Analyse der bakteriellen Wachstumskurve und ihre Umweltanwendungen

Die Messung der Wachstumsrate von Bakterien ist eine grundlegende mikrobiologische Technik, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in landwirtschaftlichen und industriellen Anwendungen weit verbreitet ist.

Bakterien gehören zu den am häufigsten vorkommenden Lebensformen auf der Erde und sind in jedem Ökosystem, einschließlich des menschlichen Körpers, vorhanden. Bestimmte Bakterienarten sind auch genetisch sehr gut manipulierbar und wurden als Forschungsmodelle oder zur Herstellung natürlicher oder synthetischer Produkte im industriellen Maßstab genutzt. Allerdings können nicht alle Bakterienarten im Labor kultiviert werden. Für diejenigen, die es können, ist ein wichtiges Merkmal die Vermehrungsrate oder "Wachstumskinetik".

Die Messung der Wachstumsrate einer Bakterienkultur kann Wissenschaftler über ihre physiologischen und metabolischen Funktionen informieren und ist auch nützlich, um eine genaue Zellzahl der Bakterien für nachgelagerte Anwendungen zu erhalten.

In diesem Video werden die Prinzipien der Analyse der bakteriellen Wachstumsrate vorgestellt, ein Protokoll zur Charakterisierung der Wachstumsrate mit einer "Wachstumskurve" demonstriert und schließlich verschiedene umweltwissenschaftliche Anwendungen zur Messung der bakteriellen Wachstumskinetik untersucht.

Bakterien vermehren sich in der Regel ungeschlechtlich und vermehren sich durch einfache binäre Spaltung, bei der sich eine Elternzelle in zwei identische Tochterzellen teilt. Unter günstigen Wachstumsbedingungen, in denen Nährstoffe im Überfluss verfügbar sind und Umweltparameter wie die Temperatur dem Wachstum förderlich sind, übersteigt die Vermehrungsrate die Sterberate bei weitem. Dies führt zu einem exponentiellen Wachstum.

Durch die Messung der Menge der Bakterien in einer Kultur in Abhängigkeit von der Zeit kann eine Wachstumskurve erhalten werden. Die Züchtung von Bakterien in einer Flüssigkultur unter optimalen Bedingungen erzeugt eine Wachstumskurve mit einer charakteristischen Form, die in verschiedene Phasen unterteilt werden kann. Die Kurve beginnt mit einer "Verzögerungsphase", in der das Wachstum langsam ist, während sich die Bakterien an die Kulturbedingungen gewöhnen. Als nächstes folgt die "logarithmische" oder "exponentielle Phase", in der die Bakterien ein exponentielles Wachstum erleben. Das Wachstum kommt schließlich zum Stillstand, sobald die Nährstoffe erschöpft sind und sich Abfallprodukte ansammeln, was zu einer "stationären Phase" führt. Sobald die Vermehrungsrate von der Rate des Zelltods überholt wird, tritt die Kultur in die "Todesphase" ein.

Um eine Wachstumskurve zu erstellen, werden die Bakterienzahlen in einem Kolben mit Flüssigkultur zu verschiedenen Zeitpunkten über einen bestimmten Zeitraum der Kultivierung gezählt. Die Keimzahl kann auf verschiedene Weise ermittelt werden. Ein gängiger Ansatz ist die Messung der optischen Dichte - oder "OD" - 600, d. h. der Absorption von Licht bei einer Wellenlänge von 600 nm durch die Bakterienlösung.

Eine andere Methode besteht darin, die "KBE" oder koloniebildenden Einheiten pro Milliliter der Kultur zu bestimmen. Aufgrund der klonalen Natur des Bakterienwachstums kann sich ein Bakterium in einer Kultur theoretisch zu einer beobachtbaren Kolonie auf einer Agarplatte ausdehnen. Durch das Plattieren einer Reihe von Verdünnungen einer Bakterienkultur, um eine Bakterienkonzentration zu erreichen, bei der einzelne, diskrete Kolonien beobachtet werden können, eine Methode, die als "serielle Verdünnungsbeschichtung" bezeichnet wird, kann die Koloniezahl verwendet werden, um die Bakterienkonzentration in Bezug auf KBE pro ml zurückzuberechnen.

Nachdem Sie nun verstanden haben, wie das Bakterienwachstum analysiert werden kann, gehen wir ein Protokoll für die Durchführung einer Wachstumskurvenanalyse an Reinkulturen eines etablierten Bakterienmodells, Escherichia coli, unter Verwendung der seriellen Verdünnungsplattierungsmethode durch.

Einen Tag vor der Entnahme impfen Sie 20 ml vorsterilisierte Trypticase-Sojabrühe oder TSB-Medium in einem 50-ml-Kolben mit einer einzigen Kolonie von E. coli.

Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 ? C mit Schütteln. Für E. coli würde dies zu einer stationären Phasenpopulation von etwa 109 KBE/ml führen.

Impfen Sie am nächsten Tag 100 ? L der Übernachtkultur in 250 mL TSB in einem 500-ml-Kolben umfüllen. Gründlich mischen. Dies ergibt eine verdünnte Kultur von ca. 4 x 105 KBE/ml. Lagern Sie 5 ml dieser verdünnten Kultur in einem Kulturröhrchen. Dies ist das Aliquot vom Zeitpunkt 0 oder T0. Sofort bei 4 °C kühl stellen.

Das verbleibende Volumen der Kultur bei 37 °C inkubieren. C mit Schütteln. Zu jeder vollen Stunde danach für bis zu 8 Stunden 5-ml-Aliquots aus der Kultur entnehmen. Bezeichnen Sie diese Proben als T1 bis T8 und lagern Sie sie alle bei 4 ? C bis zum Gebrauch.

Nehmen Sie am Tag des Experiments die E. coli-Zeitpunktaliquote aus dem Kühlschrank und legen Sie sie auf Eis. Verwenden Sie sterile Mikrofuge-Röhrchen mit je 900 ? L steriler Kochsalzlösung, um für jedes Aliquot eine Verdünnungsreihe gemäß der folgenden Tabelle einzurichten.

Mischen Sie die T0-Kultur gut, indem Sie sie vorsichtig vortexen, und fügen Sie dann 100 ? L auf Röhre A seiner Verdünnungsreihe, wodurch eine 1-in-10- oder 10-1-Verdünnung entsteht. Vortex-Röhrchen A zum Mischen und mit einer frischen Pipettenspitze 100 ? L von Röhre A auf Röhre B, wodurch die 1-in-100- oder 10-2-Verdünnung erfolgt.

Der Vorgang wird für jedes Kulturaliquot wiederholt und die entsprechende Verdünnungsreihe gemäß Tabelle 2 hergestellt. Sobald die Verdünnungsreihen für alle Zeitpunktproben hergestellt wurden, bereiten Sie die entsprechende Anzahl steriler Trypticase-Soja-Agar-Platten für die bakterielle Beschichtung vor.

3 Verdünnungen jeder Zeitpunktkultur werden gemäß der folgenden Tabelle in dreifacher Ausfertigung plattiert. Beschriften Sie die Platten entsprechend. Pipettieren Sie dann 100 ? L jeder entsprechend verdünnten Kultur auf die Mitte der jeweiligen Agarplatte. Einen L-förmigen Glasstab flammensterilisieren, abkühlen lassen, indem der Stab mit dem Agar vom Inokulum weg mit dem Agar berührt wird, und die Flüssigkeit sofort auf der Agaroberfläche verteilen. Bitte beachten Sie, dass eine Verzögerung der Ausbreitung zu einer bakteriellen Überwucherung an der Stelle der Impfung führen kann.

Fahren Sie mit der Beschichtung jeder Verdünnungsserie für alle 9 Zeitpunktkulturen fort und sterilisieren Sie den Glasspreizstab zwischen den einzelnen Verdünnungsserien flammensterilisieren.

Sobald die Platten einige Minuten getrocknet sind, drehen Sie sie um und legen Sie sie in die 37 ? C Inkubator über Nacht. Nach dieser Wachstumsphase können die Platten bei 4 °C gelagert werden.

Nach der Inkubation der Verdünnungsplatten über Nacht sind diese auf Kontamination und Gleichmäßigkeit der Kolonien zu untersuchen. Wählen Sie für jede Kultur zu einem bestimmten Zeitpunkt eine Verdünnung, für die zwischen 30 und 300 Kolonien pro Platte vorhanden sind. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf jeder der dreifachen Platten für diese Verdünnung.

Berechnen Sie unter Verwendung der mittleren Anzahl von Kolonien für jede Verdünnung und des Verdünnungsfaktors die Konzentration der Bakterien in der Originalkultur zu jedem Zeitpunkt in KBE/ml. Zum Beispiel, wenn es durchschnittlich 30 Kolonien aus dem dreifachen Plattensatz gibt, die aus 0,1 ml der 10-4 oder 1 zu 10.000 Verdünnung gewonnen werden, dann gäbe es 30 geteilt durch 0,1 ml multipliziert mit 10.000 oder 3 Millionen KBE/ml.

Unter Verwendung der für jeden Zeitpunkt berechneten Bakterienkonzentration wird ein Diagramm des Logarithmus zur Basis 10 der Bakterienkonzentrationen in KBE/ml über die Zeit in Stunden gezeichnet. Identifizieren Sie aus dem Diagramm die logarithmische Wachstumsphase der ursprünglichen Bakterienkultur, und wählen Sie zwei der Zeitpunkte innerhalb der logarithmischen Phase aus, wobei der erste dieser Zeitpunkte als t = 0 festgelegt wird. Berechnen Sie die mittlere Generationszeit mit der Gleichung X gleich 2 hoch n multipliziert mit X0, wobei X die Bakterienkonzentration zum Zeitpunkt t, X0 die Anfangskonzentration bei t = 0 und n die Anzahl der Generationen ist, die zwischen den beiden Zeitpunkten vergangen sind.

Angenommen, X0 beträgt 1.000 KBE/ml, und bei t = 6 h beträgt die Konzentration 16.000 KBE/ml. Mit der Gleichung erhalten wir, dass 4 Generationen innerhalb von 6 h stattgefunden haben, was eine Generationszeit von 6 geteilt durch 4 oder 1,5 h pro Generation ergibt.

Die Messung der bakteriellen Wachstumskinetik ist für viele Anwendungen in der Forschung, in der Landwirtschaft oder in der Biotechnologie von grundlegender Bedeutung.

Eine Verwendung zur Kenntnis der bakteriellen Wachstumsrate besteht darin, eine genaue Menge einer Bakterienkultur zu erhalten, um eine andere Kultur oder ein anderes Medium zu impfen. Zum Beispiel müssen bestimmte Pflanzen, wie z. B. Hülsenfrüchte, mit symbiotischen Bakterien, die als Rhizobien bekannt sind, angebaut werden, die die Wurzeln der Pflanzen besiedeln, um Knöllchen zu bilden und Stickstoff zu "fixieren" - Luftstickstoff in Ammoniak umzuwandeln, das von der Pflanze verwertet werden kann. Für landwirtschaftliche Anwendungen wird eine bekannte Menge Rhizobien zu einem kohlenstoffhaltigen Medium auf Torfbasis gegeben, das dann zur Inokulation von Leguminosensamen verwendet wird, um die Pflanze-Bakterien-Symbiose herzustellen.

Die Wachstumsanalyse kann auch verwendet werden, um Bakterienarten zu identifizieren, die Industrieabfälle abbauen und möglicherweise wertvolle Nebenprodukte erzeugen können. In diesem Beispiel untersuchten die Forscher, wie sich Wachstumsmedien, die mit Schwarzlauge, einem Abfallprodukt aus der Zellstoff- und Papierherstellung, ergänzt wurden, auf das Wachstum eines mikrobiellen Umweltisolats auswirkten.

Die Bakterien zeigten nicht nur ein verstärktes Wachstum mit Schwarzlauge, sondern zeigten auch ein "diphasisches" Wachstumsmuster, was auf das Vorhandensein von mehr als einer Kohlenstoffquelle in der Schwarzlauge hinweist, die die Bakterien verstoffwechseln können. Einzelne Bestandteile der Schwarzlauge konnten dann für eine detailliertere Wachstumsanalyse extrahiert werden.

Schließlich sind Messungen der Wachstumsrate auch nützlich für die Charakterisierung von Bakterien, die für bestimmte industrielle Zwecke entwickelt wurden, z. B. zur Sanierung von Ölverschmutzungen. Hier schufen Wissenschaftler gentechnisch veränderte Bakterienstämme, die Enzyme enthalten, um die Kohlenwasserstoffbestandteile des Öls abzubauen. Eine Wachstumsanalyse wurde beispielsweise durchgeführt, um zu überprüfen, ob die gentechnisch veränderten Bakterien in Gegenwart der giftigen Kohlenwasserstoffe eine höhere Wachstumsrate als normale Bakterien aufweisen, was auf eine verbesserte Verträglichkeit hinweist, die es den gentechnisch veränderten Bakterien ermöglicht, ihre Funktion zur Beseitigung von Schadstoffen zu erfüllen.

Sie haben gerade das Video von JoVE über die Analyse der bakteriellen Wachstumsraten mit Wachstumskurven gesehen. Sie sollten nun die verschiedenen Wachstumsphasen von Bakterienkulturen verstehen, wie man ein Experiment durchführt, um eine Wachstumskurve mit Hilfe der Zeitpunkterfassung und der seriellen Verdünnungsbeschichtung zu erhalten, und wie die Wachstumsanalyse für Forschungs- und Industriezwecke angewendet werden kann. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!