2.2: Aseptische Techniken in den Umweltwissenschaften

1. Vorbereitung für aseptische arbeiten

1. Zu erhalten und PPE Folgendes gelten: Laborkittel, Latex oder Nitril-Handschuhe (ohne Risse oder Löcher) und Schutzbrille (Abbildung 1). Binden Sie für Sicherheit bei der Verwendung von offenen Flammen wieder lange Haare.
   
   Abbildung 1: PPE: einen Laborkittel, Latex-Handschuhe und Schutzbrille.
2. Ein zweiter wichtiger Aspekt der aseptische Technik ist die richtige Sterilisation und Lagerung von Medien/Reagenzien im Labor verwendet werden. Bereiten Sie flüssige Brühe Medium (z.B. tryptic Soja Brühe) und Agar-basierte Medien (z. B.R2A) durch wiegen die richtige Menge an getrockneten Basispulver, die die entsprechende Menge an deionisiertes Wasser hinzugefügt wird.
3. Lösen Sie für das Medium Brühe des Pulvers auf einer heißen Platte mit schwacher Hitze angewendet auf, und verzichten Sie der Flüssigkeit entweder in 100 mL Volumen in Glaskolben Schraubverschluss oder in 10 mL Volumen in Glasröhren Schraubverschluss Test. Mit einer magnetischen rühren, rühren Sie die Agarose-Medium auf der heißen Platte Rührer, bis das Pulver vollständig aufgelöst ist.
4. Autoklaven-Band für die Container und Autoklaven die Medien gemäß den Anweisungen des Herstellers (z.B.20 min bei 121 ° C) gelten (Abbildungen 2 und 3). Beachten Sie, dass die Farbe der Streifen auf dem Autoklav-Band von weiß (Pre-Autoklav) bis schwarz (Post-Autoklav) ändern sollte. Obwohl die Farbe zu ändern in der Regel zeigt, dass die Sterilisation erfolgreich war, prüft Sterilität mit Spore-Streifen-Kits durchgeführt werden kann, um zu überprüfen, den Autoklavieren Prozess.
   
   Abbildung 2: Autoklav Band auf Material angewendet wird.
   
   Abbildung 3: Beachten Sie die farbliche Veränderung der Streifen auf dem Autoklaven Band von weiß (Pre-Autoklav) bis schwarz (Post-Autoklav).
5. Die flüssigen Brühen auf Raumtemperatur, abkühlen und dann bei Raumtemperatur lagern oder bei 4 ° c gekühlt
6. Cool das Agarose-Medium indem man den Behälter in ein Wasserbad legen auf ~ 50 ° C. Sobald Sie abgekühlt, können die Medien in sterile Petrischalen gegossen werden. Können Sie Mittel-und abkühlen und erstarren, dann für die Lagerung bei Temperaturen, die vom Hersteller angegebenen konsolidieren.
7. Es gibt mehrere Sorten von Kulturmedien, die autoklaviert werden können, da die hohen Temperaturen kritische Inhaltsstoffe beeinträchtigen. Sterilisieren diese Filter-Sterilisation mit einem Vakuumfiltration System mit 0,22 µm Filter, gefolgt von Lagerung bei geeigneten Temperaturen erfordern.
8. Desinfizieren Sie vor arbeiten an der Tischplatte die Oberfläche mit einer geeigneten Lösung (z.B. 500 ppm Bleichmittel). Dies senkt das Risiko von Verunreinigungen von der Arbeitsfläche auf Kulturen und sterilen Medien übertragen.
9. Schalten Sie um einem sterilen Bereich zu etablieren, ein Bunsenbrenner. Die Flamme am besten geeignet für Sterilisation Metall Schleifen impfen ist eine intensive blaue Flamme, mit einem endgültigen blauen Kegel in der Mitte (Abbildung 4) beobachtet.
   
   Abbildung 4: Eine Übertragung von Keimen von einer Petri-Platte anzeigen Wachstum von einem kultivierten isolieren zu einer anderen UN-beimpften Petri-Platte mit einem Wachstum auf Agar-Basis-Medium.
10. Gehen Sie langsam die Impfkeimen Schleife durch das heißeste Teil der Flamme (Spitze des Kegels blau). Die Schleife sollte zum Zwecke der Sterilisation heiß rot.

2. bakterielle Transfers: Von Petri Petri Platte Platte

1. Ein Szenario der Übertragung von Bakterien ist von einer Petri-Platte anzeigen Wachstum einer kultivierten isolieren, eine andere, sterile Petri-Platte mit einem Wachstum auf Agar-Basis-Medium.
2. Um zu Beginn öffnen Sie leicht, enthält die reinen Bakterienkultur Petri-Platte, und klopfen Sie leicht die heissen, sterilisierte Impfkeimen Schleife auf die Agar-Oberfläche.
3. Rufen Sie einer isolierten Kolonie von der Oberfläche der Platte mit der gekühlten Impfkeimen Schlaufe ab, und schließen Sie die Petri-Platte.
4. Führen Sie eine Ader für die Isolierung mit einer frischen Petri-Platte mit Nährmedium mit den Deckel leicht geöffnet.
5. Sterilisieren Sie für jeden Teil des Streifens Isolierung (insgesamt pro Platte 3) Flamme-die Impfkeimen Schleife nur vor Gebrauch. Auch, Sterilisieren Sie Flamme-die Schleife nur, nachdem die letzte Streifen durchgeführt wird, um die Verunreinigung von der Arbeitsfläche und als Gegenleistung für andere im Labor, die möglicherweise später verwenden oder kommen in Kontakt mit den Impfkeimen Schleifen zu verhindern.
6. Legen Sie die gestreiften Platten in einem Inkubator für Wachstum über Nacht.

3. bakterielle Transfers: Von Bouillonkultur Petri Platte

1. Ein zweites Szenario der Übertragung von Bakterien ist eine Bouillonkultur Wachstum, wie in der Regel durch Trübung, mit einer sterilen Petri-Platte mit Wachstumsmedium ausstellen.
2. Entfernen Sie die Kappe aus dem Reagenzglas (oder Kolben), enthält die reinen Bakterienkultur, und übergeben Sie die Öffnung des Behälters 2-3 X durch die heißeste Teil der Flamme. Um Verunreinigungen zu vermeiden, legen Sie nicht die Kappe nach unten auf die Tischplatte.
3. Setzen Sie vorsichtig die sterilisierte Impfkeimen Schleife in die Tube/Flasche, und drücken Sie leicht gegen die Seite des Behälters vor dem Einlegen in die Bouillonkultur abkühlen lassen.
4. Entfernen einer Impföse Bouillonkultur (Abbildung 5), und die Verschlusskappe wieder sofort.
   
   Abbildung 5: Eine Impföse Bouillonkultur.
5. Führen Sie eine Ader für die Isolierung mit einer frischen Petri-Platte mit Nährmedium mit den Deckel leicht geöffnet.
6. Sterilisieren Sie für jeden Teil des Streifens (insgesamt pro Platte 3) Flamme-die Impfkeimen Schleife nur vor Gebrauch. Auch, Sterilisieren Sie Flamme-die Schleife nur, nachdem die letzte Streifen durchgeführt wird, um zu verhindern, dass Verunreinigungen von der Arbeitsfläche und als Gegenleistung für andere im Labor, das später die Impfkeimen Schleifen verwenden dürfen.
7. Legen Sie die gestreiften Platten zur Isolierung in einem Inkubator für Wachstum über Nacht.

4. bakterielle Transfers: Von Petri Platte mit Wachstum, sterilen flüssigen Medium

1. Ein drittes Szenario der Übertragung von Bakterien ist von einer Petri-Platte mit einem isolierten Kultur Streifen, eine Tube/Flasche mit steriler Flüssigkeit Wachstumsmedium.
2. Leicht öffnen Sie die Petri-Platte mit der reinen Bakterienkultur und Abkühlen der heißen Impfkeimen Schleife durch Antippen sanft auf die Agar-Oberfläche.
3. Rufen Sie einer isolierten Kolonie von der Oberfläche der Platte mit der gekühlten Impfkeimen Schlaufe ab, und schließen Sie die Petri-Platte.
4. Entfernen Sie die Kappe aus dem Reagenzglas (oder Kolben) mit der sterilen Flüssigkeit Wachstumsmedium, und übergeben Sie die Öffnung des Behälters 2 bis 3 Mal durch die heißeste Teil der Flamme. Um Verunreinigungen zu vermeiden, stellen Sie nicht die Kappe nach unten auf die Benchtop.
5. Setzen Sie die extrahierte Kolonie vorsichtig in das flüssige Brühe Medium, und schütteln Sie sanft die Schleife um die Bakterien zu befreien. Sofort die Verschlusskappe.
6. Sterilisieren Sie Flamme-Impfkeimen Schleife zur Vermeidung von Kontamination von der Arbeitsfläche und als Gegenleistung für andere im Labor, das später die Impfkeimen Schleifen verwenden dürfen.
7. Stelle die Flasche in einem Inkubator für Wachstum über Nacht.
8. Entfernen Sie die Flasche aus Inkubation am nächsten Tag. Führen Sie eine Verdünnungsreihe um die Kultur aufgelistet werden.
9. Platte die Verdünnungen aus der Serie auf Nährmedien Agarose, und die Platten über Nacht inkubieren.
10. Entfernen Sie am nächsten Tag die Platten, und beobachten Sie für jegliche Kontamination.

(5) bakterielle Transfers: Von Bouillonkultur, Sterile flüssige Wachstumsmedium

1. Eine vierte Szenario der Übertragung von Bakterien ist eine Bouillonkultur Wachstum, eine Tube/Flasche mit steriler Flüssigkeit Wachstumsmedium ausstellen.
2. Entfernen Sie die Kappe aus dem Reagenzglas (oder Kolben), enthält die reinen Bakterienkultur, und übergeben Sie die Öffnung des Behälters zweimal durch das heißeste Teil der Flamme. Um Verunreinigungen zu vermeiden, legen Sie nicht die Kappe nach unten auf die Tischplatte.
3. Setzen Sie vorsichtig die Impfkeimen Schleife in die Tube/Flasche, und drücken Sie leicht gegen die Seite des Behälters vor dem Einlegen in die Bouillonkultur abkühlen lassen.
4. Entfernen einer Impföse Bouillonkultur und sofort die Verschlusskappe.
5. Entfernen Sie die Kappe aus dem Reagenzglas (oder Kolben) mit der sterilen Flüssigkeit Wachstumsmedium, und übergeben Sie die Öffnung des Behälters zweimal durch das heißeste Teil der Flamme. Um Verunreinigungen zu vermeiden, legen Sie nicht die Kappe nach unten auf die Tischplatte.
6. Setzen Sie vorsichtig den extrahierten Impföse in das sterile flüssige Brühe Medium, und schütteln Sie sanft die Schleife um die Bakterien zu befreien. Sofort die Verschlusskappe.
7. Sterilisieren Sie Flamme-Impfkeimen Schleife (Abbildung 6) zur Vermeidung von Kontamination von der Arbeitsfläche und als Gegenleistung für andere im Labor, das später die Impfkeimen Schleifen verwenden dürfen.
   
   Abbildung 6: Impfen Schleife drehen rot heiß und mit dem Bunsenbrenner sterilisiert werden.
8. Stelle die Flasche in einem Inkubator für Wachstum über Nacht.
9. Entfernen Sie die Flasche aus Inkubation am nächsten Tag. Führen Sie eine Verdünnungsreihe um die Kultur aufgelistet werden.
10. Platte die Verdünnungen aus der Serie auf Nährmedien Agarose, und die Platten über Nacht inkubieren.
11. Entfernen Sie am nächsten Tag die Platten, und beobachten Sie für jegliche Kontamination.

Die aseptische Technik ist eine grundlegende Fähigkeit in der Mikrobiologie und hat entscheidende Anwendungen in der Umweltforschung.

Wenn mikrobiologische Kulturen kontaminiert sind, könnten die Zeit-, Arbeits- und finanziellen Kosten, die ein Labor für die "Reinigung" oder den Austausch der Kulturen, insbesondere seltener Isolate aus einzigartigen Umgebungen, benötigen würde, sehr hoch und unerschwinglich sein, und einige Proben können unersetzlich sein.

Der richtige Einsatz aseptischer Techniken verringert die Wahrscheinlichkeit einer bakteriellen und pilzlichen Kontamination von Reagenzien, Nährmedien und Umweltproben und vermeidet auch Kreuzkontaminationen zwischen Proben. Es ist auch eine Sicherheitsmaßnahme, die die potenzielle Übertragung von Mikroben auf den Experimentator verringert, was besonders bei der Arbeit mit Krankheitserregern wichtig ist.

In diesem Video werden die Prinzipien der Asepsis vorgestellt. mehrere wichtige Techniken zur Aufbewahrung steriler Reagenzien und Kulturen; und schließlich einige ihrer Anwendungen in der Umweltwissenschaft.

Das Ziel der Anwendung aseptischer Techniken ist es, eine sterile Arbeitsumgebung, Ausrüstung und Reagenzien zu schaffen und zu erhalten, um die Kontamination biologischer Proben zu minimieren. Häufige Kontaminationsquellen sind Mikroorganismen in der Luft, Mikroben, die auf dem Labortisch oder in der Laborausrüstung vorhanden sind, sowie Mikroorganismen aus den Haaren, dem Körper und der Kleidung des Forschers.

Zwei Arten von Mitteln sind von zentraler Bedeutung, um Kontaminationen im Labor zu entfernen oder zu verhindern: Desinfektionschemikalien und Wärme. Lösungen wie 70%iges Ethanol und verdünntes Bleichmittel werden häufig zur Desinfektion von Geräten, Arbeitsflächen und Handschuhen der Experimentatoren verwendet, bevor aseptische Arbeiten durchgeführt werden.

Gleichzeitig können Mikroben auf oder in Werkzeugen, Glaswaren und flüssigen Medien in einem Autoklaven hitzeabgetötet werden, bei dem es sich um eine Kammer handelt, in der der Inhalt durch Einwirkung von Hochtemperatur-Druckdampf sterilisiert wird. Darüber hinaus können Werkzeuge wie Glasstäbe, die für die Aufstrichbeschichtung verwendet werden, und Impfösen aus Metall mit einer Flammenquelle, wie z. B. einem Bunsenbrenner, wärmesterilisiert werden.

Der Einsatz einer Flammenquelle ist auch eine der gängigsten Methoden, um eine aseptische Arbeitsumgebung zu schaffen. Die Hitze der Flamme bewirkt eine Luftkonvektion, die einen Aufwind erzeugt, der alle Luftverunreinigungen aus der Umgebung des Brenners abhebt und ein "steriles Feld" schafft, in dem aseptische experimentelle Arbeiten durchgeführt werden können.

Nachdem Sie nun die Prinzipien hinter aseptischen Techniken verstanden haben und warum sie wichtig sind, gehen wir ein Protokoll für die Schaffung einer aseptischen Arbeitsumgebung, die Herstellung steriler Wachstumsmedien und den aseptischen Transfer von Bakterien zwischen verschiedenen Kultivierungsbedingungen durch.

Bevor der Experimentator mit der aseptischen Arbeit beginnt, ist es wichtig, dass er die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA) anlegt. Dies dient sowohl dazu, zu verhindern, dass der Experimentator die Proben und Laborkulturen kontaminiert, als auch die Übertragung potenziell pathogener Mikroben auf den Forscher. Zu den PSA-Artikeln gehören ein Laborkittel, Handschuhe und eine Schutzbrille.

Der nächste Schritt besteht darin, die Wachstumsmedien, die für die Kultivierung der mikrobiellen Proben verwendet werden sollen, ordnungsgemäß zu sterilisieren und zu lagern. Wiegen Sie zunächst die richtige Menge an festen Mediumkomponenten ab und fügen Sie sie dem vom Hersteller angegebenen richtigen Volumen des flüssigen Lösungsmittels, wie z. B. deionisiertem Wasser, in einen autoklavierbaren Behälter hinzu. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu, stellen Sie den Behälter auf ein Heizplattenrührwerk und lösen Sie die festen Mediumkomponenten bei geringer Hitze und unter Rühren auf.

Schließen Sie die mittleren Behälter. Wenn Sie ein Glasgefäß mit Schraubverschluss verwenden, achten Sie darauf, den Deckel nicht vollständig festzuziehen, da sich die Luft in den Gefäßen durch das Erhitzen während des Autoklavierens ausdehnt und entweichen muss. Ohne Entweichen könnte das Gas das Gefäß zum Platzen bringen. Kleben Sie ein Stück Autoklavenband auf die Gefäße und autoklavieren Sie das Medium gemäß den Anweisungen des Herstellers, z. B. 20 min bei 121 °C. Vergewissern Sie sich nach dem Autoklavieren, dass die Streifen auf den Autoklavenbändern schwarz geworden sind, was darauf hinweist, dass die richtige Temperatur erreicht wurde.

Lassen Sie flüssige Wachstumsmedien auf Raumtemperatur abkühlen und lagern Sie sie gegebenenfalls bei Raumtemperatur oder gekühlt. Feste Wachstumsmedien auf Agarbasis auf ca. 50 μm abkühlen lassen C, dann in sterile Petrischalen gießen. Lassen Sie den Agar abkühlen und fest werden, bevor Sie ihn bei der richtigen Temperatur lagern.

Bei Medien, die aufgrund des Vorhandenseins von wärmeempfindlichen Komponenten nicht autoklaviert werden können, ist die Filtersterilisation mit einem 0,22-μm-Filter durchzuführen.

Eine Kerntechnik in der Mikrobiologie ist der aseptische Transfer von Bakterienkulturen zwischen verschiedenen Wachstumsmedien, sowohl festen als auch flüssigen. Reinigen Sie die Oberfläche des Labortisches vor Beginn mit einem Desinfektionsmittel. Dies senkt das Risiko einer Kontamination von Kulturen oder sterilen Medien.

Beim Transfer von Bakterienkulturen wird in der Regel ein Werkzeug verwendet, das als Impfschlaufe bezeichnet wird und vor der Verwendung durch Erhitzen in einer Flamme sterilisiert werden muss.

Schalten Sie eine Flammenquelle ein. Führen Sie die Impfschlaufe langsam durch die Spitze der Flamme. Die Schleife wird glühend heiß. Um eine Bakterienkolonie von einer festen Agarplatte zu übertragen, öffnen Sie die Petriplatte leicht und klopfen Sie die heiße Impfschlaufe vorsichtig auf einen leeren Teil der Agaroberfläche, um eine Hitzetötung der Bakterien zu vermeiden. Kratzen Sie eine einzelne Kolonie mit der Impfschlaufe ab und schließen Sie die Platte.

Um Bakterien aus einem flüssigen Wachstumsmedium zu übertragen, entfernen Sie die Kappe vom Kulturbehälter. Um eine Kontamination zu vermeiden, vermeiden Sie es, die Kappe auf die Bank zu setzen. Führen Sie die Öffnung des Behälters 2-3 Mal durch den heißesten Teil der Flamme. Berühren Sie dann vorsichtig die heiße, sterilisierte Impfschlaufe auf der Innenseite des Behälters und lassen Sie sie abkühlen, bevor Sie sie in die Brühekultur einsetzen. Entfernen Sie eine Schlaufe der Kultur und schließen Sie sofort die Kappe.

Um die gewonnenen Bakterien in ein steriles Wachstumsmedium zu übertragen, entfernen Sie den Deckel von einem Behälter mit der sterilen Brühe und führen Sie die Öffnung des Behälters 2-3 Mal durch die Flamme. Senken Sie dann die Impfschlaufe vorsichtig in das Medium ab und rühren Sie vorsichtig um, um die Bakterien freizusetzen. Schließen Sie sofort die Kappe. Sterilisieren Sie die Impfschlaufe nach Gebrauch.

Wenn Sie Bakterien auf eine sterile Agarplatte übertragen, öffnen Sie den Deckel einer frischen Petriplatte mit ungeimpftem Agar. Streichen Sie die Impfschlaufe mit der Bakterienkultur über einen Sektor des Agars hin und her. Sterilisieren Sie die Schlaufe und kühlen Sie sie ab, indem Sie einen leeren Teil des Agars berühren, dann machen Sie einen weiteren Streifen auf dem Agar in einem stumpfen Winkel zum ersten Streifen, achten Sie darauf, den ersten Streifen bei den ersten 1-2 Zügen zu kreuzen, aber vermeiden Sie es, den ersten Streifen bei den folgenden Zügen zu berühren. Wiederholen Sie die Sterilisation und das Schlieren noch 2 Mal. Schließen Sie die Petriplatte und sterilisieren Sie die Impfschlaufe.

Nach der Inokulation sollte die Brühe oder Agarplatte dann bei der idealen Wachstumstemperatur für den jeweiligen Mikroorganismus inkubiert werden, um eine lebensfähige Kultur zu erhalten. Auf festem Untergrund wäre ein Rasen oder ein kontinuierlicher Bakterienstrang auf dem Agar sichtbar, der von den ersten beiden Streifen bedeckt ist, aber einzelne Kolonien sollten auf dem letzten Streifen erhalten werden. Schlechte aseptische Techniken würden zum Wachstum von Schimmel und anderen Verunreinigungen auf der Platte führen.

Aseptische Techniken sind bei vielen Experimenten mit mikrobiellen Proben aus der Umwelt wichtig. In dieser Studie isolierten die Forscher Bakteriophagen, bei denen es sich um bakterieninfizierende Viren handelt, aus dem weit verbreiteten Bodenbakterium Arthrobacter. Arthrobacter-Kulturen wurden zunächst unter aseptischen Bedingungen gezüchtet. Die Bodenproben wurden dann gewaschen und in Phagenpuffer filtriert, und die Phagenlösung wurde mit der Bakterienkultur vermischt und auf Agarplatten plattiert. Auf der Platte bildete sich ein Bakterienrasen, aber an den Stellen, an denen das Virus die Bakterien infiziert und abgetötet hatte, gab es Lichtungen oder "Plaques". Der Phagen könnte dann für weitere Studien von diesen Plaques gereinigt werden.

Neben der Verwendung von Bunsenbrennern können aseptische Arbeitsumgebungen auch an speziellen Arbeitsplätzen, den sogenannten Laminar-Flow-Hauben, aufrechterhalten werden, die einen gerichteten Luftstrom und Filter verwenden, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Hier arbeiteten die Wissenschaftler in einer Strömungshaube, um potenziell pathogene Bakterien und Viren aus Wasserproben zu isolieren. Diese Isolate wurden dann zusammen mit Amöben kultiviert. Da Amöben normalerweise Bakterien fressen oder "phagozytieren", können alle Bakterien, die in der Lage waren, der Amöbenverdauung zu widerstehen und in diesen Organismen zu verbleiben, möglicherweise auch in menschlichen Zellen lebensfähig bleiben und Krankheiten verursachen.

Schließlich ermöglichen sterile Bedingungen eine detaillierte Untersuchung ökologischer Mechanismen wie der Bildung von Wurzelknöllchen bei Hülsenfrüchten - mit Bakterien gefüllte Organe, die Luftstickstoff in Ammoniak "fixieren", das von der Pflanze für das Wachstum verwendet wird. Hier schufen die Forscher "Mikrokosmen" zur Untersuchung des Knötchenbildungsprozesses mit gekerbten Petriplatten mit pflanzlichem Wachstumsmedium, setzten Setzlinge hinein und impften die Sämlinge mit knöllchenbildenden Rhizobienbakterien. Das aseptische Milieu der Strömungshaube verhindert eine Kontamination der Kulturen mit anderen Bakterien oder Pilzen.

Sie haben gerade das Video von JoVE über aseptische Techniken in den Umweltwissenschaften gesehen. Sie sollten jetzt verstehen, warum aseptische Arbeitsbedingungen wichtig sind; wie man mikrobiologische Experimente aseptisch durchführt; und einige Anwendungen aseptischer Techniken in der Umweltforschung. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!