Name: Nicht radioaktiv In situ Hybridisierung Protocol Einsetzbar für Fichte und einer Reihe von Pflanzenarten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Lernen Sie ein modifiziertes DIG-In-situ-Hybridisierungsprotokoll für Pflanzen wie Fichte. Diese effiziente Methode ermöglicht die schnelle Analyse der Genexpression in verschiedenen Geweben.

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Wir sind sehr dankbar, dass Anders Bovin der die Musik für unseren Film zur Verfügung gestellt und Michael Elliot Aktien freiwillig für den Dienst des Sprechers Stimme. Unterstützung wurde von Carl Trygger Foundation, die strategische Forschungsprogramm Landwirtschaft Functional Genomics (AgriFunGen) an der schwedischen Universität für Agrarwissenschaften, der schwedische Research Council (VR) und die schwedische Forschungsrat für Umwelt, Agrarwissenschaften und Raumplanung (FORMAS vorgesehen ).

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Zwei Aspekte des P. abies-Protokoll wurden im Vergleich zu den A. optimiert thaliana / B. napus-Protokoll, RNase-Behandlung und Proteinase K-Konzentration. Die RNase entfernt Hintergrund Signale und erhöht damit das Signal Spezifität 17. Die Proteinase K-Behandlung ist notwendig, um das Gewebe permeabilisieren so kann die Sonde geben und hybridisieren, die RNA-Pool von Interesse. Die DAL13 Antisense-Sonde hat einen höheren Signal ohne RNase-Behandlung (Abb. 3C, E, G) im Vergleich zu Abschnitten mit RNase für 30 min (Abbildung 2D, F und H) behandelt. Da die RNase-Behandlung nicht verbessert hat das Signal war es aus dem Protokoll entfernt. 1, 3 und 5 ug / ml; Die Proteinase K-Behandlung wurden bei drei verschiedenen Konzentrationen getestet. Im Fall von P. abies eine geringe oder gar kein Signal beobachtet wurde mit 1 pg / ml Proteinase K (Abb. 3C-D). Ein starkes Signal sowohl mit 3 ug / ml (Abb. 3E-F) und 5 g / ml erhalten wurde (Abb. 3G-H) Proteinase K. Da keine offensichtlichen Unterschiede in der Signalstärke gefunden wurde, wenn mit 5 ug / ml Proteinase K im Vergleich zu 3 g / ml, entschieden wir uns für 3 ug / ml in unserem Protokoll verwenden. Es ist wahrscheinlich, dass die Notwendigkeit einer höheren Proteinase K-Konzentration in der P. abies männlichen Zapfen, die A. im Vergleich thaliana und B. napus Blütenknospen ist darauf zurückzuführen, kompakter Gewebe mit höherer Phenole und Polysaccharide. Während der Fixierung und Einbettung einige Unterschiede zwischen den A. thaliana / B. napus-Protokoll und das P. abies-Protokoll sind evident. Das Gewebe von Interesse ist fest auf RNA Halt bietet und das ist ein kritischer Schritt, da schlecht festen Materialien eine geringe oder nicht nachweisbare Signal, obwohl die mRNA sehr reichlich vorhanden ist geben könnte. Das Gewebe wird entwässert, gelöscht und eingebettet in Wachs in allmählichen Veränderungen zu Gewebeschäden zu vermeiden, und in einigen Protokollen 0,85% NaCl wird das Ethanol in der Dehydratisierung hinzugefügt, um weitere zu vermeiden Schrumpfung und Schwellung der Zellen 3. Die Dehydratisierung Schritt beim Einbetten kann auf Eis durchgeführt werden, um RNase-Aktivität bei gering zu halten. In der P. abies Protokoll der 4% Paraformaldehyd fix Lösung enthält 0,25% Glutaraldehyd, die angeblich ein besseres RNA Zurückbehaltungsrecht 17 Auch wenn einige, dass es wahrscheinlich keinen Unterschied 3 argumentieren ist. Nach dem Anschneiden des Materials wird auf Objektträgern fixiert und vorbehandelt (zB entwachst, rehydriert, permeabilisiert, behandelt, um unspezifische Bindung der Sonde und schließlich dehydriert zu reduzieren), bevor die Hybridisierung. In das Protokoll hier präsentierten die gesamte Verfahren des Nachweises in normalen Labors durchgeführt werden kann, entwickelt sich das Signal in der Regel innerhalb von 1-3 Tagen und das Verhältnis zwischen Signal über Hintergrund können kontinuierlich überwacht werden. Die DIG-markierten Sonden in der Regel geben ein deutlicheres Signal als zu radioaktiv markierten Sonden sind im Vergleich viel stabiler und kann in nachfolgenden Experimenten verwendet werden. Auf der anderen Seite ist die Empfindlichkeit gegenüber radioaktiven Sonden 17 reduziert. In-situ-Hybridisierung detektiert Ausdruck mit einer markierten Sonde spezifisch für eine bestimmte mRNA. Radio-Kennzeichnung ist eine robuste und empfindliche Kennzeichnung Methode, aber es erfordert Umgang mit Radioaktivität und es dauert mehrere Wochen, bevor die Ergebnisse nachgewiesen werden können. Antigen-markierten Sonden auf der anderen Seite, sind stabiler, weniger gefährliche und erfordern Exposition gegenüber den Nachweis Medium für ein paar Tage nur 17. So sind Antigen-Kennzeichnung Methoden derzeit dominieren. Der wichtigste Schritt unabhängig vom Protokoll wird die Sonde Design. Es ist darauf zu machen, dass die Sonde hat eine hohe Spezifität und ist mit hochwertigen UTPs gekennzeichnet werden. Manchmal ist die Hybridisierung Temperatur und / oder Reaktion Länge haben, um für spezifische Sonden eingestellt werden. Unsere modifizierte Protokoll auf DIG-markierten Sonden basieren, Lokalisierung von mRNA-Expression gleichzeitig erleichtern Arten von A. thaliana zu P. abies sollte und mit geringfügigen Anpassungen nutzbar sein in anderen Pflanzenarten. Das Protokoll hat neben männlichen Zapfen, auch auf unterschiedlichen Stufen der vegetativen Triebe und in beiden zygotischen und somatische Embryonen aus P. getestet abies mit guten Ergebnissen (unveröffentlichte Ergebnisse;. Karlgren et al).

<table><tbody><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6404-200ml</td><td>mindestens 98 %</td></tr><tr><td>Acrylamid, linear</td><td>Ambion</td><td>9520</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DIG-Antikörper</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blockierreagenz</td><td>Roche Group</td><td>11 175 041 910 oder 11 096 176 001</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-50g</td><td>mindestens 98 %</td></tr><tr><td>deionisiertes Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denhardts Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532-5ml</td><td></td></tr><tr><td>DEPC, Diethylpyrocarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextransulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIG-RNA-Markierungskit (SP6/T7)</td><td>Roche Group</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd (25 %)</td><td>Histolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Ambion</td><td>9510G</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear II</td><td>Histolab</td><td></td><td>Sie können Histoclear II, Tissue-clear, Xylol oder ein ähnliches Mittel zum Einbetten Ihres Gewebes verwenden.</td></tr><tr><td>Histowax</td><td>Histolab</td><td></td><td>Zum Einbetten können Histowax oder Paraplast verwendet werden.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500g</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683-1kg</td><td>Zum Einbetten können Histowax oder Paraplast verwendet werden.</td></tr><tr><td>Phusion&amp;#8482; High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>Finnzymes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probe-on Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-5mg</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-clear</td><td>Sakura Finetek</td><td></td><td>Sie können Tissue-clear, Histoclear II, Xylol oder ein ähnliches Mittel zum Einbetten Ihres Gewebes verwenden.</td></tr><tr><td>Triethanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1377-100ml</td><td>mindestens 98 %</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Verwenden Sie Ihr Standardprodukt im Labor</td><td></td><td>Verwenden Sie entweder Triton X-100 oder Tween-20 oder beide.</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83853-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Verwenden Sie Ihr Standardprodukt im Labor</td><td></td><td>Verwenden Sie entweder Triton X-100 oder Tween-20 oder beide.</td></tr><tr><td>Western Blue</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nicht radioaktiv in situ hybridisierung protocol einsetzbar für fichte und einer reihe von pflanzenarten

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

Die High-Throughput-Expressions-Analyse heute verfügbaren Technologien können Wissenschaftler einen Überlauf des Ausdrucks-Profilen, sondern ihre Auflösung in Bezug auf die gewebespezifische Expression ist aufgrund von Problemen in seziert einzelne Gewebe beschränkt. Expression Daten müssen bestätigt und ergänzt mit Expressionsmuster zB mit in-situ-Hybridisierung, eine Technik zur Lokalisierung zellspezifische mRNA-Expression. Die in-situ-Hybridisierung Methode ist mühsam, zeitaufwendig und erfordert oft umfangreiche Optimierung je nach Art und Gewebe. In situ Experimente sind relativ schwer zu holzigen Arten wie der Nadelbaum Fichte (Picea abies) durchzuführen. Hier präsentieren wir eine modifizierte DIG in-situ-Hybridisierung-Protokoll, das eine schnelle und anwendbar auf eine Vielzahl von Pflanzenarten, darunter P. ist abies. Mit nur wenigen Anpassungen, einschließlich verändertem RNase-Behandlung und Proteinase K-Konzentration, könnten wir das Protokoll gewebespezifische Expression von homologen Gene in männlichen Geschlechtsorgane eines Gymnospermen und zwei Angiospermen Arten zu studieren; P. abies, Arabidopsis thaliana und Brassica napus. Das Protokoll arbeitet gleichermaßen gut für die Arten und Gene untersucht. AtAP3 und BnAP3 wurden in der zweiten und dritten Wirtel Blütenorgane in A. beobachtet thaliana und B. napus und DAL13 in microsporophylls der männlichen Zapfen von P. abies. Für P. abies die Proteinase K-Konzentration verwendet, um das Gewebe permeablize, musste auf 3 erhöht werden g / ml statt 1 g / ml, möglicherweise aufgrund einer kompakteren Gewebe und höhere Phenole und Polysaccharide. Für alle Arten der RNase-Behandlung wurde aufgrund der reduzierten Signalstärke ohne eine entsprechende Erhöhung der Spezifität entfernt. Durch den Vergleich gewebespezifische Expressionsmuster von homologen Gene von beiden Blütenpflanzen und ein Nadelbaum wir zeigen, dass die DIG in situ-Protokoll hier vorgestellt, mit nur minimale Anpassungen, kann auf ein breites Spektrum von Pflanzenarten angewendet werden. Daher vermeidet das Protokoll sowohl umfassende artspezifischen Optimierung und die mühsame Verwendung von radioaktiv markierten Sonden zu Gunsten der DIG-markierten Sonden. Wir haben uns entschieden, die technisch anspruchsvolle Schritte des Protokolls in unserem Film zu veranschaulichen. Anna Karlgren und Jenny Carlsson trugen gleichermaßen zu dieser Studie. Entsprechende Autoren: Anna Karlgren bei Anna.Karlgren @ ebc.uu.se und Jens F. Sundström bei Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

Wir beschreiben ein modifiziertes DIG<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung Protokoll, das eine schnelle und anwendbar auf eine Vielzahl von Pflanzenarten, darunter Fichte ist. Mit nur wenigen Anpassungen, einschließlich verändertem RNase-Behandlung und Proteinase K-Konzentration kann das Protokoll in Studien von verschiedenen Geweben und Spezies verwendet werden.

Nicht radioaktiv In situ Hybridisierung Protocol Einsetzbar für Fichte und einer Reihe von Pflanzenarten

Die heute verfügbaren Hochdurchsatz-Technologien zur Expressionsanalyse liefern Wissenschaftlern eine Flut von Expressionsprofilen, doch deren Auflösung im Hinblick auf ...

Nicht-radiologisches In-situ-Hybridisierungsprotokoll, anwendbar für Fichte und eine Reihe von Pflanzenarten. Carre Etal. Hallo, mein Name ist AM GaN, und wir arbeiten an der OBS University und der Schwedischen Universität für Agrarwissenschaften in obs Schweden.Wir haben ein Bestäubungsbesuchsprotokoll etabliert, das an mehreren verschiedenen Pflanzenarten anwendbar ist. Heute werden wir Ihnen einige anspruchsvolle Schritte zeigen. In diesem Protokoll demonstrieren wir Ihnen das Einbetten, Schneiden sowie verschiedene Schritte des eigentlichen Bestäubungsbesuchs-Experiments.Gehen wir zum Labor 1, Fixierung und Einbettung, Schritt neun bis elf im Protokoll. Schritt neun: Petrischalen und Formen bei 60 Grad Celsius vorwärmen. Schritt zehn: Ein Paar Pinzetten erhitzen und das Gewebe gleichmäßig in einer Schale verteilen.Fügen Sie mehr Histowachs hinzu, sodass die Gewebe bedeckt sind. Schritt 11: Lassen Sie das Wachs bei Raumtemperatur aushärten. Zwei geschlechtliche Schritte 12 bis 19 im Protokoll.Schalten Sie die Heizplatten ein und stellen Sie geschmolzenes Histowachs bereit. Entnehmen Sie die Proben aus dem Kühllager. Schritt 13: Schneiden Sie mit einem Skalpell vorsichtig einen Wachsstab mit Gewebe aus.Formen Sie das Stück, um das Schneiden zu erleichtern. Schritt 14: Erwärmen Sie den Block kalt und verschmelzen Sie die Ferse, um sie miteinander zu verbinden. Lassen Sie das Präparat bei vier Grad Celsius aushärten.Schritt 15: Schneiden Sie den Wachsblock in sechs bis acht Mikrometer dicke Schnitte. Mit einem Mikrotom entstehen die Schnitte als ein langer Band. Zerschneiden Sie das Band und übertragen Sie es auf Papier.An diesem Punkt ist es möglich, die einzelnen Schnitte unter einem Stereomikroskop zu untersuchen, um Schnitte von Interesse auszuwählen. Die Untersuchung gelingt am einfachsten bei Geweben, die mit Eosin gefärbt sind. Schritt 17: Geben Sie RNA-freies Milli-Q-Wasser auf die Objektträger.Schneiden Sie das Band in kleinere Stücke und legen Sie sie auf die Objektträger. Bewegen Sie die Objektträger auf die Heizplatte. Schritt 17: Lassen Sie die Bänder sich für eine bis zwei Minuten auf einer 42 Grad Celsius heißen Platte abflachen.Entfernen Sie das Wasser mit Kim-Oil. Schritt 19: Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 42 Grad Celsius, damit die Gewebe für die In-situ-Hybridisierung 4.1 im In-situ-Abschnitt vier Tage lang an den Objektträgern haften. Vorbehandlungsschritte 36 bis 48 im Protokoll.Schritt 36 Deparaffinierungsschnitte in der Histo-Schicht. Die Objektträger werden gleichmäßig beabstandet in ein Gestell gegeben, um die Handhabung zwischen verschiedenen Behältern zu erleichtern, und die Schnitte werden dehydriert. In einer Ethanolreihe wird Essigsäureanhydrid unter starkem Rühren zugegeben.Schritt 45, Vorbereitung für die Behandlung mit Essigsäureanhydrid 4.2 in situ-Hybridisierung. Schritte 49 bis 52 in einem Protokoll. Schritt 51, Altern der Pro-One-plus-Objektträger.Die Lösung ist viskos. Versuchen Sie, Blasen zu vermeiden. Inkubieren Sie die Objektträger in einer feuchten Kammer.4.3 init. Nach der Hybridisierung die Schritte 53 bis 72 im Protokoll. Schritt 62: Die Objektträger in einem Plastikbehälter mit dem Burer-Block inkubieren.Schritt 63: Geben Sie so viel Blockierungslösung hinzu, dass die Objektträger gerade bedeckt sind. Die Antikörper werden mittels Alterung auf die Objektträger aufgebracht. Die Alterung funktioniert nur mit Prob-Bon-Plus-Objektträgern. Für Objektträger mit ähnlichem Design, Schritt 65: Lassen Sie die Kapillarkräfte die Anti-Dig-Antikörper-Lösung aufziehen.Dieser Schritt wird wiederholt. Schritt 70, wie zuvor, Sandwich und die Western-Blue-Lösung aufziehen. Beachten Sie, dass die Western-Blue-Lösung zweimal aufgezogen wird, genau wie wir es für die Anti-Dig-Antikörperlösung gemacht haben.Und Schritt 65, Schritt 71: Die Objektträger im Dunkeln für ein bis fünf Tage inkubieren. Bei Raumtemperatur kann die Überwachung der Hybridisierungssignale mit einem Stereomikroskop erfolgen. Solange die Objektträger noch versandwiched sind, sollten violette bis bräunliche Färbungen sichtbar sein.So sehen die Ergebnisse des CW-Station-Experiments tatsächlich aus. Das Signal ist hier als violette oder bräunliche Färbung zu erkennen.

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