2.12: Züchten von Kristallen für die Röntgenbeugungsanalyse

1. Vorbereitung des Crystal Rohr und Filter

1. Legen Sie ein NMR-Röhrchen in einen Erlenmeyerkolben.
2. Bereiten Sie einen Pipette-Filter.
   1. Konstruieren Sie den Filter zu, indem man ein Stück fusselfreien Tuch (1 Zoll von 1 Zoll) in der Pipette, dann verwenden Sie einen Stab fest das Tuch Keil in den Engpass Teil der Pipette (Abbildung 1).
   2. Machen Sie zwei Pipette Filter für jedes Kristall Rohr benötigt.

(2) Zugabe der Probe mit dem Crystal-Rohr

1. Die Verbindung (Tetraphenylporphyrin, 10 mg) in 0,75 mL des Lösungsmittels (Dichlormethan) auflösen.
2. Fügen Sie mit einer Pipette vorsichtig die Mischung an die Spitze des Rohres hinzu, indem man es durch den Filter.
   1. Partikel werden herausgefiltert, um die Erstellung von Keimbildung Websites zu vermeiden, die zu kleinen mehrere Kristalle anstelle der gewünschten größeren Einkristallen führen kann.
3. Sobald die Probe in der Kristall-Röhre sehr langsam und sanft gelegt wurde, Hinzufügen der Anti-Lösungsmittel (1,5 mL Methanol) das Rohr durch eine neue Filter-Pipette. Lassen Sie das Anti-Fließmittel langsam Schicht auf die zuvor hinzugefügte Lösung (Abbildung 2). Verwenden Sie eine Glühbirne nicht, schieben das Lösungsmittel durch die Pipette, stattdessen das Lösungsmittel durch den Filter von selbst fließen lassen.
   1. Stellen Sie sicher, dass Lösungsmittel die höhere Dichte der Kristall-Rohr zuerst hinzugefügt wird.
   2. Überprüfen Sie, dass die beiden Lösungsmittel miteinander mischbar sind. Dies geschieht vor der Zugabe des Lösungsmittels.
4. Verschließen Sie das Röhrchen mit einem NMR-Kappe.

3. die Kristallzüchtung

1. Ohne dass die beiden Lösungsmittel zu vermischen, legen Sie die Kristall-Tube(n) in einem Schrank wo sie nicht gestört werden.
2. Kristallisationszeit variiert jede Verbindung - in der Regel den Kristall, die Rohre für eine Woche ungestört bleiben sollte.
3. Inspizieren Sie nach einer Woche die Rohre für Kristallwachstum.
   1. Kristallwachstum tritt in der Regel an der Schnittstelle zwischen den beiden Lösungsmittel.
   2. Überprüfen Sie die Schläuche nach Beweisen des Kristallwachstums. Achten Sie darauf, nicht zu erleichtern, Lösungsmittel, mischen, für den Fall, dass die Verbindung zur Kristallbildung zusätzliche Zeit erfordert.
   3. Wenn sich herausstellt, dass Kristallwachstum stattgefunden hat, näher untersuchen Sie die Rohre unter dem Mikroskop.

4. Crystal-Auswahl

1. X-ray Diffraction Kristalle sollten gut Gesichter definiert haben.
2. Kristalle, die geclustert haben sollten wenn möglich vermieden werden.
3. Verlassen Sie die Kristalle in der Kristall-Röhre erst unmittelbar vor den Kristall, unmittelbar vor dem Inverkehrbringen der Diffraktometer des Kristalls zu ernten.
   1. Halten die Kristalle in der Röhre wird sichergestellt, dass die Kristalle solvatisierte bleiben. De-Solvatation kann dazu führen, dass die Kristalle zu knacken und die Beugung des Kristalls zu behindern.

Abbildung 1: Ein Bild von der Pipette Filter. Ein kleines Stück fusselfreien Tuch hat fest an den Engpass der Pipette eingeklemmt worden. Die Lösungen werden aber diese Pipette Filter vor, um das Kristall-Rohr eingeführt übergeben.

Abbildung 2. Sobald die Lösung mit gezielten Verbindung in der Kristall-Röhre platziert wird, wird das Anti-Lösungsmittel langsam an der Spitze geschichtet, indem Sie sie durch eine neue Pipette Filter übergeben.

Für die Bestimmung seiner Struktur wird ein Einkristall benötigt. Die Qualität des Kristalls hat einen großen Einfluss auf die Qualität und Genauigkeit der Strukturbestimmung.

Ein Einkristall ist ein Festkörper, bei dem sich die Molekülanordnung in allen drei Dimensionen wiederholt. Die räumliche Anordnung der Atome innerhalb des kristallinen Festkörpers kann mit Hilfe der Röntgenkristallographie bestimmt werden. Bei dieser Technik wird eine reine kristalline Probe von einem Röntgenstrahl umhüllt. Der Kristall beugt die Röntgenstrahlen in einem charakteristischen Muster, das mit der Struktur und der molekularen Zusammensetzung des Kristalls zusammenhängt. Wenn ein Kristall zu schnell gebildet wird, können die Moleküle ungeordnet sein, Verunreinigungen können in den Kristall eingebaut werden oder es können sich zwei oder mehr geschmolzene Kristalle anstelle eines Einkristalls bilden. Daher sind spezialisierte Methoden mit Schwerpunkt auf langsamem Wachstum erforderlich, um Kristalle von ausreichender Qualität für die Röntgenkristallographie herzustellen.

In diesem Video werden die gewünschten Eigenschaften von Kristallen in Röntgenqualität veranschaulicht, ein Verfahren zu ihrer Züchtung demonstriert und einige Anwendungen dieser Technik in der Chemie vorgestellt.

Elektronen streuen Röntgenstrahlen, indem sie beim Auftreffen eine sphärische Röntgenwelle aussenden. Befinden sich die Atome in einer geordneten Anordnung, erzeugt die konstruktive Interferenz zwischen den Wellen auf einem Röntgendetektor ein charakteristisches Beugungsmuster. Der Kristall wird innerhalb des Strahls gedreht, um Beugungsmuster aus mehreren Winkeln zu erfassen. Bei ausreichenden Beugungsmustern kann die molekulare Struktur abgeleitet werden.

Kristalle in Röntgenqualität bilden in der Regel symmetrische Formen und haben glatte, lichtreflektierende Flächen. Wenn sie unter einem Polarisationsmikroskop betrachtet werden, sind sie transparent, aber die meisten sollten dunkel werden, wenn sie um 90° gedreht werden. Dies deutet auf eine hochgeordnete Struktur hin. Um diese Kristalle zu züchten, wird häufig die Flüssig-Flüssig-Diffusion verwendet. Dabei werden zwei mischbare Lösungsmittel verwendet: ein Lösungsmittel mit niedriger Dichte oder Fällungsmittel, bei dem die zu rekristallisierende Verbindung unlöslich ist; und ein Lösungsmittel mit hoher Dichte, in dem die Verbindung löslich ist. Typischerweise beträgt das volumetrische Verhältnis von Fällungsmittel zu Lösungsmittel 2:1.

Das Fällungsmittel niedriger Dichte wird auf eine konzentrierte Lösung der Verbindung in dem Lösungsmittel mit hoher Dichte geschichtet. Mit der Zeit wird die Verbindung weniger löslich, da sich das Fällungsmittel mit der Lösung vermischt. Eine kleinere Lösungsmittelgrenzfläche führt zu einer langsameren Diffusionsrate, wodurch größere, reinere Kristalle entstehen. Nachdem Sie nun die Prinzipien der Züchtung von Kristallen in Röntgenqualität verstanden haben, gehen wir ein Verfahren durch, um sie durch Flüssig-Flüssig-Diffusion zu züchten.

Besorgen Sie sich zunächst die notwendige Ausrüstung, die im Textprotokoll zu finden ist. Besorgen Sie sich ein Lösungsmittel für die Verbindung und ein weniger dichtes Fällungsmittel.

Um einen Pipettenfilter vorzubereiten, geben Sie ein kleines Stück Kimwipe in die Oberseite einer Glaspipette und drücken Sie das Papier mit einem Stab oder dem Stiel einer anderen Pipette vorsichtig bis zur Unterseite des Pipettenkörpers, wobei Sie darauf achten müssen, das Papier nicht zu durchstechen. Bereiten Sie zwei Pipettenfilter vor. Setze einen in den NMR-Schlauch ein. Sichern Sie die Montage ggf. mit einer Laborklemme und einem Ringständer. Lösen Sie etwa 10 mg der zu rekristallisierenden Verbindung in 0,75 ml Lösungsmittel auf.

Geben Sie nun die Probenlösung vorsichtig in den Pipettenfilter. Befestigen Sie einen Kolben an der Oberseite und drücken Sie ihn langsam zusammen, um die Lösung in das NMR-Röhrchen zu leiten und feste Verunreinigungen zu entfernen. Lassen Sie den Kolben nicht wieder ausdehnen, während er angebracht ist, da sich das Filterpapier durch den Sog löst.

Entfernen Sie anschließend den gebrauchten Pipettenfilter und setzen Sie den zweiten Filter in das NMR-Röhrchen ein. Pipettieren Sie etwa 1,5 ml Fällungsmittel in das Röhrchen. Lassen Sie das Lösungsmittel durch die Schwerkraft durch den Filter passieren. Achten Sie von nun an darauf, den Filter bei Manipulationen nicht zu stören. Sobald das gesamte Fällungsmittel in das Rohr gefiltert ist, entfernen Sie den Filter und verschließen Sie das Rohr. Stellen Sie es in einen Schrank oder an einen anderen leicht zu überprüfenden Ort, an dem es nicht geschüttelt wird.

Überprüfen Sie die Röhren nach mindestens einem Tag auf Kristallwachstum. Wenn keine Kristalle vorhanden sind oder die Kristalle sehr klein sind, lassen Sie das Probenröhrchen ungestört. Wenn Kristalle sichtbar sind, überprüfen Sie deren Größe und Form, ohne die Lösungsmittelschichten zu stören.

Wenn die Kristalle groß und gut definiert sind und nicht zusammengedrängt sind, untersuchen Sie die Kristalle unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie Röntgenqualität aufweisen können. Entfernen Sie die Kristalle nicht aus dem Röhrchen, bis das Diffraktometer bereit ist, mit dem Scan zu beginnen. Wenn Lösungsmittelmoleküle in die Kristallstruktur eingebaut werden, wird der Kristall durch das Trocknen des Kristalls abgebaut. Mittels Röntgenkristallographie konnte die Molekularstruktur dieser dunkelrötlich-violetten Kristalle als Tetraphenylporphyrin nachgewiesen werden.

Die Röntgenkristallographie ist ein unverzichtbares Analysewerkzeug in der Chemie und Biochemie.

Zu den Rekristallisationsmethoden gehören Erhitzen und Kühlen, Flüssig-Flüssig-Diffusion, Dampfdiffusion und langsame Verdampfung. Bei langsamer Verdampfung eines einzelnen Lösungsmittelsystems wird die Verbindung in einer kleinen Menge Lösungsmittel gelöst und in einen Behälter mit einem kleinen Loch in der Kappe gegeben. Wenn das Lösungsmittel verdampft, steigt die Konzentration, bis die Verbindung zu kristallisieren beginnt.

Die Funktionalität von Proteinen hängt oft mit ihrer Struktur zusammen. Allerdings kann es sehr schwierig sein, Proteine zu kristallisieren. Es müssen spezielle Techniken entwickelt werden, um Kristalle von Proteinen in Röntgenqualität zu züchten. Hierbei wird ein Tropfen Proteinlösung mit einem Tropfen Fällungsmittel vermischt und dieses Gemisch in einer Kammer mit reinem Fällmittel verschlossen. Wenn der Lösungsmitteldampf aus dem Tropfen diffundiert, nimmt die Löslichkeit des Proteins im Tropfen ab und das Protein kristallisiert langsam. Bei einer anderen Technik werden die Proteinlösung und das Fällungsmittel unter Mineralöl gemischt. Mit diesen Techniken kann eine Vielzahl von Proteinen für die Analyse kristallisiert werden.

Bei der Pulverbeugung wird jede mögliche räumliche Orientierung gleichzeitig in der Probe dargestellt. Die Pulverbeugung ist aufgrund des Verlusts dreidimensionaler Strukturdaten nicht so aussagekräftig über die Struktur wie die einkristalline Röntgenbeugung. Stattdessen eignet sich die Pulverbeugung hervorragend zur Analyse von Gemischen kristalliner Feststoffe und zur Beurteilung der Kristallinität amorpher Strukturen.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Züchtung von Kristallen für die Röntgenkristallographie gesehen. Sie sollten nun mit den Eigenschaften von Kristallen in Röntgenqualität, einem Verfahren zu ihrer Züchtung und einigen Anwendungen dieser Technik in der Chemie vertraut sein.

Danke fürs Zuschauen!