Nicht radioaktiv In situ Hybridisierung Protocol Einsetzbar für Fichte und einer Reihe von Pflanzenarten
17. April 2009
Wir beschreiben ein modifiziertes DIG In situ Hybridisierung Protokoll, das eine schnelle und anwendbar auf eine Vielzahl von Pflanzenarten, darunter Fichte ist. Mit nur wenigen Anpassungen, einschließlich verändertem RNase-Behandlung und Proteinase K-Konzentration kann das Protokoll in Studien von verschiedenen Geweben und Spezies verwendet werden.
Nicht-radiologisches In-situ-Hybridisierungsprotokoll, anwendbar für Fichte und eine Reihe von Pflanzenarten. Carre Etal. Hallo, mein Name ist AM GaN, und wir arbeiten an der OBS University und der Schwedischen Universität für Agrarwissenschaften in obs Schweden.
Wir haben ein Bestäubungsbesuchsprotokoll etabliert, das an mehreren verschiedenen Pflanzenarten anwendbar ist. Heute werden wir Ihnen einige anspruchsvolle Schritte zeigen. In diesem Protokoll demonstrieren wir Ihnen das Einbetten, Schneiden sowie verschiedene Schritte des eigentlichen Bestäubungsbesuchs-Experiments.
Gehen wir zum Labor 1, Fixierung und Einbettung, Schritt neun bis elf im Protokoll. Schritt neun: Petrischalen und Formen bei 60 Grad Celsius vorwärmen. Schritt zehn: Ein Paar Pinzetten erhitzen und das Gewebe gleichmäßig in einer Schale verteilen.
Fügen Sie mehr Histowachs hinzu, sodass die Gewebe bedeckt sind. Schritt 11: Lassen Sie das Wachs bei Raumtemperatur aushärten. Zwei geschlechtliche Schritte 12 bis 19 im Protokoll.
Schalten Sie die Heizplatten ein und stellen Sie geschmolzenes Histowachs bereit. Entnehmen Sie die Proben aus dem Kühllager. Schritt 13: Schneiden Sie mit einem Skalpell vorsichtig einen Wachsstab mit Gewebe aus.
Formen Sie das Stück, um das Schneiden zu erleichtern. Schritt 14: Erwärmen Sie den Block kalt und verschmelzen Sie die Ferse, um sie miteinander zu verbinden. Lassen Sie das Präparat bei vier Grad Celsius aushärten.
Schritt 15: Schneiden Sie den Wachsblock in sechs bis acht Mikrometer dicke Schnitte. Mit einem Mikrotom entstehen die Schnitte als ein langer Band. Zerschneiden Sie das Band und übertragen Sie es auf Papier.
An diesem Punkt ist es möglich, die einzelnen Schnitte unter einem Stereomikroskop zu untersuchen, um Schnitte von Interesse auszuwählen. Die Untersuchung gelingt am einfachsten bei Geweben, die mit Eosin gefärbt sind. Schritt 17: Geben Sie RNA-freies Milli-Q-Wasser auf die Objektträger.
Schneiden Sie das Band in kleinere Stücke und legen Sie sie auf die Objektträger. Bewegen Sie die Objektträger auf die Heizplatte. Schritt 17: Lassen Sie die Bänder sich für eine bis zwei Minuten auf einer 42 Grad Celsius heißen Platte abflachen.
Entfernen Sie das Wasser mit Kim-Oil. Schritt 19: Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 42 Grad Celsius, damit die Gewebe für die In-situ-Hybridisierung 4.1 im In-situ-Abschnitt vier Tage lang an den Objektträgern haften. Vorbehandlungsschritte 36 bis 48 im Protokoll.
Schritt 36 Deparaffinierungsschnitte in der Histo-Schicht. Die Objektträger werden gleichmäßig beabstandet in ein Gestell gegeben, um die Handhabung zwischen verschiedenen Behältern zu erleichtern, und die Schnitte werden dehydriert. In einer Ethanolreihe wird Essigsäureanhydrid unter starkem Rühren zugegeben.
Schritt 45, Vorbereitung für die Behandlung mit Essigsäureanhydrid 4.2 in situ-Hybridisierung. Schritte 49 bis 52 in einem Protokoll. Schritt 51, Altern der Pro-One-plus-Objektträger.
Die Lösung ist viskos. Versuchen Sie, Blasen zu vermeiden. Inkubieren Sie die Objektträger in einer feuchten Kammer.
4.3 init. Nach der Hybridisierung die Schritte 53 bis 72 im Protokoll. Schritt 62: Die Objektträger in einem Plastikbehälter mit dem Burer-Block inkubieren.
Schritt 63: Geben Sie so viel Blockierungslösung hinzu, dass die Objektträger gerade bedeckt sind. Die Antikörper werden mittels Alterung auf die Objektträger aufgebracht. Die Alterung funktioniert nur mit Prob-Bon-Plus-Objektträgern. Für Objektträger mit ähnlichem Design, Schritt 65: Lassen Sie die Kapillarkräfte die Anti-Dig-Antikörper-Lösung aufziehen.
Dieser Schritt wird wiederholt. Schritt 70, wie zuvor, Sandwich und die Western-Blue-Lösung aufziehen. Beachten Sie, dass die Western-Blue-Lösung zweimal aufgezogen wird, genau wie wir es für die Anti-Dig-Antikörperlösung gemacht haben.
Und Schritt 65, Schritt 71: Die Objektträger im Dunkeln für ein bis fünf Tage inkubieren. Bei Raumtemperatur kann die Überwachung der Hybridisierungssignale mit einem Stereomikroskop erfolgen. Solange die Objektträger noch versandwiched sind, sollten violette bis bräunliche Färbungen sichtbar sein.
So sehen die Ergebnisse des CW-Station-Experiments tatsächlich aus. Das Signal ist hier als violette oder bräunliche Färbung zu erkennen.
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein modifiziertes DIG-In-situ-Hybridisierungsprotokoll vor, das effizient und an verschiedene Pflanzenarten, einschließlich der Fichte (Norway spruce), anpassbar ist. Das Protokoll beinhaltet spezifische Anpassungen, wie beispielsweise Änderungen in der RNase-Behandlung und der Proteinase-K-Konzentration, um seine Anwendbarkeit auf verschiedene Gewebe und Arten zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenbiologie
- Molekularbiologie
- In-situ-Hybridisierungstechniken
Hintergrund
- Die In-situ-Hybridisierung ist eine wertvolle Technik zur Untersuchung der Genexpression in Geweben.
- Herkömmliche Methoden können zeitaufwendig und artenspezifisch sein.
- Modifikationen bestehender Protokolle können die Effizienz und Vielseitigkeit verbessern.
- Diese Studie konzentriert sich auf ein Protokoll, das für eine Vielzahl von Pflanzenarten geeignet ist.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines schnelleren und flexibleren Protokolls für die in-situ-Hybridisierung.
- Nachweis der Anwendbarkeit des Protokolls an Fichten (Norway spruce) und anderen Pflanzenarten.
- Detaillierte Beschreibung der Verfahrensschritte für Forscher.
Verwendete Methoden
- Einbetten und Schneiden von Pflanzengeweben.
- Vorbehandlung und Hybridisierungsschritte für die in-situ-Analyse.
- Verwendung spezifischer Reagenzien und Bedingungen zur Optimierung der Ergebnisse.
- Überwachung der Hybridisierungssignale am Mikroskop.
Hauptergebnisse
- Das modifizierte Protokoll ermöglicht erfolgreich die In-situ-Hybridisierung an mehreren Pflanzenarten.
- Anpassungen der RNase-Behandlung und der Proteinase-K-Konzentration verbessern die Gewebekompatibilität.
- Eine klare Visualisierung der Hybridisierungssignale wurde erreicht.
- Das Protokoll ist effizient und reproduzierbar für verschiedene Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Das modifizierte DIG-In-situ-Hybridisierungsprotokoll ist ein wertvolles Werkzeug für die Pflanzenforschung.
- Es ermöglicht eine schnelle und effektive Analyse der Genexpression in verschiedenen Pflanzengeweben.
- Zukünftige Studien können auf diesem Protokoll aufbauen, um breitere Anwendungen in der Pflanzenbiologie zu erschließen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse der räumlichen Genexpression mit hoher Auflösung in Pflanzensystemen und unterstützt die Zielvalidierung in der frühen Entdeckungsphase, indem gewebespezifische Expressionsmuster bestätigt werden. Es verringert die Abhängigkeit von Radioisotopen und umfangreicher, artenspezifischer Optimierung und verbessert dadurch die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit für vergleichende, artenübergreifende Studien. Die Methode bietet einen mechanistischen Entlastungswert für die phänotypische Bildschirmprüfung und die Entdeckung translationaler Biomarker in pflanzenbasierten Biopharma-Pipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Bestätigt die gewebespezifische mRNA-Lokalisation, um therapeutische Hypothesen zu überprüfen und die Genfunktion in Entwicklungsprozessen der Fortpflanzung zu klären.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch direkte Visualisierung der Genexpression in männlichen Fortpflanzungsorganen bei Modellen von Gymnospermen und Angiospermen.
- Prädiktiver Wert: Stärkt die Vorhersagekraft, indem konservierte Expressionsmuster homologer Gene (z. B. AP3-Homologe) in Blütenstrukturen von Arabidopsis, Brassica und der Fichte nachgewiesen werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet standardisierte Gewebeschnitte für nachgeschaltete Hybridisierungsassays mit konsistenter Signaldetektion unter Verwendung DIG-markierter Sonden vor.
- Reproduzierbarkeit: Verzichtet auf RNase-Behandlung und passt die Proteinase-K-Konzentration an, um die Signalstärke zu erhöhen und die Variabilität zwischen Arten zu verringern.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht eine Hochdurchsatzanwendung über verschiedene Pflanzenarten hinweg mit minimalen Protokollanpassungen und ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform in der vergleichenden Genomik.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Zeigt die Übertragbarkeit von Modell-Angiospermen auf Gymnospermen auf und unterstützt die Extrapolation der Ergebnisse auf holzige mehrjährige Systeme, die für die Biomasse- und Biopolymerproduktion relevant sind.
- Mechanistische Ent风险reduktion: Verringert die Unsicherheit bei der Zuordnung von Genfunktionen, indem die Sequenzhomologie mit der räumlichen Expression in konservierten Entwicklungsstrukturen verknüpft wird.
- Biomarker-Korrelation: Ermöglicht die räumliche Korrelation von Genexpression mit phänotypischen Merkmalen in Fortpflanzungsgeweben und unterstützt so die Identifizierung von Biomarkern im pflanzlichen molekularen Farming.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode ist in die Entdeckungsbiologie-Phase integriert und ermöglicht eine hypothesengetriebene Zielstrukturidentifizierung vor der Leitsubstanz-Screening-Phase in pflanzlichen Expressionssystemen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch die Validierung der räumlichen Expression von Kandidatengenen in spezifischen Geweben und Entwicklungsstadien.
- Screening: Erzeugt quantitative, räumliche Messwerte, die die Assay-Entwicklung für die Überwachung von Substanzeffekten in transgenen oder behandelten Geweben unterstützen.
- Analytik: Erzeugt nachweisbare chromogene Signale (von lila bis bräunlich), die bildgebende Verfahren und vergleichende Analysen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Genexpressionsmuster mit Entwicklungsphänotypen in Fortpflanzungsorganen und unterstützt so Entscheidungen zur Weiterentwicklung in Validierungspipelines für Merkmale.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen standardisierten und anpassbaren Workflow für die genexpressionelle Analyse über Arten hinweg und reduziert damit redundante Optimierungsarbeiten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung durch direkte, räumlich aufgelöste Nachweise von mRNA ohne radioaktive Gefahren.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit, indem die RNase-Behandlung entfällt und der Einsatz von Proteinase K standardisiert wird, wodurch die Rate an Protokollfehlern sinkt.
- Strategischer Wert: Beschleunigt Go/No-Go-Entscheidungen bei der Zielstrukturauswahl, indem eindeutige Expressionsdaten frühzeitig im Entdeckungsprozess bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf konservierten Expressionsmustern über verschiedene Arten hinweg und verbessert so die Erfolgsraten in nachfolgenden Anwendungen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Histologie, Gewebeeinbettung und Schneiden pflanzlicher Materialien.
- Setzt Zugang zu Mikrotomen, Hybridisierungsöfen und chromogenen Nachweissystemen voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Proteinase-K-Konzentration entsprechend der Gewebedichte und des Gehalts an phenolischen Verbindungen.
- Beinhaltet die Anpassung von Inkubationszeiten und -temperaturen je nach Art und Länge der Sonden.
- Ist durch Autofluoreszenz des Gewebes und eingeschränkte Penetration der Reagenzien in stark verholzten oder probeichenreichen Proben begrenzt.
