Analyse der bakteriellen Wachstumskurve und ihre Umweltanwendungen

1. Erhebung der Bakterienkultur Aliquote

1. Impfen Sie einen Tag vor der Abholung von Wachstum Zeitpunkten 20 mL Trypticase-Soja Brühe (TSB) Medium in eine 50-mL-Flasche mit E. Coli.
2. Inkubation über Nacht bei 27 ° C. Diese relativ langen Inkubationszeit führt zu einer stationären Phase Bevölkerung von Wildtyp E. Coli von ca. 10⁹ KBE/mL.
3. Am nächsten Tag verwenden Sie 100 µL der vorbereiteten Kultur 250 mL TSB (in einen 500-mL-Kolben) zu impfen. Mischen Sie gründlich.  Eine 5-mL-aliquoten zu entfernen und in den Kühlschrank sofort bei 4 ° C. Dies ist T = 0 oder T₀ Zeitpunkt, und sollte ca. 4 x 10⁵ KBE/mL enthalten.
4. Legen Sie den Kolben des verbleibenden E. Coli (245 mL) in einem 37 ° C Inkubator schütteln. 5-mL-aliquoten Kultur stündlich zu entfernen, bis zu 8 h. speichern jedes aliquoten bei 4 ° C. Benennen Sie diese Aliquote T₁ bis T₈.

2. serielle Verdünnung

1. Aliquote von E. Coli aus dem Kühlschrank und auf Eis für den Transport zu entfernen. Halten Sie alle Kulturen auf Eis bis zur Verwendung.
2. Richten Sie eine Reihe von Verdünnung Rohren zu verschiedenen Verdünnungen der jeweiligen E. Coli -Kultur (Abbildung 3). Microfuge Röhren eignen sich für diese Funktion. Jedes Rohr Verdünnung sollten 900 µL Verdünnung Flüssigkeit (sterile Kochsalzlösung) haben. Eine Verdünnungsreihe ist erforderlich für jede Kultur E. Coli (T₀ bis T₈); Beschriften Sie jedes Rohr nach Tabelle 2.
   
   Abbildung 3. Schaltplan zeigt das Verfahren für die Beschichtung von E. Coli.
3. Verdünnungen durch Zugabe von 100 µL von E. Coli aus der Tube mit der Bezeichnung T₀ beginnen (die ursprüngliche E. Coli Kultur) Rohr A, die die 10^-1 Verdünnung T₀ist. Wirbel der Röhre für 5 s.
4. Anschließend fügen Sie 100 µL Rohr A an das nächste Rohr der Saline, Rohr B hinzu, die die 10^-2 Verdünnung T₀. Die notwendige Verdünnung-Serie für jede Zeitpunkt aliquoten weiter. Denken Sie daran, Wirbel jedes Rohr vor der Übertragung. Es ist auch wichtig, eine neue Pipettenspitze für jede Übertragung zu verwenden.

E. Coli -Kultur	Verdünnungen erforderlich und Tube #
	A	B	C	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T-3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T-7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T-8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

Tabelle 2. Verdünnungsreihen notwendig für jede E. Coli -Kultur.

3. Beschichtung

1. Drei Verdünnungen für jedes E. Coli Kultur Zeitpunkt aliquoten werden gemäß Tabelle 3überzogen werden. Label-Platten mit der Zeitpunkt (T₁ bis T-₈), den Verdünnungsfaktor und Volumen hinzugefügt werden. Verwenden Sie dreifacher Platten für jede Verdünnung.
2. Die Platte fügen Sie 100 µL jeder Verdünnung durch Pipettieren des Betrags in die Mitte der Agarplatte (Abbildung 3 hinzu). Sofort verbreiten sterilisiert die aliquoten durch den Einsatz einer Flamme "L"-förmige Glasstab. Wenn die aliquoten nicht sofort verteilt ist, Sorben es in Situ auf der Platte, wodurch bakterielle Überwucherung an der Stelle der ersten Impfung.
3. Wiederholen Sie die Beschichtung für jedes Verdünnungsreihe zur Zeit Punkte T₁ bis T₈. Denken Sie daran, die Rute zwischen den Platten und vor allem zwischen verschiedenen Verdünnungen zu sterilisieren.
4. Sobald Platten für ein paar Minuten getrocknet haben, umdrehen und über Nacht bei 37 ° C Inkubator legen. Invertieren der Platten Kondensation auf der Agarplatte fallen entgegen. Platten sollten nach Inkubation über Nacht im Kühlschrank gelagert werden.

E. coli Kultur	Verdünnungen, beschichtet werden
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T-3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7 *	10-5	10-6	10-7
T8 *	10-4	10-5	10-6

^* Niedrigere Verdünnungen berücksichtigen geringere Populationen durch Tod Phase.

Tabelle 3. Protokoll für E. Coli Kulturen plating.

4. zählen Kolonien und mittlere Generationszeit rechnen

1. Platten für Einheitlichkeit der Kolonien und Mangel an Kontamination zu untersuchen.
2. Wählen Sie für jeden Zeitpunkt (T₀ bis T₈) eine Verdünnung, die zwischen 30 und 300 Kolonien und Graf dreifacher Platten enthält.
3. Berechnen Sie mit Hilfe den Verdünnungsfaktor, Rücken-die Anzahl der Zellen pro mL der ursprünglichen Kultur auf Zeit Punkte T₀ bis T₈. Zum Beispiel, wenn die Anzahl der Kolonien, die aus einer 10^-4 Verdünnung 30, 28 und 32:
   Mittlere Anzahl der Kolonien = 30 Kolonien
   Diese entstand aus 0,1 mL einer 10^-4 Verdünnung
   Anzahl der Kolonien pro mL = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Plot-Log₁₀ KBE/mL im Vergleich zur Zeit (in Stunden).
5. Aus dem Diagramm ermitteln der exponentiellen Wachstumsphase. Mit 2 Zeitpunkten innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase und die entsprechende Zelle Zahlen zu jedem Zeitpunkt, berechnen Sie die mittlere Generationszeit.