Dieses Video zeigt das Protokoll für die methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP). MeDIP ist eine zweitägige Verfahren, die selektiv extrahiert methylierte DNA-Fragmente aus einer genomischen DNA-Probe unter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität für 5-Methylcytosin (anti-5 mC).
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Methodenartikel
Methylierte DNA Immunpräzipitation
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Identifizierung von DNA-Methylierungs-Muster ist ein übliches Verfahren in der Studie der Epigenetik, wie Methylierung ist bekannt, dass mit erheblichen Auswirkungen auf die Genexpression haben, und ist mit der normalen Entwicklung sowie Krankheit beteiligt
Protokoll
DNA-Extraktion und Probenvorbereitung
DNA aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Proben (kultivierten Zellen, Frischplasma sowie Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten Gewebe) kann für MeDIP verwendet werden. Es ist wichtig, hochreine DNA ohne assoziierte Proteine wie Histone verwenden. Es ist auch wichtig, so viel wie möglich zu entfernen RNA aus der Probe, wie es mit den beiden DNA-Quantifizierung und Antikörperbindung stören können. Die DNA-Menge für MeDIP verwendet werden kann von 200 ng bis 1 ug je nach der Menge der DNA verfügbaren Bereich. Um dies zu demonstrieren Protokoll wird 1 pg DNA verwendet werden. Das folgende Protokol....
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Diskussion
Es gibt ein wachsendes Bewusstsein für die wichtige Rolle der DNA-Methylierung spielt in Krankheit, sind daher die Entwicklung von Assays, um diese Änderung zu messen zunehmend an Bedeutung 3, 12, 13. Die MeDIP Technik ist ein Werkzeug für das Screening zugänglich sowohl den gesamten Genoms und Locus-spezifische Level 6, 7. Diese Technik bietet eine schnelle Ansicht von DNA-Methylierungs-Ebenen mit begrenzten Mengen an Ausgangs-DNA und ermöglicht eine einfache Vergleiche zwischen verschiedenen Quel.......
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Danksagungen
Wir wünschen den Mitgliedern des Brown und Lam-Labors für ihre Teilnahme an der kritischen Beurteilung dieses Video und Artikel danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus der Canadian Institutes for Health Research und Michael Smith Foundation for Health Research unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter-Sonikator | Werkzeug | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1,7-ml-SafeSeal-Mikrozentrifugenröhrchen | Sonstiges | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND-3300-Spektrophotometer | Werkzeug | NanoDrop | ||
| Primärantikörper: Anti-5’-Methylcytosin-Maus-mAb | Reagenz | Calbiochem | 162 33 D3 | |
| Sekundärantikörper: Dynabeads M-280 Schaf-anti-Maus-IgG | Reagenz | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetischer Röhrchenständer | Werkzeug | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Werkzeug | Labnet International | H5500 | |
| IP-Puffer | 10 mM NaPO4 pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05 % Triton X-100. Bei Raumtemperatur gelagert | |||
| Verdauungspuffer | 10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5 % SDS, 50 mM NaCl |
Referenzen
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilbe....
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Nachdrucke und Genehmigungen
