Aseptische Techniken in den Umweltwissenschaften

Die aseptische Technik ist eine grundlegende Fähigkeit in der Mikrobiologie und hat entscheidende Anwendungen in der Umweltforschung.

Wenn mikrobiologische Kulturen kontaminiert sind, könnten die Zeit-, Arbeits- und finanziellen Kosten, die ein Labor für die "Reinigung" oder den Austausch der Kulturen, insbesondere seltener Isolate aus einzigartigen Umgebungen, benötigen würde, sehr hoch und unerschwinglich sein, und einige Proben können unersetzlich sein.

Der richtige Einsatz aseptischer Techniken verringert die Wahrscheinlichkeit einer bakteriellen und pilzlichen Kontamination von Reagenzien, Nährmedien und Umweltproben und vermeidet auch Kreuzkontaminationen zwischen Proben. Es ist auch eine Sicherheitsmaßnahme, die die potenzielle Übertragung von Mikroben auf den Experimentator verringert, was besonders bei der Arbeit mit Krankheitserregern wichtig ist.

In diesem Video werden die Prinzipien der Asepsis vorgestellt. mehrere wichtige Techniken zur Aufbewahrung steriler Reagenzien und Kulturen; und schließlich einige ihrer Anwendungen in der Umweltwissenschaft.

Das Ziel der Anwendung aseptischer Techniken ist es, eine sterile Arbeitsumgebung, Ausrüstung und Reagenzien zu schaffen und zu erhalten, um die Kontamination biologischer Proben zu minimieren. Häufige Kontaminationsquellen sind Mikroorganismen in der Luft, Mikroben, die auf dem Labortisch oder in der Laborausrüstung vorhanden sind, sowie Mikroorganismen aus den Haaren, dem Körper und der Kleidung des Forschers.

Zwei Arten von Mitteln sind von zentraler Bedeutung, um Kontaminationen im Labor zu entfernen oder zu verhindern: Desinfektionschemikalien und Wärme. Lösungen wie 70%iges Ethanol und verdünntes Bleichmittel werden häufig zur Desinfektion von Geräten, Arbeitsflächen und Handschuhen der Experimentatoren verwendet, bevor aseptische Arbeiten durchgeführt werden.

Gleichzeitig können Mikroben auf oder in Werkzeugen, Glaswaren und flüssigen Medien in einem Autoklaven hitzeabgetötet werden, bei dem es sich um eine Kammer handelt, in der der Inhalt durch Einwirkung von Hochtemperatur-Druckdampf sterilisiert wird. Darüber hinaus können Werkzeuge wie Glasstäbe, die für die Aufstrichbeschichtung verwendet werden, und Impfösen aus Metall mit einer Flammenquelle, wie z. B. einem Bunsenbrenner, wärmesterilisiert werden.

Der Einsatz einer Flammenquelle ist auch eine der gängigsten Methoden, um eine aseptische Arbeitsumgebung zu schaffen. Die Hitze der Flamme bewirkt eine Luftkonvektion, die einen Aufwind erzeugt, der alle Luftverunreinigungen aus der Umgebung des Brenners abhebt und ein "steriles Feld" schafft, in dem aseptische experimentelle Arbeiten durchgeführt werden können.

Nachdem Sie nun die Prinzipien hinter aseptischen Techniken verstanden haben und warum sie wichtig sind, gehen wir ein Protokoll für die Schaffung einer aseptischen Arbeitsumgebung, die Herstellung steriler Wachstumsmedien und den aseptischen Transfer von Bakterien zwischen verschiedenen Kultivierungsbedingungen durch.

Bevor der Experimentator mit der aseptischen Arbeit beginnt, ist es wichtig, dass er die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA) anlegt. Dies dient sowohl dazu, zu verhindern, dass der Experimentator die Proben und Laborkulturen kontaminiert, als auch die Übertragung potenziell pathogener Mikroben auf den Forscher. Zu den PSA-Artikeln gehören ein Laborkittel, Handschuhe und eine Schutzbrille.

Der nächste Schritt besteht darin, die Wachstumsmedien, die für die Kultivierung der mikrobiellen Proben verwendet werden sollen, ordnungsgemäß zu sterilisieren und zu lagern. Wiegen Sie zunächst die richtige Menge an festen Mediumkomponenten ab und fügen Sie sie dem vom Hersteller angegebenen richtigen Volumen des flüssigen Lösungsmittels, wie z. B. deionisiertem Wasser, in einen autoklavierbaren Behälter hinzu. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu, stellen Sie den Behälter auf ein Heizplattenrührwerk und lösen Sie die festen Mediumkomponenten bei geringer Hitze und unter Rühren auf.

Schließen Sie die mittleren Behälter. Wenn Sie ein Glasgefäß mit Schraubverschluss verwenden, achten Sie darauf, den Deckel nicht vollständig festzuziehen, da sich die Luft in den Gefäßen durch das Erhitzen während des Autoklavierens ausdehnt und entweichen muss. Ohne Entweichen könnte das Gas das Gefäß zum Platzen bringen. Kleben Sie ein Stück Autoklavenband auf die Gefäße und autoklavieren Sie das Medium gemäß den Anweisungen des Herstellers, z. B. 20 min bei 121 °C. Vergewissern Sie sich nach dem Autoklavieren, dass die Streifen auf den Autoklavenbändern schwarz geworden sind, was darauf hinweist, dass die richtige Temperatur erreicht wurde.

Lassen Sie flüssige Wachstumsmedien auf Raumtemperatur abkühlen und lagern Sie sie gegebenenfalls bei Raumtemperatur oder gekühlt. Feste Wachstumsmedien auf Agarbasis auf ca. 50 μm abkühlen lassen C, dann in sterile Petrischalen gießen. Lassen Sie den Agar abkühlen und fest werden, bevor Sie ihn bei der richtigen Temperatur lagern.

Bei Medien, die aufgrund des Vorhandenseins von wärmeempfindlichen Komponenten nicht autoklaviert werden können, ist die Filtersterilisation mit einem 0,22-μm-Filter durchzuführen.

Eine Kerntechnik in der Mikrobiologie ist der aseptische Transfer von Bakterienkulturen zwischen verschiedenen Wachstumsmedien, sowohl festen als auch flüssigen. Reinigen Sie die Oberfläche des Labortisches vor Beginn mit einem Desinfektionsmittel. Dies senkt das Risiko einer Kontamination von Kulturen oder sterilen Medien.

Beim Transfer von Bakterienkulturen wird in der Regel ein Werkzeug verwendet, das als Impfschlaufe bezeichnet wird und vor der Verwendung durch Erhitzen in einer Flamme sterilisiert werden muss.

Schalten Sie eine Flammenquelle ein. Führen Sie die Impfschlaufe langsam durch die Spitze der Flamme. Die Schleife wird glühend heiß. Um eine Bakterienkolonie von einer festen Agarplatte zu übertragen, öffnen Sie die Petriplatte leicht und klopfen Sie die heiße Impfschlaufe vorsichtig auf einen leeren Teil der Agaroberfläche, um eine Hitzetötung der Bakterien zu vermeiden. Kratzen Sie eine einzelne Kolonie mit der Impfschlaufe ab und schließen Sie die Platte.

Um Bakterien aus einem flüssigen Wachstumsmedium zu übertragen, entfernen Sie die Kappe vom Kulturbehälter. Um eine Kontamination zu vermeiden, vermeiden Sie es, die Kappe auf die Bank zu setzen. Führen Sie die Öffnung des Behälters 2-3 Mal durch den heißesten Teil der Flamme. Berühren Sie dann vorsichtig die heiße, sterilisierte Impfschlaufe auf der Innenseite des Behälters und lassen Sie sie abkühlen, bevor Sie sie in die Brühekultur einsetzen. Entfernen Sie eine Schlaufe der Kultur und schließen Sie sofort die Kappe.

Um die gewonnenen Bakterien in ein steriles Wachstumsmedium zu übertragen, entfernen Sie den Deckel von einem Behälter mit der sterilen Brühe und führen Sie die Öffnung des Behälters 2-3 Mal durch die Flamme. Senken Sie dann die Impfschlaufe vorsichtig in das Medium ab und rühren Sie vorsichtig um, um die Bakterien freizusetzen. Schließen Sie sofort die Kappe. Sterilisieren Sie die Impfschlaufe nach Gebrauch.

Wenn Sie Bakterien auf eine sterile Agarplatte übertragen, öffnen Sie den Deckel einer frischen Petriplatte mit ungeimpftem Agar. Streichen Sie die Impfschlaufe mit der Bakterienkultur über einen Sektor des Agars hin und her. Sterilisieren Sie die Schlaufe und kühlen Sie sie ab, indem Sie einen leeren Teil des Agars berühren, dann machen Sie einen weiteren Streifen auf dem Agar in einem stumpfen Winkel zum ersten Streifen, achten Sie darauf, den ersten Streifen bei den ersten 1-2 Zügen zu kreuzen, aber vermeiden Sie es, den ersten Streifen bei den folgenden Zügen zu berühren. Wiederholen Sie die Sterilisation und das Schlieren noch 2 Mal. Schließen Sie die Petriplatte und sterilisieren Sie die Impfschlaufe.

Nach der Inokulation sollte die Brühe oder Agarplatte dann bei der idealen Wachstumstemperatur für den jeweiligen Mikroorganismus inkubiert werden, um eine lebensfähige Kultur zu erhalten. Auf festem Untergrund wäre ein Rasen oder ein kontinuierlicher Bakterienstrang auf dem Agar sichtbar, der von den ersten beiden Streifen bedeckt ist, aber einzelne Kolonien sollten auf dem letzten Streifen erhalten werden. Schlechte aseptische Techniken würden zum Wachstum von Schimmel und anderen Verunreinigungen auf der Platte führen.

Aseptische Techniken sind bei vielen Experimenten mit mikrobiellen Proben aus der Umwelt wichtig. In dieser Studie isolierten die Forscher Bakteriophagen, bei denen es sich um bakterieninfizierende Viren handelt, aus dem weit verbreiteten Bodenbakterium Arthrobacter. Arthrobacter-Kulturen wurden zunächst unter aseptischen Bedingungen gezüchtet. Die Bodenproben wurden dann gewaschen und in Phagenpuffer filtriert, und die Phagenlösung wurde mit der Bakterienkultur vermischt und auf Agarplatten plattiert. Auf der Platte bildete sich ein Bakterienrasen, aber an den Stellen, an denen das Virus die Bakterien infiziert und abgetötet hatte, gab es Lichtungen oder "Plaques". Der Phagen könnte dann für weitere Studien von diesen Plaques gereinigt werden.

Neben der Verwendung von Bunsenbrennern können aseptische Arbeitsumgebungen auch an speziellen Arbeitsplätzen, den sogenannten Laminar-Flow-Hauben, aufrechterhalten werden, die einen gerichteten Luftstrom und Filter verwenden, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Hier arbeiteten die Wissenschaftler in einer Strömungshaube, um potenziell pathogene Bakterien und Viren aus Wasserproben zu isolieren. Diese Isolate wurden dann zusammen mit Amöben kultiviert. Da Amöben normalerweise Bakterien fressen oder "phagozytieren", können alle Bakterien, die in der Lage waren, der Amöbenverdauung zu widerstehen und in diesen Organismen zu verbleiben, möglicherweise auch in menschlichen Zellen lebensfähig bleiben und Krankheiten verursachen.

Schließlich ermöglichen sterile Bedingungen eine detaillierte Untersuchung ökologischer Mechanismen wie der Bildung von Wurzelknöllchen bei Hülsenfrüchten - mit Bakterien gefüllte Organe, die Luftstickstoff in Ammoniak "fixieren", das von der Pflanze für das Wachstum verwendet wird. Hier schufen die Forscher "Mikrokosmen" zur Untersuchung des Knötchenbildungsprozesses mit gekerbten Petriplatten mit pflanzlichem Wachstumsmedium, setzten Setzlinge hinein und impften die Sämlinge mit knöllchenbildenden Rhizobienbakterien. Das aseptische Milieu der Strömungshaube verhindert eine Kontamination der Kulturen mit anderen Bakterien oder Pilzen.

Sie haben gerade das Video von JoVE über aseptische Techniken in den Umweltwissenschaften gesehen. Sie sollten jetzt verstehen, warum aseptische Arbeitsbedingungen wichtig sind; wie man mikrobiologische Experimente aseptisch durchführt; und einige Anwendungen aseptischer Techniken in der Umweltforschung. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!