Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

Zusammenfassung

Primäre dissoziiert Mittelhirn Dopamin Zellkulturen erlauben die Untersuchung der präsynaptischen Eigenschaften des Dopamin-Neuronen. Sie können verwendet werden, um Echtzeit-Freisetzung von Dopamin Kinetik und Protein / mRNA-Spiegel von Regulatoren der Dopamin-Exozytose zu überwachen. Hier zeigen wir Ihnen, wie Sie diese Kulturen von Nagetier Neugeborenen zu generieren.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit zur primären Zellkulturen von Dopamin-Neuronen erstellen können für die Untersuchung der präsynaptischen Eigenschaften des Dopamin-Neuronen isoliert von systemischen Eingabe von anderswo im Gehirn. In unserem Labor verwenden wir diese Neuronen zu Dopamin Freisetzungskinetik mit Kohlefaser Amperometrie sowie Expression von Dopamin-Genen und Proteinen mittels quantitativer PCR und Immunzytochemie beurteilen. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie wir diesen Kulturen zu generieren von Nagetier Neugeborenen.

Der Prozess umfasst mehrere Schritte, einschließlich der Beschichtung von kortikalen Gliazellen Astrozyten, die Konditionierung der neuronalen Zellkultur-Medien von den Gliazellen Substrat, das Sezieren des Mittelhirns bei Neugeborenen, die Aufschluss, Extraktion und Abscheidung von Dopamin-Neuronen und die Zugabe von neurotrophen Faktoren zu sicherzustellen, das Überleben der Zelle.

Die Anwendungen für ein solches Präparat enthalten Elektrophysiologie, Immunzytochemie, quantitative PCR, Video-Mikroskopie (dh in Echtzeit vesikulären Fusion mit der Plasmamembran), die Lebensfähigkeit der Zellen Assays und andere toxikologische Bildschirme.

Protokoll

Vorbereitung Vor der Kultur

Hinweis: ** Gliazellen muss weit im Voraus beschichtet werden, so dass sie Zeit sich zu vermehren und decken den Boden der Küche haben. Bei Mäusen, die mit atypischen oder experimentelle genetische Hintergrund, stellen Sie sicher, Glia-und Nervenzellen Kulturen in Form von Genotyp entsprechen.

Hinweis: ** 1-7 Tage vor der Dissektion, bereiten Sie frisches neuronalen Medium und ersetzen Sie die Gliazellen Medium in den Schalen mit 2ml.

Hinweis: ** Am Tag vor der Dissektion, müssen die folgenden Elemente, um unter UV-Licht über Nac....

Diskussion

Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen feine Auflösung von morphologischen und neurochemischen Merkmalen der zentralen Dopamin-Neuronen, die sonst nicht in einen systemischen oder in vivo-Ansatz zur Verfügung.

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Materialien

Die Materialien werden in das Protokoll Text enthalten.