5. Berechnen Sie die Tödlichkeitsrate mit folgender Formel:
       (1)
       HINWEIS: Führen Sie das Experiment für jeden Zeitpunkt in drei Exemplaren durch. Die optimale Mutagenesezeit für ARTP beträgt in diesem Fall 20 s (ergänzende Abbildung 4).

3. Zusammensetzung der automatisierten tropfenmikrofluidischen Plattform und der Verbrauchsmaterialien

1. Aktuierungssystem (Abbildung 1)
   HINWEIS: Sie besteht aus 3 Kanälen hochpräziser Druckregler mit einem Druckbereich von 0–1000 mbar und einer Druckansprechzeit von < 50 ms (Abbildung 1A).
2. Bildgebungssystem
   HINWEIS: Die mikroskopische CMOS-Bildgebung bietet eine Hochgeschwindigkeits-Bilddatenerfassung von ≥ 2 GB/s, eine Bildrate von 0–20.000 fps und eine maximale Auflösung von 1280 x 860. Das System verfügt über einen Autofokus zur Echtzeitbeobachtung der Tropfenbewegung und unterstützt die Aufzeichnung von Bildern und Videos, die in mehreren Formaten exportiert werden können, darunter BMP, AVI, MP4 und TIF.
3. Erkennungssystem
   HINWEIS: Es ermöglicht die Detektion von fluoreszierenden Signalen mit 2 Lasern: 488 nm und 633 nm sowie 2 Detektionskanälen.
4. Host-Steuerungssystem
   HINWEIS: Das System wird von der automatisierten tropfenmikrofluidischen Plattform gesteuert und integriert mehrere Module, darunter Flüssigkeitsaktivierung, mikroskopische Bildgebung, Anregung und Erkennung, Tröpfchenerzeugung, Pico-Injektion und Sortierung. Es unterstützt außerdem die Erfassung, Aufzeichnung, Speicherung, Darstellung und Exportierung experimenteller Daten. Teilbetriebseinheiten der automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattform sind dargestellt (Abbildung 1B).
5. Verbrauchsgüter
   HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Verbrauchsgüter umfassen: Injektionsrohr für die Ölphase, Probe und Reagenz (Abbildung 2A); Sammelröhre für Tröpfcheninkubation (Abbildung 2B); Tröpfchengenerierungschip (Abbildung 2C); Tropfen-Pico-Injektionschip (Abbildung 2D); und Tropfensortierchip (Abbildung 2E).

4. Tröpfchengenerierung

VORSICHT: Reinigen Sie die automatisierte tropfenmikrofluidische Plattform. Nach jedem Experiment wischen Sie die Bühne, den Chip-Halter und alle verschütteten Bereiche mit 75% Ethanol mit fusselfreien Tüchern ab. Entfernen Sie Restfluoriertes Öl, Zellsuspension oder Sensorlösung.

1. Einzellige Einkapselung. Um λ = 0,1 in 14 pL-Tröpfchen zu erhalten, verdünnen Sie die bakterielle Suspension auf OD₆₀₀ ≈ 0,04 (OD₆₀₀=0,5 entspricht 1 × 10⁸ CFU/mL). Laut der Poisson-Verteilung:
   (2)
   Wenn λ = 0,1 ist, sind 90,5 % der Tröpfchen leer, 9,1 % enthalten eine einzelne Zelle und 0,4 % mehrere Zellen.
   HINWEIS: In diesem Fall betrug die gemessene Effizienz der Einzelzell-Verkapselung 11,2 % (ergänzende Abbildung 5). Die Anzahl der Zellen pro Tropfen kann durch DAPI-Färbung bestimmt werden. Wenn λ = 0,1 ist und die Mehrzellenkapselungsrate 1 % übersteigt, sollte das OD₆₀₀₀ reduziert werden, um den Anteil der Tröpfchen mit mehreren Zellen zu senken.
2. Pipetten Sie 300 μL fluoriertes Öl in das Einlassfläschchen der Ölphase. Pipette 500 μL der bakteriellen Suspension in das wässrige Phaseneinlassfläschchen.
3. Ziehe das Band ab, das die Oberfläche des tropfengenerierten Chips bedeckt. Verbinden Sie das Ölfläschchen, das Probenfläschchen und das Sammelfläschchen der Reihe nach mit den entsprechenden Bohrlöchern des Chips.
4. Setze den Chip auf die Bühne und sichere ihn. Verbinden Sie die Luftschläuche einzeln mit den Einlassfläschchen gemäß den Gaspfadetiketten.
5. Öffnen Sie die Software der automatisierten tropfen-Mikrofluidik-Plattform. Stellen Sie den Bühnenbewegungsknopf entsprechend den Pfeilrichtungen auf dem Chip ein, um das Sichtfeld zur Tropfenerzeugungsstelle zu verschieben.
6. Klicken Sie auf "Start" in der Schnittstelle "Tropfengenerierung" der automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattformsoftware (Abbildung 3A). In der Bildoberfläche ziehen Sie die "Z-Achse"- und Lichtquellen-Helligkeitsregler, um die Bildklarheit und Helligkeit anzupassen.
7. Klicken Sie auf die "+"- und "-"Buttons" von "Tropfengeschwindigkeit" und "Tropfengröße", um die Erzeugungsgeschwindigkeit und Tropfengröße anzupassen.
   HINWEIS: In diesem Fall werden der Ölphasendruck und der Probenphasendruck für die Tröpfchenerzeugung automatisch auf 300 mbar bzw. 400 mbar eingestellt, um eine Erzeugungsrate von 1500 Hz zu erreichen. Unter diesen Einstellungen haben die Tröpfchen ein Volumen von 14 pL, wobei der Durchlauf des Tröpfchendurchmessers unter 5 % gehalten wird, was eine konstante Tröpfchengröße und zuverlässige Downstream-Operationen gewährleistet.
8. Warte eine Minute, bis sich die Ausrüstung stabilisiert hat und der Tropfengenerierungszustand konstant bleibt. Setze schnell das Sammelfläschchen zurück, um mit der Tropfensammlung zu beginnen.
   HINWEIS: Geben Sie im Voraus eine kleine Menge fluoriertes Öl in das neue Sammelrohr, um den unteren Port des Teflonröhrchens zu bedecken, damit die Tröpfchen nicht direkt mit der Röhrenwand in Kontakt treten und Fusion verursachen.
9. Stoppen Sie die Tröpfchensammlung nach 30 Minuten Betrieb. Klicken Sie im Pop-up-Fenster auf "Stopp", um das Stoppen der Tröpfchenerzeugung zu bestätigen.
10. Entferne vorsichtig das Sammelrohr vom Chip. Stellen Sie das Rohr und das Sammelfläschchen vertikal und warten Sie, bis die Tröpfchen im Röhrchen in das Sammelfläschchen gelangen.
11. Entfernen Sie den Chip, das Ölphaseneinlassfläschchen und das wässrige Phaseneinlassfläschchen aus der Stufe. Wischen Sie die Bühnenoberfläche mit 75% Alkohol ab. Die Phase der Tröpfchenerzeugung wird dann abgeschlossen.

5. Tröpfchenkultivierung

1. Gib 1 ml Mineralöl in das Sammelrohr.
   HINWEIS: Die Mineralölschicht bedeckt die Tröpfchensuspension, um die Verdunstung zu minimieren und die Sauerstoffbelastung zu verringern, während dennoch ein ausreichender Gasaustausch für den fakultativen anaeroben B. coagulans ermöglicht wird.
2. Stellen Sie das Sammelrohr aufrecht in ein 15-mL-Zentrifugenrohr mit sterilem Wasser. Halte das Sammelrohr locker verschlossen und inkubiere bei 45 °C für 10 Stunden.
   HINWEIS: Nach der Inkubation sollten Sie sicherstellen, dass der CV des Tröpfchendurchmessers <10 % beträgt und keine Tröpfchenkoaleszenz beobachtet wird. Verwerfen Sie Chargen, wenn diese Kriterien nicht erfüllt sind.

6. Tropfen-Pico-Injektion

VORSICHT: Während der Pico-Injektion wird während der Pico-Einspritzung eine hohe Spannung über die Instrumentenverbindung auf die Chipelektroden angelegt. Das elektrische Feld kann einen schweren elektrischen Schlag verursachen. Berühren Sie die Elektroden oder die Chipoberfläche nicht mit Metallwerkzeugen oder bloßen Händen, solange die Hochspannung aktiv ist. Deaktiviere immer den Hochspannungsausgang, bevor du den Chip anfasst. Tragen Sie isolierte Handschuhe und verwenden Sie nicht leitfähige Werkzeuge.

1. Bereiten Sie das Ölphasen-Einlassfläschchen vor. In der laminaren Flusshaube pipettieren Sie 300 μL fluoriertes Öl in das Ölphasen-Einlassfläschchen.
2. Bereiten Sie das Probeneinlassfläschchen vor. Entfernen Sie den Einlassdeckel aus dem Sammelrohr, das die Tröpfchen enthält. Ersetze sie durch eine neue Kappe.
3. Schneide die Spitze des neuen Einlassfläschchens ab. Schneiden Sie einen kleinen Teil vom vorderen Ende des neuen Einlassfläschchens ab, sodass die Spitze unter den Flüssigkeitsspiegel der Tröpfchen im Probefläschchen reicht.
4. Zieh die Kappe fest. Sichern Sie die Kappe fest, um Undichtigkeiten zu verhindern.
5. Bereiten Sie das Fläschchen für den Reagenseinlass vor. Pipette 500 μL des Milchsäuresensors in das Reagenzeinlassfläschchen.
6. Fügen Sie PBS in das Fläschchen des Reagenzeinlaufs hinzu. Gleichzeitig werden 500 μL steriler PBS-Puffer in dasselbe Reagenz-Einlassfläschchen gegeben.
   HINWEIS: In diesem Experiment wird ein PBS-Puffer hinzugefügt, um den pH-Wert der Tröpfchen auszugleichen. Die endgültige Arbeitskonzentration des Laktatsensors betrug 0,1 mg/mL, und das Ladevolumen des Laktatsensors betrug 500 μL.
7. Schneide mit einer Klinge durch das Band, das die Elektrodenschächte bedeckt, um die Elektroden freizulegen. Stellen Sie das Multimeter auf Durchgangsmodus und testen Sie die Schaltungsverbindung sowie den Kurzschlussstatus des Chips.
   HINWEIS: Wenn das Multimeter eine normale Schaltungsverbindung der Chipelektroden anzeigt, gehen Sie zum nächsten Schritt über. Wenn der Stromkreis offen ist, ersetzen Sie den Einspritzchip und testen Sie erneut.
8. Nachdem Sie die normale Stromkreisverbindung mit dem Multimeter bestätigt haben, ziehen Sie das Band von der Chipoberfläche ab. Verbinden Sie das Ölfläschchen, das Probefläschchen, das Reagenzfläschchen und das Sammelfläschchen in der Reihenfolge mit den entsprechenden Bohrlöchern des Chips.
9. Setze den Chip auf die Bühne und sichere ihn. Verbinden Sie die Luftschläuche einzeln mit den Einlassfläschchen gemäß den Gaspfadetiketten.
10. Öffnen Sie die Software der automatisierten tropfen-Mikrofluidik-Plattform. Stellen Sie den Bühnenbewegungsknopf entsprechend den Pfeilrichtungen auf dem Chip ein, um das Sichtfeld in den Elektrodenbereich des Tropfenchips zu verschieben.
11. Klicken Sie auf "Start" in der "Droplet Pico-injection"-Schnittstelle der automatisierten Tropfen-Mikrofluidik-Plattform (Abbildung 3B). In der Bildoberfläche ziehen Sie die "Z-Achse"- und Lichtquellen-Helligkeitsregler, um die Bildklarheit und Helligkeit anzupassen.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt stellt das Instrument automatisch den Druck der Ölphasenpumpe auf 400 mbar, den Druck der Probephasenpumpe auf 420 mbar und den Druck der Reagenz-Einspritzphasenpumpe auf 450 mbar an.
12. In der Anfangsphase des Betriebs wird ein Luftsegment aus dem Katheter in den Chip entlassen, was ein normales Phänomen ist, das mehrere Minuten andauert.
13. Warte, bis Tröpfchen ins Sichtfeld kommen. Klicken Sie auf "Pico-Injektion starten". An diesem Punkt wird das elektrische Feld der Ausrüstung aktiviert. Passen Sie die Tropfenerzeugungsgeschwindigkeit, den Tropfenabstand und das Einspritzvolumen an, indem Sie auf die Tasten "+" und "-" bei "Tropfengeschwindigkeit", "Tropfenabstand" und "Einspritzvolumen" klicken.
    HINWEIS: Das elektrische Feld ist auf den Standard-Maximalgang eingestellt. Wenn während des Fusionsprozesses Tröpfchen im Bereich des elektrischen Feldes brechen, wechselt man auf mittlere oder niedrige Gang. In diesem Fall betrug die Tröpfcheninjektionsrate 200 Hz.
14. Beobachten Sie die Hochgeschwindigkeitsbildanzeige-Software. Wenn Tröpfchen stabil in den Milchsäuresensor im Verhältnis 1:1 injiziert werden können, warte 5 Minuten, bis sich das Gerät stabilisiert hat. Setze schnell das Sammelfläschchen zurück, um mit der Tropfensammlung zu beginnen.
15. Nach der stabilen Injektion für 2 Stunden klicken Sie auf "Stopp", um die Tropfen-Pico-Injektion zu beenden.
16. Entferne vorsichtig das Sammelrohr vom Chip. Stellen Sie das Rohr und das Sammelfläschchen vertikal und warten Sie, bis die Tröpfchen im Röhrchen in das Sammelfläschchen gelangen.

7. Tröpfchensortierung

VORSICHT: Der Demulgator ist ein Reizstoff und kann Haut- und Augenreizungen verursachen. Es ist auch schädlich, wenn es eingeatmet oder geschluckt wird. Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Laborkittel, Schutzbrille). Behandle den Demulgator in einem gut belüfteten Bereich oder in einer Abzugshaube. Sammeln Sie den Abfall-Demulgator in einem separaten, deutlich gekennzeichneten Behälter. Nicht in die Spüle gießen.

1. In der laminaren Flow-Haube pipettieren Sie 300 μL fluoriertes Öl und geben Sie es dem Ölphasen-Einlassfläschchen zu. Ersetzen Sie die Einlasskappe des Sammelrohrs mit mikroinjizierten Tröpfchen durch eine neue Kappe.
   HINWEIS: Bevor Sie Tröpfchensortierexperimente durchführen, nehmen Sie 5 μL Tröpfchen und betrachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop. Messen Sie den Durchmesser von mindestens 200 Tröpfchen; Fahren Sie nur fort, wenn der Lebenslauf 10 % <.
2. Schneide mit einer Klinge durch das Band, das die Elektrodenschächte bedeckt, um die Elektroden freizulegen. Stellen Sie das Multimeter auf Durchgangsmodus und testen Sie die Schaltungsverbindung sowie den Kurzschlussstatus des Chips.
3. Nachdem Sie die normale Stromkreisverbindung mit dem Multimeter bestätigt haben, ziehen Sie das Band von der Chipoberfläche ab. Verbinden Sie das Ölfläschchen, das Probenfläschchen und das Sortiergefäß nacheinander mit den entsprechenden Bohrlöchern des Chips.
4. Setze den Chip auf die Bühne und sichere ihn. Verbinden Sie die Luftschläuche einzeln mit den Einlassfläschchen gemäß den Gaspfadetiketten.
5. Öffnen Sie die Hochgeschwindigkeitsbildgebungssoftware. Stellen Sie den Bühnenbewegungsknopf entsprechend den Pfeilrichtungen auf dem Chip ein, um das Sichtfeld in den Elektrodenbereich des Tropfenchips zu verschieben.
6. Klicken Sie in der "Tropfensortierung"-Schnittstelle der automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattform auf "Start". In der Bildoberfläche ziehen Sie die "Z-Achse"- und Lichtquellen-Helligkeitsregler, um die Bildklarheit und Helligkeit anzupassen.
   HINWEIS: Nach dem Klick auf "Start" stellt das Instrument automatisch den Druck der Ölpumpe auf 300 mbar und den Druck der Probepumpe auf 190 mbar an, was zu einem Tröpfchendurchsatz von 100 Hz führt.
7. In der Anfangsphase des Betriebs wird ein Luftsegment aus dem Katheter in den Chip entlassen, was mehrere Minuten anhält und ein normales Phänomen ist.
8. Klicken Sie hier, um den "Laser" auszuwählen und den 488-nm-Detektionskanal auszuwählen.
   HINWEIS: Das experimentelle Personal kann je nach experimenteller Detektionskonstruktion einen 488-nm-Laser, einen 633-nm-Laser oder eine Kombination aus beiden wählen. Laserleistung: 20 mW.
9. Klicken Sie auf "Datenaufzeichnung". Das Instrument beginnt, Tröpfchenfluoreszenzsignale zu empfangen (Abbildung 3C).
   HINWEIS: Sammeln Sie Fluoreszenzsignale von 50.000 bis 100.000 Tröpfchen; Das Instrument sortiert automatisch die Signalwerte und erzeugt ein Fluoreszenz-Signalhistogramm.
10. Basierend auf dem erzeugten Fluoreszenzsignal-Histogramm wird die Sortierschwelle auf die obersten 0,1 % der gesamten Fluoreszenzsignale gesetzt und Tröpfchen mit Fluoreszenzsignalwerten oberhalb dieser Schwelle gesammelt.
    HINWEIS: In diesem Fall war das Sortiergatter so eingestellt, dass es Tröpfchen mit Fluoreszenzintensität > 2750 (a.u.) sammelt, was den obersten 0,1 % der Tröpfchen entsprach.
11. Klicken Sie erneut auf "Datenaufnahme". Das Instrument zeichnet die Fluoreszenzsignale der verbleibenden Tröpfchen erneut auf und sortiert die Zieltröpfchen basierend auf dem in Abschnitt 7.10 gesetzten Schwellenwert.
    HINWEIS: Die übrigen Tröpfchensignale werden ebenfalls automatisch sortiert und als Fluoreszenzhistogramm dargestellt.
12. Nachdem Sie den Zieltropfenbereich ausgewählt haben, schalten Sie den "Sortierschalter" ein und stellen Sie den Wert "Ablenkungskraft" ein. Die Ausrüstung beginnt, Tröpfchen zu sortieren.
    HINWEIS: Das Instrument bietet drei wählbare elektrische Feldstärken (Hoch, Mittel, Niedrig). Für Tröpfchen größer als 30 μm wählen Sie Hoch; für Tröpfchen kleiner als 25 μm wählen Sie Mittel oder Niedrig. Dies gewährleistet eine stabile Durchbiegung und eine optimale Sortiereffizienz.
13. Nachdem sich das Gerät für 5 Minuten stabilisiert hat, setze das Sammelfläschchen wieder auf, um positive Tröpfchen zu sammeln.
    HINWEIS: Während der Sortierung misst das Instrument kontinuierlich die Fluoreszenzintensität jedes Tropfens in Echtzeit und vergleicht sie mit der voreingestellten Schwelle. Nur Tröpfchen mit Fluoreszenzintensität über dem Schwellenwert werden abgelenkt und in das positive Sammelrohr aufgenommen. Ein Tropfen gilt als positiv, wenn das Instrument ein Fluoreszenzsignal zeigt, das den Sortierschwellenwert überschreitet, und gleichzeitig wird eine Tropfenablenkung in der Bildoberfläche beobachtet, was bestätigt, dass der Tropfen erfolgreich in den positiven Sammelkanal geleitet wurde.
14. Beenden Sie das Sortieren der Tröpfchen nach 4 Stunden stabilem Betrieb. Klicke in der Oberfläche "Droplet Sorting" auf "Stopp".
15. Entferne vorsichtig das Sammelrohr vom Chip. Stellen Sie das Rohr und das Sammelfläschchen vertikal auf, damit die Tröpfchen im Röhrchen in das Sammelfläschchen gelangen.
16. Nachdem die Tröpfchensammlung abgeschlossen ist, klicken Sie auf das Streudiagramm, um das Streudiagramm des Experiments, die Fluoreszenzsignalwerte der sortierten positiven Tröpfchen und die Fluoreszenzsignalwerte aller Tröpfchen zu speichern.
17. Entferne den Chip, das Ölphasen-Einlassfläschchen, das Probefläschchen und das Reagenzienfläschchen von der Bühne. Schließen Sie die Software.
18. Tröpfchen-Demulgierung. Fügen Sie 500 μL 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctanol in das Tröpfchensammelrohr hinzu. Warte 5 Minuten und gib dann 500 μL frisches Screeningmedium zur Erholung hinzu.
    HINWEIS: Schütteln Sie das Sammelrohr nach dem Einfügen des Demulgators nicht kräftig; Sanft mischen. Nach der Tröpfchen-Demulgierung bildet sich eine klare Grenzfläche zwischen der wässrigen und der ölhaltigen Phase.
19. Nehmen Sie 20 μL der demulgierten bakteriellen Suspension, verdünnen Sie sie 10-fach und verteilen Sie sie auf zwei Agarplatten. Inkubiere bei 50 °C für 2 Tage.
    HINWEIS: Der Verdünnungsfaktor kann entsprechend der Anzahl der gesammelten Tröpfchen angepasst werden. In diesem Fall wurden etwa 400 einzelne Kolonien von den beiden Platten gewonnen.

8. Datenexport

1. Klicken Sie auf das Fluoreszenzsignal-Plot im leeren Bereich der Software-Sortierschnittstelle. Wählen Sie aus, um das Tropfenfluoreszenzsignal-Streudiagramm, das Fluoreszenzsignalhistogramm und die Excel-Tabelle des Fluoreszenzsignals zu speichern, die die aufgezeichneten Fluoreszenzintensitätswerte der Gesamtzahl der Tröpfchen sowie die Fluoreszenzintensitätswerte der abgeschirmten positiven Tröpfchen enthalten.

9. Mikroplatten-Primärscreening

1. Wähle einzelne Kolonien zufällig aus.
2. Inokulieren Sie die 24-Bohrloch-Tiefbrunnenplatte für die Expansionskultur. Wählen Sie jede ausgewählte Kolonie aus und inokulieren Sie sie in einen Brunnen einer 24-Brunnen-Tiefbrunnenplatte mit 2 ml Gärmedium. Verwenden Sie eine Impfschleife.
3. Versiegeln Sie die 24-Bohrloch-Tiefbrunnenplatte mit einer nicht atmungsaktiven Membran.
   HINWEIS: Verwenden Sie keine atmungsaktive Membran. Es führt zur Verdunstung des Kulturmediums.
4. Inkubiere die Expansionskultur. Platzieren Sie die versiegelte 24-Bohrloch-Tiefbrunnenplatte in einen Schüttelinkubator bei 50 °C, 200 U/min für 24 Stunden.
5. Subkultur zur Fermentationsvalidierung. Nach 24 Stunden werden 200 μL Kultur aus jedem Brunnen in eine frische 24-Well-Tiefbrunnenplatte mit 1,8 ml Gärmedium (10 % v/v Inokulum) übertragen. Vor der Impfung fügen Sie steriles CaCO₃ zu einer Endkonzentration von 4 % (w/v) zu jedem Brunnen hinzu, um den pH-Wert zu puffern.
6. Bedienelemente einbauen. In jeder frischen 24-Bohrloch-Tiefen-Bohrloch-Platte werden drei zufällig ausgewählte Bohrlöcher mit dem elterlichen Stamm ATCC 7050 als Negativkontrollen gefüllt. Verarbeite sie identisch mit den Kandidatenstämmen.
7. Versiegeln Sie die 24-Bohrloch-Tiefbrunnenplatte mit einer nicht atmungsaktiven Membran.
8. Inkubieren Sie die 24-Brunnen-Tiefbrunnenplatte. Stellen Sie die versiegelte Platte für 24 Stunden in einen Schüttelinkubator bei 50 °C, 200 U/min.
9. Bereiten Sie Proben für den Laktatnachweis vor. Zentrifugiere die Platte bei 5.842 × g für 10 Minuten. Übertragen Sie 10 μL des Supernatanten auf eine 96-Well-Schwarze Mikroplatte und verdünnen Sie mit 990 μL ultrareinem Wasser. Gut mischen.
10. Fügen Sie den Laktatsensor hinzu. Fügen Sie 100 μL der verdünnten Probe zu jedem Brunnen einer frischen 96-Well-schwarzen Platte hinzu. Dann gib 100 μL des Milchsäuresensors hinzu. Mische vorsichtig.
11. Messen Sie Fluoreszenz. Den Teller 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren (vor Licht geschützt). Messung der Fluoreszenz mit einem Mikroplattenleser mit Anregung bei 485 nm und Emission bei 515 nm.
12. Stellen Sie die Trefferauswahlschwelle ein. Berechnen Sie die mittlere Fluoreszenz der drei elterlichen Kontrollbrunnen (Eltern) und der Standardabweichung (SD_parent). Definieren Sie die Schwelle als F_parent + 3 × SD_parent.
13. Identifiziere Primärtreffer. Eine Kandidat-Dehnung gilt als Primärtreffer, wenn ihr Fluoreszenzsignal den Schwellenwert überschreitet. Zeichnen Sie die Anzahl der primären Treffer für die nachgelagerte Validierung auf.

10. Sekundärvalidierung hocherträglicher Stämme

VORSICHT: Die mobile Phase enthält verdünnte Schwefelsäure (5 mM), die korrosiv ist. Vermeiden Sie Hautkontakt und Einatmen. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Laborkittel, Schutzbrille). Bereiten Sie die mobile Phase in einem gut belüfteten Bereich oder einer Abzugshaube vor und handhaben Sie sie. Sammeln Sie alle säurehaltigen Abfälle in einem speziellen Säureabfallbehälter für eine ordnungsgemäße Entsorgung. Nicht in die Spüle gießen.

1. Bereite die Samenkultur vor. Streche die Primär-Hit-Sorten auf die Samen-Medium-Agarplatten. Inkubieren Sie bei 50 °C für 24 Stunden. Nehmen Sie von jeder Platte eine einzelne Kolonie und impfen Sie sie in 30 ml flüssiges Samenmedium in einer 250 ml-Shake-Flasche. Inkubieren Sie bei 50 °C, 200 U/min für 12 Stunden.
2. Richte die Fermentation ein. Bereiten Sie das Fermentationsmedium vor und fügen Sie steriles CaCO3-Pulver zu einer Endkonzentration von 4 % (w/v) als pH-Neutralisator hinzu. Übertragen Sie 5 ml der Saatgutkultur in 45 ml dieses Mediums in einem 250 mL Erlenmeyer-Kolben (10 % v/v Inokulum; endgültiges Arbeitsvolumen 50 ml).
   HINWEIS: Verwenden Sie drei unabhängige Kolben für jeden Kandidatenstamm und für den Elternstamm ATCC 7050 als Kontrolle.
3. Brütet die Flaschen aus. Stellen Sie die Kolben in einen schüttelnden Inkubator bei 50 °C, 200 U/min. Fermentiere 24 Stunden.
4. Sammle Proben. Nach 24 Stunden nehmen Sie 1 ml Kultur aus jeder Flasche. Zentrifugiere bei 13.800 × g für 2 Minuten. Verdünnen Sie das Überstandsmittel 100-fach mit ultrareinem Wasser und filtern Sie durch einen 0,22-μm-Spritzenfilter.
5. Richte HPLC-Bedingungen ein. Verwenden Sie eine Aminex HPX-87H-Säule. Bereite die mobile Phase vor: 5 mM H₂SO₄ in ultrareinem Wasser, filtere durch eine 0,22 μm-Membran und entgase durch Sonikation. Stellen Sie die Säulentemperatur auf 40 °C ein, die Durchflussrate auf 0,6 mL/min, das Einspritzvolumen auf 20 μL und die Betriebszeit auf 20 Minuten pro Probe (Milchsäure elutiert bei ~12,600 Minuten). Verwenden Sie einen Brechungsindexdetektor (RID).
6. Bereite die Standardkurve vor. Lösen Sie Calcium-L-Laktat in ultrareinem Wasser auf, um Standardlösungen von 0, 0,4, 0,8, 1,2 und 1,6 g/L (exprimiert als Calcium-L-Laktat) herzustellen. Sprühe jeden Standard in dreifacher Form.
   HINWEIS: Darstellen Sie die Spitzenfläche gegen die Konzentration und erhalten Sie die lineare Regressionsgleichung (R² > 0,999). Führen Sie Standards am Anfang und Ende jedes Probenbatches aus, um Drift zu korrigieren.
7. Injiziere die Proben. Injizieren Sie die gefilterten Fermentationssupernatanten (20 μL) in das HPLC-System. Zeichnen Sie den Peak-Bereich für den Calcium-L-Laktat-Peak auf.
   HINWEIS: Injizieren Sie alle 10 Proben eine Qualitätskontrollprobe (1 g/L Calcium-L-Laktat), um die Systemstabilität zu überwachen. Die akzeptable Verschiebung der Retentionszeit beträgt <0,2 Minuten und die Spitzenflächenvariation <5 % im Vergleich zum ursprünglichen Kalibrierungsstandard.
8. Berechnen Sie die L-Milchsäure-Ausbeute. Interpolieren Sie die Spitzenfläche jeder Probe in die Standardkurve, um die Calcium-L-Laktatkonzentration (g/L) zu erhalten.
   HINWEIS: Rechnen Sie mit dem Molekulargewichtsverhältnis in die L-Milchsäurekonzentration um:
   (3)
   Berechnen Sie den Verbesserungsprozentsatz:
   (4)
9. Identifizieren Sie die letzten hochproduktiven Stämme. Wählen Sie die Stämme aus, die konstant eine höhere L-Milchsäure-Ausbeute als der Elternstamm als validierte Mutanten zeigen. Wählen Sie den besten Darsteller für eine weitere Charakterisierung.

11. Bewertung der genetischen Stabilität von hochertragreichen Stämmen

1. Striche den ausgewählten mutierten Stamm auf Samen-Agarplatten. Inkubieren Sie bei 50 °C für 24 Stunden. Das ist Generation 1.
2. Nehmen Sie eine einzelne Kolonie von der Generation 1-Platte und impfen Sie sie in 5 ml flüssiges Saatgutmedium in einem 50-mL-Rohr. Inkubieren Sie bei 50 °C, 200 U/min für 12 Stunden, um die F1-Samenkultur zu erhalten.
3. 10 % (v/v) der Generation 1 Saatgutkultur werden in 50 ml Fermentationsmedium (mit 4 % w/v sterilem CaCO₃) in einer 250 mL Shake-Kolbe übertragen. Inkubiere bei 50 °C, 200 U/min für 24 Stunden.
4. Sammeln Sie nach der Gärung 1 ml Kultur. Zentrifugieren Sie bei 13.800 × g für 2 Minuten, verdünnen Sie den Überstandsstoff 100-fach mit ultrareinem Wasser und messen Sie die L-Milchsäurekonzentration mittels HPLC. Nutze drei unabhängige Flaschen pro Generation.
5. Um die nächste Generation zu erhalten, streiche eine Schleife der Generation 1-Kultur auf eine frische Samen-Medium-Agarplatte. Inkubieren Sie bei 50 °C für 24 Stunden. Wiederhole die Schritte 11.2 und 11.3 für Generation 2.
6. Wiederholen Sie den Subkultivierungsprozess, um Generation 3 und Generation 4 zu erhalten. Für jede Generation bereiten Sie drei Shake-Flaschen vor und messen Sie die Milchsäureproduktion mittels HPLC.
7. Vergleichen Sie die Erträge der vier Generationen (1–4) mit einem Einweg-ANOVA oder Student's t-Test. Der Stamm gilt als genetisch stabil, wenn kein signifikanter Unterschied (p > 0,05) in der Milchsäureproduktion zwischen den Generationen beobachtet wird.

Ergebnisse

Basierend auf der automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattform wurde ein Hochdurchsatz-Screening-Modell entwickelt. Eine mutierte Bibliothek von B. coagulans wurde durch ARTP-Mutagenese mit einer optimalen Bestrahlungszeit von 20 Sekunden konstruiert, was eine Tödlichkeitsrate von etwa 90 % ergab (Abbildung 4A). Die mutierten Zellen wurden dann in Tröpfchen von 14 pL, etwa 30 μm Durchmesser, mit einer Erzeugungsrate von 1500 Hz (Abbildung 4B) eingeschlossen. Nach der Inkubation bei 45 °C für 10 Stunden wurde der Sensor mit einer Pico-Injektion in jeden Tropfen mit einer Frequenz von 200 Hz (Abbildung 4C) eingespritzt. Die fluoreszenzaktivierte Tröpfchensortierung wurde bei 100 Hz mit einem 488-nm-Laser durchgeführt (Abbildung 4D). Die sortierten positiven Tröpfchen wurden demulsifiziert und einzelne Kolonien zur Validierung ausgewählt. Die gepflückten Kolonien wurden zunächst in 24-Brunnen-Tiefbrunnenplatten mit Gärmedium bei 50 °C und 200 U/min für 24 Stunden kultiviert. Die Fluoreszenz jedes Bohrlochs wurde mit einem Mikroplattenmesser bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 nm bzw. 515 nm gemessen. Klone mit einer Fluoreszenz über dem Mittelwert des Elternstammes plus drei Standardabweichungen wurden ausgewählt. Diese Kandidaten wurden weiter auf 250-mL-Shake-Kolben mit einem 10%igen Inokulum übertragen und unter denselben Bedingungen weitere 24 Stunden fermentiert. Die L-Milchsäurekonzentration wurde schließlich mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bestimmt (Abbildung 4E).

Um die Machbarkeit eines Milchsäuresensors zur Abschirmung hoch-L-Milchsäure-produzierender Stämme zu validieren, wurde der Sensor zunächst charakterisiert. Um die Machbarkeit des Milchsäuresensors für den Nachweis in Mikroplatten zu validieren, wurden L-Milchsäurestandards (1, 10, 100, 1000, 10000, 10000, 100000 μM) auf Mikrotiterplatten hinzugefügt, wobei jeweils 100 μL des Milchsäuresensor-Gemisch in jede Welle hinzugefügt wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die Fluoreszenzintensität mit steigender Milchsäurekonzentration von 100 μM auf 10 mM zunahm. Der Sensor zeigte starke Fluoreszenzreaktionen auf beide L-Milchsäuren (Abbildung 5A). Dennoch bleibt sie aus zwei Gründen voll geeignet für die vorliegende Studie. Erstens ist B. coagulans ATCC 7050 ein gut charakterisierter L-Milchsäureproduzent mit vernachlässigbarer D-Milchsäurebildung, was durch sein von L-LDH dominiertes Stoffwechselprofil bestätigt wird. Zweitens wurde die Genauigkeit des Sensors bei der Quantifizierung von L-Milchsäure in tatsächlichen Fermentationsproben durch den Vergleich mit HPLC bestätigt (Abbildung 5B). Daher meldet der Sensor trotz der in vitro Kreuzreaktivität gegenüber D-Milchsäure zuverlässig L-Milchsäurewerte in unserem Screening-Ablauf. Um die Machbarkeit der quantitativen Milchsäuredetektion mit dem Milchsäuresensor zu validieren, wurden die Rückgewinnungsraten des Sensors sowohl in wässriger Lösung als auch im Screeningmedium gemessen. Die Ergebnisse zeigten eine hohe Erholungsrate von 108,81 % im Screeningmedium bzw. 98,39 % in wässriger Lösung mit relativen Standardabweichungen < 5 % (Abbildung 5C). Die leichte Erhöhung im Medium liegt im akzeptablen Bereich von 90–110 %, was auf keine signifikante Matrixinterferenz hinweist. Bei Mikroplatten-Tests wurde der Sensor 1:1 mit L-Milchsäurestandards gemischt, 5 Minuten inkubiert und zeigte eine ausgezeichnete Linearität im Bereich von 0–0,6 g/L (Abbildung 5D). Darüber hinaus ermöglichte die Fluoreszenzmethode die Detektion von 96 Proben in 5 Minuten, was einer 384-fachen Verkürzung der Gesamtnachweiszeit im Vergleich zu HPLC entspricht. Um die Machbarkeit des Milchsäuresensors für tropfenbasierte Screenings weiter zu validieren, wurden Tröpfchen mit L-Milchsäure in unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt und ein gleiches Volumen des Milchsäuresensors in jeden Tropfen pico-injiziert. Die Fluoreszenzintensität der Tröpfchen wurde mit der automatisierten tropfenmikrofluidischen Plattform nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Rechtsverschiebung des Fluoreszenzsignals mit zunehmender L-Milchsäurekonzentration (Abbildung 5E). Zur Speicherung wurde der Laktatsensor mit 5 % Glycerol ergänzt und bei -80 °C gelagert, was die Nachweisstabilität mindestens einen Monat aufrechterhielt (ergänzende Abbildung 6).

Neben der Auswahl eines geeigneten Sensors für die Zucht mit FADS-Technologie ist die Bestimmung der optimalen Kulturdauer von Stämmen in Tröpfchen entscheidend. Unzureichende Kulturzeit kann zu unzureichender L-Milchsäuresekretion führen, was zu Signalen mit niedriger Fluoreszenz führt, die zwischen Hoch- und Niedrig-Erträge-Stämmen nicht unterscheiden. Umgekehrt kann eine übermäßig lange Kulturzeit zu einer übermäßigen L-Milchsäureansammlung führen, die den Nachweisbereich des Milchsäuresensors überschreitet. Um dieses Problem zu lösen, wurde die Kulturdauer von Stämmen in Tröpfchen durch dynamische Überwachung ihres Wachstumsstatus optimiert. Die Stämme traten nach 6 Stunden Kultur in Tröpfchen in die logarithmische Wachstumsphase ein, und die bakterielle Biomasse in den Tröpfchen nahm nach 10 Stunden signifikant zu (Abbildung 6A). Im Gegensatz dazu zeigten die Tröpfchen bei einer Kulturdauer von mehr als 12 Stunden eine deutliche Schrumpfung. Dieses Phänomen wird auf osmotische Druckänderungen innerhalb der Tröpfchen während des späten Wachstumsstadiums des Spannungswachstums zurückgeführt, die eine Tröpfchenschrumpfung induzieren. Eine solche Schrumpfung kann in späteren Experimenten zu inkonsistenten Pico-Injektionsmengen zwischen verschiedenen Tröpfchen führen. Um die optimale Kulturzeit zu bestimmen, wurde ein gleiches Volumen des Milchsäuresensors in Tröpfchen injiziert, die über unterschiedliche Dauern kultiviert wurden. Es wurde festgestellt, dass das Fluoreszenzsignal der Tröpfchen nach 10 Stunden Kultur signifikant verstärkt wurde; daher wurde 10 Stunden als optimale Kulturdauer für Stämme in Tröpfchen ausgewählt (Abbildung 6B).

In einer einzigen Screening-Runde wurden die Tröpfchen dann mit einem Sortierchip mit einer Frequenz von 100 Hz für 4 Stunden sortiert, und die oberen 0,1 % der Tröpfchen mit der höchsten Fluoreszenzintensität wurden gesammelt (Abbildung 6C). Die positiven Tröpfchen wurden in ein steriles Sammelrohr aufgenommen und mit 500 μL Demulgator und 500 μL frischem Saatmedium behandelt. Nach einem sanften Schütteln von 5 Minuten wurden 20 μL der oberen wässrigen Phase entnommen, zehnfach verdünnt und auf zwei feste Agarplatten verteilt. Nach der Inkubation bei 50 °C für 2 Tage wurden 200 einzelne Kolonien zufällig ausgewählt und in 24-Tiefbrunnenplatten für die Expansion Culture geimpft. Unter den 200 kultivierten Klonen zeigten 78 mutierte Stämme höhere L-Milchsäure-Ausbeute als der Elternstamm (ergänzende Abbildung 7). Diese 78 Mutanten wurden anschließend einer Shake-Flask-Validierung unterzogen, und schließlich wurden 17 Stämme mit verbesserten Erträgen im Vergleich zum Elternstamm erhalten. Unter ihnen zeigte der mutierte ADC-17 den größten Anstieg von 57,2 g/L auf 67,04 g/L, was einer Verbesserung von 17,2 % entspricht (Abbildung 6D). Die genetische Stabilität von ADC-17 wurde über vier aufeinanderfolgende Generationen hinweg bewertet. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den vier Generationen beobachtet (p > 0,05), was darauf hindeutet, dass das Hochleistungsmerkmal von ADC-17 über vier aufeinanderfolgende Subkulturen stabil blieb (Abbildung 6E). Diese Ergebnisse zeigen die Effizienz und Zuverlässigkeit der FADS-Plattform, die einen Milchsäuresensor verwendet, um hochproduktive Stämme aus zufälligen Mutantenbibliotheken in einer einzigen Screening-Runde anzureichern.

Abbildung 1: Zusammensetzung der automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattform. (A) Interne Struktur der Plattform. Es besteht aus vier Kernmodulen: druckgesteuerte Flüssigkeitssteuerung, Hochgeschwindigkeits-CMOS-Bildgebung, 488 nm/633 nm Dual-Laser-Fluoreszenzdetektion und ein Host-Steuerungssystem zur Tröpfchenmanipulation und Datenausgabe. (B) Die automatisierte Tropfen-Mikrofluidikplattform-Betriebsplattform. Beschriftete Komponenten umfassen a. Platzierungsplattform, b. Hochgeschwindigkeitskamera, c. Chipelektroden, d. Chipbefestigungsklemme, e. Chipplatzierrille, f. Metallbad, g. Luftpumpe 1: Regelt die Ölphase, h. Luftpumpe 2: Kontrolliert die Probe. Luftpumpe 3: Steuert die Einsaugung der Reagenzien. Abbildung 1A wird mit Biorender erstellt, und eine Urheberrechtslizenz wird bereitgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Experimentelle Verbrauchsgüter. (A) Injektionsrohr: zum Einspritzen der Ölphase, der bakteriellen Probe und der Reagenzlösung. (B) Sammelrohr: zum Sammeln von Tröpfchen und anschließender Kultivierung. (C) Tropfenvorbereitungschip: erzeugt 14 pL Tröpfchen. (D) Tropfen-Mikroinjektionschip: Mikroinjiziert Reagenzien in Tröpfchen. (E) Tröpfchensortierchip: sortiert positive Stämme mittels Elektroden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Wichtige Softwareschnittstellen der automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattform. (A) Einführung der Tropfengenerierungs-Software-Schnittstelle. A. Start: Klicken Sie, um die Tropfengenerierung zu starten. B. Geschwindigkeit: Stelle die Tropfenerzeugungsrate an. C. Größe: Stellen Sie das Tropfenvolumen ein. D. Stopp: Klicken Sie, um die Tropfenerzeugung zu stoppen. (B) Tropfen-Pico-Injektions-Schnittstelle. E. Injektionsvolumen: Stellen Sie das Volumen der Reagenzinjektion ein. F. Fusionskraft: Drei Spannungsstufen (Hoch/Mittel/Niedrig). (C) Einführung der Tropfensortierschnittstelle. G. Laser. Wählen Sie den Lasertyp (488 nm oder 633 nm). H. Datenaufzeichnung. I. Durchbiegungskraft: Drei Spannungsstufen (hoch/mittler/niedrig). J. Sortierschalter: Klicken Sie, um die Tropfensortierung zu starten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Hochdurchsatz-Screening-Workflow basierend auf der automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattform. (A) Mutantenbibliothek durch ARTP-Mutagenese. (B) Tröpfchenbildung und -inkubation. Einzelzellen sind in Picolitre-Tröpfchen unterteilt. (C). Tropfen-Pico-Injektion. In jeden Tropfen wird ein fluoreszierender Sensor mit Pico injiziert. (D) Tröpfchensortierung. Tröpfchen mit hoher Fluoreszenz (was auf eine hohe L-Milchsäureproduktion hinweist) werden durch FADS angereichert. (E) Positive Klonvalidierung in Mikroplatten und Schüttkolben. Abkürzung; FADS = Fluoreszenzaktivierte Tröpfchensortierung. Abbildung 4 wurde mit Biorender erstellt, und eine Urheberrechtslizenz wird bereitgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Charakterisierung des Milchsäuresensors in vitro. (A) Antwortbereich des Milchsäuresensors auf L-Milchsäure. Anregung/Emission = 485/515 nm. Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen Experimenten (n = 3, jeweils mit dreifachen technischen Replikaten). (B) Korrelation mit HPLC. Sechs Fermentationsproben (unterschiedliche Zeitpunkte) wurden jeweils einmal sowohl vom Laktatsensor als auch vom HPLC analysiert. Die lineare Regression ergab R² = 0,9927. Anregung/Emission = 485/515 nm. (C) Milchsäure-Wiederherstellungsexperiment. L-Milchsäure wurde mit 0,5 g/L in ultrareines Wasser und Screeningmedium gesetzt. Die Daten sind mittelwert ± SD (n = 3 unabhängige Experimente). Die Genesungen betrugen 98,39 % (Wasser) und 108,81 % (Screening-Medium), wobei STD < 5 % betrug. Anregung/Emission = 485/515 nm. (D) Optimierung der Erkennungszeit. Der Sensor wurde mit L-Milchsäurestandards (0–0,6 g/L) gemischt und für 0, 5, 10, 15, 20, 25 und 30 Minuten inkubiert. Der höchste R² = 0,990 wurde nach 5 Minuten Mischen erreicht. Die Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten (n = 3). Anregung/Emission = 485/515 nm. (E) Tröpfchenfluoreszenzhistogramm. Mindestens 2000 Tröpfchen pro L-Milchsäurekonzentration wurden analysiert. Detektionskanal: 488 nm, DC (V) = das Spannungssignal, das die Fluoreszenzintensität eines Tröpfchens darstellt. Abkürzung; STD = Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Hochdurchsatz-Screening von B. coagulans mit hoher L-Milchsäureproduktion. (A) Die Dehnungsmorphologie in Tröpfchen wurde bei 0, 2, 4, 6, 8 und 10 Stunden beobachtet. Skalenleiste: 20 μm. Expositionszeit: 100 ms. (B) Veränderungen der Fluoreszenzintensität von Tröpfchen, die B. coagulans enthalten, nach der Inkubation über unterschiedliche Dauern, mit Injektion des Milchsäuresensors. Die Bilder wurden mit einer Belichtungszeit von 2000 ms und 1500 % Verstärkung aufgenommen. Skalenbar: 50 μm. (C) Fluoreszenzintensitätsverteilung der Tröpfchen. Screening-Schwelle: FL-Intensität > 2750 (a.u.). Nachweiskanal: 488 nm (D) L-Milchsäure liefert (g/L) des Elternstamms (ATCC 7050) und repräsentative positive Mutanten. Die Daten sind im Mittelwert ± SD (n = 3 unabhängige Schüttkolben pro Dehnung). p < 0,0001 im Vergleich zum elterlichen Stamm. Der leistungsstärkste Mutant, ADC-17, zeigt einen Anstieg von 17,2 %. (E) Genetische Stabilität der leistungsstärksten B. coagulans ADC-17 über vier aufeinanderfolgende Generationen (1–4). Die L-Milchsäure-Ausbeute wurden durch HPLC nach 24-stündiger Shake-Flask-Fermentation bestimmt. Die Daten sind im Mittelwert ± SD (n = 3 Kolben pro Generation). Einweg-ANOVA zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den Generationen (p > 0,05 ns). Abkürzung; HPLC = Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie; SD = Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Die Reinigung des Laktatsensors eLACCO1.1. Das Protein wurde mit 500 mM Imidazol eluiert und bei -80 °C mit 5 % Glycerol gespeichert. Die Arbeitskonzentration beträgt 0,1 mg/mL, und die Nachweisgrenze liegt bei 2 mg/L. Die ergänzende Abbildung 1 wurde von den Autoren vollständig mit den nativen Zeichenwerkzeugen in Microsoft PowerPoint (einschließlich grundlegender Formen, Linien und Textfeldern) neu erstellt. Es wurden keine Drittanbieter-Icons, Vorlagen oder externe Bildquellen verwendet. Alle Elemente sind Originalwerke der Autoren. Daher erfordert diese Zahl keine zusätzliche Veröffentlichungslizenz. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Wachstumskurve von B. coagulans ATCC 7050. Die Sorte wurde im Samenmedium bei 50 °C kultiviert und bei 200 U/min geschüttelt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD präsentiert (n = 3 unabhängige Kulturen). Die Kultur erreichte etwa bei 12 Stunden die spätlogarithmische Phase, und dieser Zeitpunkt wurde in späteren Experimenten zur Inokulumpräparation genutzt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Kalibrierungskurve von OD₆₀₀ gegenüber der lebensfähigen Zellkonzentration für B. coagulans ATCC 7050. Serielle Verdünnungen einer Mid-Log-Phasenkultur wurden vorbereitet und der OD₆₀₀ gemessen. Die entsprechenden koloniebildenden Einheiten (CFU/mL) wurden bestimmt, indem 100 μL geeigneter Verdünnungen auf Saatmittel-Agarplatten verteilt und bei 50 °C für 24 Stunden inkubiert wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SD präsentiert (n = 3 unabhängige Experimente). Nach dieser Kurve entspricht OD₆₀₀ = 0,5 ungefähr 1 × 10⁸ CFU/mL. Diese Kalibrierung wurde verwendet, um die anfänglichen Zelldichten für die Tröpfchenkapselung zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Lethalitätskurve von B. coagulans ATCC 7050 unter ARTP-Mutagenese. Die Zellen wurden über unterschiedliche Zeiträume mit Heliumplasma ausgesetzt (5, 10, 15, 20, 25, 30 Sekunden). Nach der Bestrahlung wurden die Zellen auf Samenmedium Agar plattiert, und nach 24 Stunden Inkubation bei 50 °C wurden CFU gezählt. Lethalität (%) wurde gemäß Gleichung (2) berechnet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD präsentiert (n = 3 unabhängige Replikate). Der Pfeil zeigt die ausgewählte Mutagenesezeit (20 Sekunden) mit einer Letalitätsrate von etwa 90 % an. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Bestimmung der Effizienz der Einzelzellkapselung durch DAPI-Färbung. B. coagulans ATCC 7050-Zellen wurden mit DAPI gefärbt und in Tröpfchen bei λ = 0,1 eingeschlossen. Insgesamt wurden 2000 Tröpfchen unter Fluoreszenzmikroskopie untersucht, und die Anzahl der Tröpfchen mit 0, 1 oder ≥2 Zellen wurde gezählt. Die beobachtete Effizienz der Einzellenkapselung betrug 11,2 %, was etwas höher ist als die theoretische Poisson-Erwartung (9,0 % für λ = 0,1). Diese Abweichung ist auf Faktoren wie aktive Zellverbreitung, unspezifische DAPI-Färbung kompromittierter Zellen und scherinduzierte Zersetzung kleiner Aggregate während der Tröpfchenbildung zurückzuführen. Skalenleiste: 30 μm. Mindestens 2000 Mikrotröpfchen wurden analysiert. Die Bilder wurden mit einer Belichtungszeit von 2000 ms und 1500 % Verstärkung aufgenommen. Abkürzung; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Stabilität der Speicherung des Sensors.  Zeigt die Fluoreszenzantwort des Sensors, gespeichert bei -80 °C und 5 % Glycerol über vier Wochen. Es wurde kein signifikanter Signalverlust beobachtet, was eine gute Speicherstabilität bestätigt (S. > 0,05). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: Primäre Screening-Ergebnisse von 78 Stämmen, die eine höhere Milchsäureproduktion als die Kontrollgruppe in Deep-Well-Platten zeigen. In diesem primären Screening wurden insgesamt 78 mutierte Stämme mit L-Milchsäureausbeute identifiziert, die die des Mutterstamms überstiegen. Alle Mutantenstammdaten stellen Einzelpunkt-Screening-Ergebnisse ohne biologische Replikationen dar. Der Elternstamm (Kontrollgruppe) wurde zufällig über 24 Tiefbrunnenplatten als Referenz verteilt, und seine Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung über drei unabhängige 24-Tiefbrunnenplatten-Replikaten präsentiert (n = 3). Die y-Achse zeigt die L-Milchsäure-Ausbeute (g/L) für jede Dehnung auf der x-Achse; Fehlerbalken werden nur für die Elterndehnungssteuerung angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Workflow für industrielle mikrobielle Screening, basierend auf einer automatisierten tropfenmikrofluidischen Plattform. Der integrierte Arbeitsablauf umfasst den Aufbau mutierter Bibliotheken, Tröpfchenerzeugung und Einzelzellkapselung, Mikroreaktorkultivierung, Biosensorinjektion, fluoreszenzaktivierte Tröpfchensortierung und die endgültige Validierung der Zielstämme. Mit Hochdurchsatz-Screening eines hocherträglichen, L-Milchsäure-produzierenden B. coagulans als Validierungsfall zeigte dieser Workflow mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Mikroplatten- und Agarplattenmethoden im Kontext der Verbesserung des B. coagulans-Stammes. Was den Screening-Durchsatz und die Effizienz betrifft, nutzt die Plattform mikrofluidische Chips, um parallel Tausende bis Zehntausende von Tröpfchen pro Sekunde zu erzeugen und zu verarbeiten, was eine etwa 10-4-fache Steigerung des Einzelrunden-Screening-Durchsatzes im Vergleich zu traditionellen mikroplattenbasierten^Methoden erreicht. Bei B. coagulans kann der Workflow innerhalb von 4 Stunden 10 6-Tröpfchen screenen, wodurch der Entwicklungszyklus des Stammes von mehreren Wochen auf nur wenige Tage verkürzt und der Fortpflanzungsprozess erheblich beschleunigt wird. Die Sichtwirkungsrate des FADS-Systems beträgt etwa 3 × 10 3-mal^so hoch wie das plattenbasierte Screening-System, wobei die Kosten für Infrastruktur, Arbeitskraft und^{Verbrauchsmaterialien} erheblich reduziert werden. Aufgrund der inhärenten Eigenschaften verschiedener Mikroorganismen ist jedoch eine gezielte Optimierung dieses Standardworkflows erforderlich. Nach 36 Stunden Hefekultivierung führen beispielsweise Änderungen des osmotischen Drucks zu einer Verringerung des Tröpfchenvolumens, was Anpassungen der Inkubationsdauer zur Sicherstellung der Stabilität von Injektions- und Sortiervorgängen^erforderlich macht. Bei filamentösen Pilzen ist es in der Regel notwendig, das Tröpfchenvolumen zu erhöhen, um zu verhindern, dass die Tröpfchenschnittstelle durch Myzelwachstum^15,16 zerbricht oder verschmilzt.

Außerdem ist es aufgrund des ultrakleinen Volumens an Tropfen im Pikolitermaßstab unerlässlich, für jedes Zielprodukt maßgeschneiderte fluoreszierende Biosensoren zu entwickeln. Mehrere klassische fluoreszierende Detektionsreagenzien für Proteasen und kleine Molekülmetaboliten sind bereits kommerziell erhältlich, wie zum Beispiel für Wasserstoffperoxid¹⁷, Glycosidase¹⁸, Ethanol¹⁹ und Glukose²⁰. Dennoch haben chemisch synthetisierte fluoreszierende Sonden begrenzte Typen und neigen dazu, aus Tröpfchen in benachbarte leere Tröpfchen auszutreten, was zu erhöhter Hintergrundfluoreszenz führt. Dies wird hauptsächlich darauf zurückgeführt, dass hydrophobe fluoreszierende Moleküle leicht die Öl-Wasser-Grenzfläche²¹ durchdringen können.

In den letzten Jahren umfassen Biosensoren hauptsächlich zwei Typen: genetisch codierte Biosensoren und auf Transkriptionsfaktoren (TF)-basierten Biosensoren. Genetisch codierte fluoreszierende Biosensoren beziehen sich auf chimäre Proteine, die intrazellulär exprimiert und so konstruiert werden können, dass sie als Sensoren zur Überwachung der Signaltransduktion in vivo dienen. Aufgrund ihrer ausgezeichneten Stabilität, schnellen fluoreszenten Antwort und hohen Spezifität wurden genetisch codierte fluoreszierende Biosensoren in mehreren Szenarien^{eingesetzt 22}. Ein Team setzte den intensitätsbasierten glutamatsensorischen fluoreszenten Reporter (iGluSnFR) in ein mikrofluidisches Tröpfchensortiersystem ein und etablierte so einen Hochdurchsatz-Workflow zur Überprüfung von Bacillus amyloliquefaciens-Mutanten mit verbesserter Glutaminaseproduktion. Diese biosensorbasierte Plattform ermöglichte ein 56-faches Anreicherungsverhältnis und isolierte letztlich eine Variante mit mehr als 47 % Steigerung der Glutaminaseproduktion aus einer 10-köpfigen 5-köpfigen Gesamtgenom-Mutantenbibliothek²³.

Ganzzellige Transkriptionsfaktor-(TF)-basierte Biosensoren sind eine wichtige Klasse von ganzzelligen Biosensoren, die um Transkriptionsfaktoren herum aufgebaut sind. Transkriptionsfaktoren sind eine Klasse von Proteinen, die die Genexpression regulieren, indem sie an bestimmte DNA-Sequenzen^{binden 14}. Einige Transkriptionsfaktoren werden aktiviert, wenn sie an Metaboliten oder exogene Verbindungen binden; diese werden als allosterische Transkriptionsfaktoren (aTFs) bezeichnet. Nach der Aktivierung durchlaufen aTFs konformationelle Veränderungen, die wiederum zu ihrer Dissoziation von oder zur Bindung an die DNA-Sequenz stromaufwärts der Zielgene führen und so die Expression dieser Gene aktivieren oder hemmen. Transkriptionsfaktoren können mit anderen DNA-Elementen kombiniert werden, die häufig in der synthetischen Biologie verwendet werden (wie Promotoren, Ribosomenbindungsstellen, Terminatoren und Reporter-Genen), um TF-basierte Biosensor-Genschaltungen zu konstruieren. Diese genetischen Elemente können die Konzentration verschiedener Liganden in der Zelle oder in der Umgebung erfassen und entsprechend^reagieren. Die Detektion von Erythritol wurde erfolgreich mit einem auf Transkriptionsfaktoren basierenden Biosensor implementiert, der mit einer FADS-Plattform integriert ist und so die Isolierung eines mutierten Stammes mit deutlich verbesserter Erythritolproduktion^ermöglicht. Die Entwicklung dieser beiden Biosensortypen birgt großes Potenzial, die Anwendung von FADS-Plattformen in der mikrobiellen Züchtung zu fördern, die Einschränkungen traditioneller chemischer Sonden zu überwinden und den Umfang der getesteten Zielprodukte zu erweitern.

Zusammenfassend wurde ein standardisierter Hochdurchsatz-Screening-Workflow für industrielle Mikroorganismen vorgestellt. Die Zuverlässigkeit dieses Arbeitsablaufs zeigte sich durch seine erfolgreiche Anwendung bei der Screening von hocherschütternden L-Milchsäure-produzierenden B. coagulans-Stämmen . Dieser Arbeitsablauf bietet eine wertvolle Referenz für zukünftige Forscher, die Hochdurchsatz-Screenings durchführen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	Zur festen Plattenpräparation
Anhydrous Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Reinigen und desinfizieren von Laborbänken und -geräten
Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	ARTP  wurde zur Konstruktion der Mutantenbibliothek für die Stammmutagenese eingesetzt.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	B. coagulans ATCC 7050 wurde als Ausgangsstamm für die Mutagenese und das Ziel für das Hochdurchsatz-Tropfen-Screening verwendet.
Black microplate (96 well)	Corning	3925	Die 96-Well Black Microplate wurde für Lactat-Sensor-Assays und die Bestimmung der Milchsäurekonzentration verwendet.
Calcium carbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	Zur Isolierung von L-Milchsäure-Hyperproduzenten.
Calcium chloride	Sinopharm	10005819	Calciumchlorid wird zur Herstellung von mikrobiellen Kulturmedien verwendet und liefert essentielle Nährstoffe für das mikrobiellen Wachstum.
Calcium L-lactate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	Verwendet als Proben für die Erstellung der Standardkurve im Detektionsprozess.
Centrifuge tube (15 mL)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	Verwendet für bakterielle Flüssigkeitsverdünnung
Collection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	Zum Sammeln von Tropfen und anschließender Kultivierung
Computer	Lenovo	E450	Software-Installation und DREM Cell-Steuerung.
DAPI	Solarbio	c0065	Zum Zellfärben.
Deep-well plate (24-well)	BKMAMLAB	110424008	Für die anfängliche Ertragsüberprüfung von B. coagulans-Mutanten mithilfe von Deep-Well-Platten
Demulsifier (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol)	MACKLIN	H817022	Der Tropfen-Demulgator wird verwendet, um die Wasser-in-Öl-Mikrotropfen aufzubrechen und die internen Zellen, Stämme oder das Übernatant für die anschließende Erkennung und Analyse freizusetzen.
D-Glucose	Solarbio	G8150-1000	D-Glucose wird zur Herstellung von mikrobiellen Kulturmedien verwendet und liefert essentielle Nährstoffe für das mikrobiellen Wachstum.
Diammonium hydrogen citrate	Solarbio	D9950	Diammoniumhydrogencitrat wird zur Herstellung von mikrobiellen Kulturmedien verwendet und liefert essentielle Nährstoffe für das mikrobiellen Wachstum.
Dipotassium hydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	P8281	Dipotassiumhydrogenphosphat wasserfrei wird zur Herstellung von mikrobiellen Kulturmedien verwendet und liefert essentielle Nährstoffe für das mikrobiellen Wachstum.
DREM Software version	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	Zur Steuerung des DREM-Zellinstruments. Die DREM-Software ist ein proprietäres kommerzielles Programm, das ausschließlich für das DREM Cell-Instrument der Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. bestimmt ist. Es hat keinen öffentlichen offiziellen Zugang oder Download-URL und wird nur im Rahmen der Autorisierung mit dem Instrument vertrieben.
Droplet Entrapping Microfluidic Cell-sorter (DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	Es wurde für die Hochdurchsatz-Einzelzell-Einkapselung und -Sortierung verwendet, um schnell hochproduktive Stämme aus der Mutantenbibliothek zu screenen.
Droplet generation chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	Der Tropfen-Erzeugungs-Chip wird verwendet, um monodisperse Pikoliterskala (pL)-Tropfen für die Einzelzell-Kapselung zu erzeugen.
Droplet injection chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	Der Tropfen-Mikroinjektions-Chip wird verwendet, um eine präzise und spurenhafte Reagenz-Injektion in vorgeformte Tropfen für anschließende biochemische Reaktionen zu erreichen.
Droplet sorting chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	Der Tropfen-Sortier-Chip wird verwendet, um Ziel-Tropfen, die hochproduktive Zellen enthalten, basierend auf Fluoreszenzsignalen zu sortieren.
Erlenmeyer shake flask (250 mL)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	Verwendet für die Verifizierung der Skalierung der Kultur von B. coagulans-Mutanten nach primärer Bildschirmung mit Deep-Well-Platten, um die Stabilität und Reproduzierbarkeit hochproduktiver Stämme zu bestätigen.
Filter Membranes (0.22 μm)	Merck	SLGPR33RB	Verwendet für die Fermentationsbrühe-Filtration.
Fluorescence inverted microscope	Olympus	IX73	Olympus IX73 Fluoreszenz-invertiertes Mikroskop wurde verwendet, um die bakterielle Morphologie innerhalb der Tropfen zu beobachten
Fluorinated Oil	Bio-Rad	1864006	Fluoriertes Öl dient als kontinuierliche Phase in der Tropfen-Mikrofluidik, um stabile, monodisperse und nicht-störende Wasser-in-Öl-Mikrotropfen zu erzeugen, die die Einzelzell-Kultur und -Screening unterstützen.
High Performance Liquid Chromatography column	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	Es wird verwendet, um Milchsäure von anderen Komponenten in der Fermentationsbrühe gemäß ihren unterschiedlichen Retentionseigenschaften zu trennen, um die genaue quantitative Erkennung von Milchsäure zu ermöglichen.
High-Performance Liquid Chromatography	Shimadzu	228-34001-02	HPLC wird für die quantitative Erkennung und Analyse von L-Milchsäure in Fermentationsproben verwendet.
Injection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-1N	Zum Einspritzen der Ölphase, der Proben-Bakteriensuspension und der Reagenzlösung
Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate
Laminar flow hood	Shanghai SHP Instrument Equipment Co., Ltd	SP20230501	Verwendet für aseptische Operationen bei der Kultur und Fermentation von B. coagulans.
Magnesium sulfate heptahydrate	Sinopharm	10013018	Hefeextrakt wird zur Herstellung von mikrobiellen Kulturmedien verwendet und liefert essentielle Nährstoffe für das mikrobiellen Wachstum.
Manganese sulfate monohydrate	MACKLIN	M813856	Mangansulfat-Monohydrat wird zur Herstellung von mikrobiellen Kulturmedien verwendet und liefert essentielle Nährstoffe für das mikrobiellen Wachstum.
Microplate reader