Name: Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-13T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Lernen Sie die Fluoreszenzmarkierung von Herzstrukturen in Drosophila melanogaster für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende konfokale Mikroskopie und morphologische Analyse.

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Die Autoren danken SI Bernstein (San Diego State University) für die kritische Durchsicht und Anregungen in Bezug auf die Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt SI Bernstein, SDSU, und R. Bodmer, BIMR unterstützt, und durch ein Postdoc-Stipendium von der Western States Partner der American Heart Association zu G. Vogler und A. Cammarato.

Bevor Sie beginnen <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: <ol class="lalpha"><li> Entspannung Puffer (künstliche Drosophila Hämolymphe (ADH) (siehe &quot;Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila&quot;), die 10 mM EGTA enthält) </li><li> Fixativ (4% Formaldehyd in 1x PBS) </li><li> PBSTx (PBS mit 0,1% Triton-X-100) </li><li> Entsprechend verdünnten Primär-und Spezies-spezifische fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper in PBSTx </li></ol></li><li> Dissect Drosophila, die Herz-Röhren (von erwachsenen Fliegen und / oder Larven) folgende aussetzen <ol class="lalpha"><li> die semi-intakten Drosophila Herzen Vorbereitung Protokoll in &quot;Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila&quot;, oder </li><li> Drosophila Larven NMJ Dissection-Protokoll 1 mit folgenden Änderungen: Mit Sauerstoff ADH während Larven Dissektion und verdrängen den hinteren Stift leicht von der ventralen Mittellinie. Die Larven sind entlang der ventralen Mittellinie geschnitten. Entfernen Sie nicht jedes Gewebe vor der Fixierung. </li></ol></li></ol> Fluoreszenzfärbung <ol><li> Prüfen Sie, ob alle Herzen sind rhythmisch schlagen in Sauerstoff ADH. Schnell zu ersetzen ADH mit entspannenden Puffer. Untersuchen Sie jeden Herzschlauchs, um sicherzustellen, Kontraktionen gehemmt werden. </li><li> Fix die Herzen durch den Austausch des entspannten Puffer mit Fixativ. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 Minuten unter leichtem Schütteln. (Für Larven Vorbereitung Schütteln ist nicht notwendig, bei jedem Schritt, und darf als schädlich für Herzgewebe Integrität). </li><li> Wash Proben dreimal für 10 Minuten mit PBSTx bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln. </li><li> Für Erwachsene, sorgfältig trimmen zurück ventralen Kanten der abdominalen Häutchen, wie das, was bleibt, ist mehr elliptisch und weniger abgerundet. Zusätzlich mit einem einzigen Schnitt zwischen den Bauch und Brustkorb, sorgfältig und sauber zu trennen beide Körper ab und sorgen für minimale Schäden an den vorderen Bereich des Herzens. Für Larven Herzen, entfernen Sie vorsichtig die fetten Körper mit feinen Pinzetten. Die Fettabsaugung muss mit äußerster Vorsicht ausgeführt werden, da die Larven Herz ist besonders empfindlich und hat sehr wenig Unterstützung von anderen Muskeln oder Bindegewebe. Entfernen Sie nicht die trachealen Äste, da dies das Herz schädigen können. </li><li> Übertragen Sie die getrimmt dorsalen Bereich der Bauch-Nagelhaut an den Rändern, Vermeidung von Kontakt mit dem zentral gelegenen Herz-Rohr, in eine 96-Well-Platte mit Brunnen dass 50-100 ul des primären Antikörpers in PBSTx verdünnt enthalten. Legen Sie nicht mehr als 12 Proben pro Vertiefung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter ständigem Rühren. Incubation kann auch über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen primärer Antikörper-Lösung. Waschen Sie die Herzen dreimal für 10 Minuten mit 100 ul PBSTx bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln. </li><li> Nach dem Entfernen des letzten Waschpuffer, 100 ul des sekundären Antikörpers in PBSTx mit Alexa594-Phalloidin (1:1000) ergänzt. Inkubieren für eine Stunde unter ständigem Schütteln bei Raumtemperatur. Keep Proben abgedeckt, um zu verhindern Fluorophor Bleichen. </li><li> Nach sekundären Inkubation, waschen Sie die Herzen dreimal für 10 Minuten mit 100 ul PBSTx bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln. Halten Sie die Proben während der Waschschritte abgedeckt. </li><li> Zur Entfernung von Triton-X-100, spülen Sie die Herzen ein letztes Mal in 100 ul PBS für 10 Minuten. Die Proben können im Dunkeln bei 4 ° C für mehrere Tage gelagert, bevor Montage. </li></ol> Halterung für Adult Herzen <ol><li> Beachten zwei 18 x 18 mm Deckgläser auf einen Objektträger mit 10 ul Vectashield Eindeckmedium. Die Deckgläser sollten ~ 10-15 mm auseinander liegen. Legen Sie eine kleine Terz Tropfen Eindeckmedium in-zwischen den beiden Deckgläsern. </li><li> Platz 20 ul der Vectashield in der Mitte ein Drittel Deckglas. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig jede der Herzen aus dem PBS-Waschlösung durch den äußersten Rändern der Kutikula, und sanft lege sie Herz-Seite nach unten auf den Tropfen Eindeckmedium auf der dritten Deckglas. Legen Sie nicht mehr als fünf Herzen pro Tropfen auf dem Deckglas. </li><li> Überprüfen Sie unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, alle Herzen nach unten zeigen. </li><li> Vorsichtig umdrehen das Deckglas mit dem Herzen und schnell platzieren Sie es auf die Folie mit den zwei Deckgläser, so dass die Tropfen mit kardiologischen Rohre verschmilzt mit dem Vectashield Tropfen zwischen Deckglas Paar. Eine &quot;Brücke&quot; sollte durch die Deckgläschen gebildet werden. Die Herzen werden zwischen einem Deckglas und dem Objektträger suspendiert werden. </li><li> Überprüfen Sie unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Herzen sind jetzt nach oben. </li><li> Fix Deckgläschen an ihren Rändern mit Nagellack. </li><li> Die Herzen sind nun bereit, über fluoreszierende oder konfokalen Mikroskopie abgebildet werden. </li></ol><ol><li> Geben Sie einen Tropfen (~ 20 ul) Vectashield auf einen Objektträger. </li><li> Sorgfältig Transfer bis zu zwei Larven Exemplaren in die Vectashield und orientieren sie dorsalen Seite nach unten mit Wolfram Nadeln. </li><li> Individuell ziehen Sie die Proben aus dem Eindeckmedium und richten jeweils parallel. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf gegenüberliegenden Seiten der Probe. Mit einer Pinzette, statt ein Drittel Deckglas auf, zunächst durch Verlegung einer Seite auf die hintere Deckglas und Senken es auf den vorderen Deckglas bildet somit eine Brücke. Kapillarkräfte verursacht einen Strom von Vectashield von posterior nach anterior, die korrekte Ausrichtung der Larven Herzen hilft. </li><li> Fix alle Deckgläser in Ort, an ihren Rändern, mit Nagellack und sorgfältig füllen den Raum zwischen den Deckgläschen mit 20-30 ul Vectashield. </li><li> Seal mit Nagellack und lagern bei 4 ° C, oder für die langfristige Lagerung bei -20 ° C. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Wenn richtig ausgeführt, sollten alle Komponenten und der dazugehörigen Gewebe des dorsalen Gefäß intakt bleiben und leicht sichtbar gemacht werden. Die Hintergrund-Fluoreszenz sollte minimal sein. Für Erwachsene, die ventralen Längs-Muskelschicht Flecken sehr gut und erzeugt eine erhebliche Signal (Abbildung 1 und Abbildung 2). Die zugrunde liegenden kreisförmigen Kardiomyozyten jedoch eher nicht so intensiv ein Signal, dass der darüberliegenden ventralen Schicht zu erzeugen. Die Myozyten des vorderen &quot;konischen Kammer&quot; des erwachsenen Herzens enthalten eine beträchtliche Menge von kontraktilen Materials und damit erscheint diese Region als die robustesten gegenüber dem Rest des Herzschlauches. Die Larven Herz zeigt eine Spirale myofibrillären Anordnung ähnlich der des Erwachsenen kontraktilen Kardiomyozyten (Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="Abbildung 1a" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 1b" /> Abbildung 1: Top. Ein fluoreszierendes Aufnahme zeigt das gesamte Herz-Rohr eines erwachsenen Drosophila melanogaster, dass Myosin-GFP zum Ausdruck bringt. Das Bild wurde mit einem Zeiss-Imager Z1 Fluoreszenzmikroskop mit einer Apotome Schiebe-Modul ausgestattet übernommen. Myosin-GFP in grün angezeigt wird, Aktin ist mit AlexaFluor ® 594 Phalloidin (rot) und α-Actinin gefärbt mit anti-α-Antikörper actinin (blau) markiert. Beachten Sie die präparativen Verfahren ermöglicht Wiederherstellung von Herz-Proben mit gut erhaltenen Strukturen. CC = konische Kammer; AM = Alary Muskel; V = internes Ventil; VLL = ventralen Längs-Muskelschicht. Bottom. Eine Region der erwachsenen Herzschlauchs von der CC durch das 3. Abdominalsegment des Herzens nur unter der ventralen Längs-Schicht zeigt die Spirale Myofibrille Anordnung der kontraktilen Kardiomyozyten. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg">klicken Sie hier</a> für eine größere Version der Abbildung 1a und <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg">hier</a> für eine größere Version der Abbildung 1b <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Repräsentative konfokalen Stapel von einer vorderen Teil des erwachsenen Herzens mit AlexaFluor ® 594 Phalloidin (rot) und ein Anti-Pericardin (Kollagen Typ IV) (grün)-Antikörper gefärbt. Pericardin ist mit dem Herzen an der ventralen Fläche verbunden sind, wahrscheinlich aus dem längsorientierten Myofibrillen der ventralen Muskelschicht. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg">klicken Sie hier</a> für eine größere Version der Abbildung 2 dargestellt. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Ein fluoreszierendes Aufnahme Segment A7 des Herzens ordnungsgemäße einer dritten Stufe Drosophila Larve. Das Bild wurde mit einem Zeiss-Imager Z1 Fluoreszenzmikroskop mit einer Apotome Schiebe-Modul ausgestattet übernommen. Aktin ist mit AlexaFluor ® 594 Phalloidin (grün) und α-Actinin beschriftet ist mit Anti-α-Antikörper actinin (rot) gefärbt. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg">klicken Sie hier</a> für eine größere Version der Abbildung 3 dargestellt.

<ol><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ostia%2C+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart%2C+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mech Dev. 1, 51-59 (2001).</li>
<li>Dulcis, D., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+innervation+of+the+heart+initiates+retrograde+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 2, 271-280 (2005).</li>
<li>Zeitouni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+adult+heart+formation+revealed+by+gene+expression+profiling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila.</a> PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).</li>
<li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%2C+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change.</a> J. Morphol. 2, 351-399 (1936).</li>
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<li>Mery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+muscle+LIM+protein%2C+Mlp84B%2C+is+essential+for+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).</li>
</ol>

Hier präsentieren wir ein Protokoll, die zur Herstellung und Färbung der Drosophila melanogaster dorsalen Gefäß und der dazugehörigen Gewebe für die Bildgebung mittels Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie. Wir bieten eine übersichtliche Darstellung der Schritte verfeinert und am häufigsten in unserem Labor für eine effektive Färbung, die gut aufgelösten erlaubt in situ Darstellung von Larven und erwachsenen Drosophila Herzen Rohre eingesetzt. Andere haben ähnliche Methoden in abgekürzter Fo...

<table><tbody><tr><td>Ethylenglykol-bis(2-aminoethyläther)-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd, 10 %, methanolfrei, ultrarein</td><td>Reagenz</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;#174; 594 Phalloidin</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield&amp;#174; Eindeckmedium für Fluoreszenz mit DAPI</td><td>Reagenz</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wolframnadeln</td><td>Reagenz</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Reagenz</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszenzmarkierung drosophila herz structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Die<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Dorsalen Gefäß oder Herz, ist eine röhrenförmige Struktur aus einer einzigen Schicht von kontraktilen Kardiomyozyten, Herzbeutel-Zellen, die an jeder Seite der Herzwand, unterstützende Alary Muskeln und bei Erwachsenen, eine Schicht der ventralen Längs-Muskelzellen align zusammen. Die kontraktilen Fasern Haus konservierte Bestandteile des Muskels Zytoarchitektur einschließlich dicht gepackte Bündel von Myofibrillen und Zytoskelett / submembranous Protein-Komplexe, die mit homologen Komponenten der extrazellulären Matrix interagieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Fixierung und die Fluoreszenzmarkierung insbesondere Myokardinfarkt Elemente aus den Herzen der sezierten Larven und semi-intakten, erwachsenen<em&gt; Drosophila</em&gt;. Insbesondere zeigen wir, die Kennzeichnung von Sarkomer F-Aktin und der α-Actinin in Larven Herzen. Darüber hinaus führen wir von F-Aktin und α-Actinin Kennzeichnung in Myosin-GFP-exprimierenden erwachsenen Fliegen und der α-Actinin und pericardin, eine Typ-IV-Kollagen der extrazellulären Matrix, in Wildtyp erwachsenen Herzen. Besonderes Augenmerk wird auf einer Montageplatte Strategie für semi-intakten, erwachsenen Herzen, die Handhabung minimiert und optimiert die Möglichkeit zur Aufrechterhaltung der Integrität des Herz-Rohren und dem dazugehörigen Gewebe gegeben. Diese Präparate eignen sich für die Bildgebung mittels Fluoreszenz-und konfokale Mikroskopie. Insgesamt ermöglicht dieses Verfahren eine sorgfältige und detaillierte Analyse der strukturellen Merkmale des Herzens von einem leistungsstarken genetisch manipulierbaren Modellsystem.

Hier beschreiben wir eine grundlegende Protokoll für die Fluoreszenzmarkierung der verschiedenen Elemente des Herzens Rohre von Larven und erwachsenen<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;. Diese Proben sind für die Bildgebung mittels Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie geeignet. Diese Technik ermöglicht detaillierte Strukturanalyse der Funktionen des Herzens von einem leistungsstarken Modell-Organismus.

Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures

Das Dorsalgefäß oder Herz von Drosophila melanogaster ist eine röhrenförmige Struktur, die aus einer einzelnen Schicht kontraktiler Kardiomyozyten, Perikardzellen ...

Hallo, ich bin Nikita Ari aus dem Labor von Ralph Boer im Programm für Entwicklung und Alterung am Burnham Institut für Medizinische Forschung. Ich bin Gil ler, ebenfalls aus dem unteren Labor. Heute werden wir Ihnen Verfahren zur fluoreszenzmarkierten Färbung von Larven- und adulten Präsynaptischen Herzzellen zeigen.Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um die Herzzentren für die morphologische und strukturelle Analyse mittels konfokaler oder fluoreszenzbasierter Mikroskopie vorzubereiten, um Herzstrukturen in adulten Drosophila fluoreszenzmarkiert darzustellen. Zunächst wird ein einzelner Schnitt zwischen Thorax und Abdomen an einem halb intakten Adulten durchgeführt, um die Körperteile zu trennen. Anschließend werden die überstehenden ventralen Ränder der adulten Cuticula gekürzt.Als Nächstes überführen und markieren Sie adulte oder dissezierte larvale Präparate mit primären und sekundären Antikörpern. Bringen Sie nach der Markierung gewaschene adulte Präparate in Position, indem Sie die Cuticula-Ränder halten und sie mit der Herzseite nach unten auf einen Tropfen Vector Shield auf einem Deckglas legen. Drehen Sie das Deckglas um und platzieren Sie es auf einen Tropfen Medium, der auf einem Objektträger von zwei Deckgläsern als Brücke flankiert wird. Die Herzen sind nun für die Montage larvaler Herzen aufrecht suspendiert.Übertragen Sie die Proben auf einen Objektträger, wobei die ventralen Seiten nach unten zeigen, und montieren Sie zwei Deckgläser auf beiden Seiten des Objektträgers. Schließlich bilden Sie eine Brücke mit einem dritten Deckglas, indem Sie es zunächst auf das Deckglas in der Nähe der hinteren Enden der Larven legen. Die Herzen sind nun bereit für die Bildgebung.Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie den folgenden A DH-Puffer mit A DH vor, wie in einem anderen Video-Protokoll dieser Serie beschrieben, mit 10 Millimolar EGTA-Fixans, bestehend aus 4 % Formaldehyd in 1 x P B S P B S, TX, sowie angemessen verdünnten primären Antikörpern und fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern. In PBS TX sezieren Sie erwachsene und larvale Drosophila, um die Herzzellen freizulegen, entsprechend der halbintakten Drosophila-Herzpräparation, die in den Video-Protokollen zur Visualisierung des schlagenden Herzens bei Drosophila und der Drosophila-Larven-NMJ-Sezierung gezeigt wird. Mit Modifikationen verwenden Sie während der Larven-Präparation oxygenierten A DH und positionieren die hinteren Nadeln leicht seitlich von der ventralen Mittellinie der Larve.Schneiden Sie entlang der ventralen Mittellinie. Entfernen Sie kein Gewebe, bevor es in den folgenden Schritten fixiert wird. Beginnen Sie die Markierung, indem Sie unter dem Mikroskop überprüfen, ob alle Herzen rhythmisch in einer mit Sauerstoff angereicherten A-DH-Lösung kontrahieren und sich entspannen. Ersetzen Sie dann schnell die A-DH-Lösung durch Puffer zur Muskelentspannung und überprüfen Sie erneut jedes Herzrohr, um sicherzustellen, dass die Kontraktionen unterbunden sind.Fortfahren mit der Fixierung der Herzen, indem der Relaxationspuffer durch Fixansatz ersetzt wird. Bei Raumtemperatur 20 Minuten unter leichtem Schütteln inkubieren. Beachten Sie, dass bei larvalen Präparationen das Schütteln in keinem Schritt erforderlich ist und möglicherweise sogar die Integrität des Herzmuskels beeinträchtigen kann.Nach Ablauf von 20 Minuten das Fixierungsmittel entfernen und die Proben dreimal für jeweils 10 Minuten mit P-B-S-T-X waschen. Bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln vorsichtig und sauber bei erwachsenen Exemplaren einen Schnitt zwischen Abdomen und Thorax anlegen. Beide Körperteile voneinander trennen, um Schäden an der vorderen Region des Herzens möglichst gering zu halten.Seien Sie vorsichtig, um nicht in den vorderen Bauchabschnitt einzuschneiden, in dem sich die konische Kammer des Herzens befindet. Untersuchen Sie das Präparat unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass ein sauberer Schnitt angelegt wurde. Danach sollten Sie vorsichtig alle überstehenden ventralen Ränder der Bauchkutikula zurückschneiden, sodass das verbleibende Gebiet eher elliptisch als rundlich ist. Entfernen Sie mit feinen Pinzetten vorsichtig den Fettkörper bei Larvenherzen. Gehen Sie dabei äußerst vorsichtig vor. Da das Larvenherz besonders empfindlich ist und kaum durch andere Muskeln oder Bindegewebe gestützt wird, sollten Sie die Trachealäste nicht entfernen, da dies das Herz beschädigen könnte.Als Nächstes mit dem Primärantikörper inkubieren, der in PVS TX verdünnt ist und mit 50 Mikrolitern pro Vertiefung einer 96-Loch-Platte appliziert wird. Bei adulten Fliegen die beschnittene dorsale Cuticula an den Rändern festhalten, ohne das zentral gelegene Herzrohr zu berühren, und in die Platte überführen. Pro Vertiefung nicht mehr als 12 Exemplare platzieren und bei Raumtemperatur zwei Stunden unter kontinuierlicher Agitation inkubieren.Halten Sie die Larvenpräparate mit einer Pinzette an der Kante fest und überführen Sie sie in mit P-B-S-T-X gefüllte Vertiefungen. Schütteln Sie die Larvenpräparate am Ende der Inkubation nicht. Entfernen Sie die Primärantikörperlösung.Waschen Sie die Herzen nach dem letzten Waschschritt mit 100 Mikroliter sekundärem Antikörper in PBS-Tx, ergänzt mit Alexa 594 Phin, dreimal für jeweils 10 Minuten mit 100 Mikroliter P-B-S-T-X bei Raumtemperatur. Decken Sie die Proben ab, um von nun an eine Bleiche der Fluorophore zu verhindern, und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Lösung mit dem sekundären Antikörper und waschen Sie die Herzen dreimal für jeweils 10 Minuten mit 100 Mikroliter P-B-S-T-X bei Raumtemperatur.Entfernen Sie abschließend das TRITTON X 100, indem Sie die Herzen zehn Minuten lang mit 100 Mikrolitern PBS spülen. Die Proben können vor der Einbettung mehrere Tage lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius gelagert werden. Bereiten Sie zunächst den Objektträger für die Einbettung vor.Tragen Sie drei gleichmäßig verteilte Tropfen von je 10 Mikroliter Vektor-Schild-Montagemedium auf einen Mikroskopträger auf. Legen Sie zwei 18 mal 18 Millimeter große Deckgläser auf die äußeren Tropfen, wobei die Deckgläser etwa 10 bis 15 Millimeter voneinander entfernt bleiben sollen.Platzieren Sie außerdem 20 Mikroliter Vektor-Schild in der Mitte einer dritten Deckglas. Halten Sie danach die dissezierte adulte Fliege an den äußersten Rändern des Cuticula. Um sie vorsichtig aus der PVS-Waschlösung zu entnehmen, legen Sie sie sanft mit der Herzseite nach unten auf den Tropfen Einbettmedium auf dem dritten Deckglas, wobei nicht mehr als fünf Herzen pro Tropfen auf dem Deckglas platziert werden sollten.Nachdem die Herzen auf den Tropfen gelegt wurden, der sich auf dem Deckglas befindet, unter dem Mikroskop überprüfen, ob alle Herzen nach unten weisen. Nun das Deckglas mit den Herzen vorsichtig umdrehen und es schnell auf den Objektträger mit dem Paar Deckgläsern legen, sodass der Tropfen des umgedrehten Deckglases, der die Herztuben enthält, mit dem Vektor-Schild-Tropfen verschmilzt, der im Zwischenraum zwischen den Deckgläsern ruht. Auf diese Weise gepaart, bilden die drei Deckgläser eine Brücke.Die Herzen werden zwischen dem mittleren Deckglas und dem Mikroskop befestigt. Die Probe unter dem Brückenhalter unter dem Mikroskop überprüfen, um sicherzustellen, dass die Herzen der adulten Fliegen nun mit Hilfe von Nagellack nach oben weisen. Die Deckgläser an ihren Rändern fixieren.Die Herzen sind nun bereit, mittels Fluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie abgebildet zu werden. Um larvale Herzen zu montieren, geben Sie mit feinen Pinzetten einen Tropfen von etwa 20 Mikrolitern BTA-Schild auf einen Objektträger. Greifen Sie die Larve an den Rändern der Cuticula und übertragen Sie sie vorsichtig in den Tropfen.Orientieren Sie die Larven mit der dorsalen Seite nach unten unter Verwendung von Wolframenadeln. Platzieren Sie bis zu zwei Larven auf einem Objektträger. Ziehen Sie danach jedes Präparat aus dem Montagemedium und richten Sie die Larven parallel zueinander aus.Platzieren Sie mit einer Pinzette einen Deckel auf jeder Seite der ausgerichteten Herzen. Platzieren Sie einen dritten Deckel zuerst, indem Sie eine Seite auf den vorderen Deckel legen und ihn dann zum hinteren Deckel absenken. So entsteht eine Brücke.Kapillarkräfte führen zu einem Fluss des Vektorschutzmittels von hinten nach vorne, was die korrekte Ausrichtung des Herzens der Larve unterstützt. Schließlich fixieren Sie alle Deckgläser an ihren Rändern mit Nagellack und füllen den Raum zwischen den Deckgläsern vorsichtig mit 20 bis 30 Mikrolitern Vektorschutzmittel abgedichtet mit Nagellack. Lagern Sie die Präparate bei vier Grad Celsius für die kurzfristige Aufbewahrung oder bei minus 20 Grad Celsius für einen längeren Zeitraum. Wenn das Verfahren korrekt durchgeführt wird, sollten alle Bestandteile und assoziierten Gewebe des dorsalen Gefäßes intakt bleiben und leicht sichtbar sein.Die Hintergrundfluoreszenz sollte bei erwachsenen Exemplaren minimal sein. Die ventrale Längsmuskelschicht färbt sich sehr gut und erzeugt ein deutliches Signal. Die darunterliegenden zirkulären Kardiomyozyten neigen jedoch dazu, kein so intensives Signal zu erzeugen wie die überlagernde ventrale Schicht.Die Myozyten der vorderen konischen Kammer des erwachsenen Herzens enthalten eine beträchtliche Menge kontraktilen Materials, weshalb sich dieser Bereich im Vergleich zum übrigen Herztubus als der robusteste erweist. Das Bild des larvalen Herzens zeigt eine spiralförmige Anordnung der Myofibrillen. Ähnlich wie bei den kontraktilen Kardiomyozyten des Erwachsenen haben wir soeben Ihr Protokoll zur Vorbereitung und Färbung ovularer Herzen für die Fluoreszenz- und konfokale Mikroskopie vorgestellt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, unnötiges Handhaben zu vermeiden. Dies gewährleistet eine bessere Erhaltung der intakten Herzstruktur. Dieses Protokoll dient lediglich als Ausgangspunkt.Wie bei jeder anderen Immunhistochemie erfordern verschiedene Antikörper unterschiedliche Bedingungen und müssen individuell optimiert werden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrer Färbung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Wir beschreiben ein Verfahren zur Fixierung, Einbettung, Schneiden und Bildgebung von...

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Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, um Farbstoffe zu injizieren, DNA-Vektoren, Viren und Zellen, um sowohl das Zellschicksal und Phänotyp von endogenen und transplantierten Zellen aus embryonalen oder pluripotenten Zellen in Maus-Embryonen (E) 9,5 und späteren Stufen abgeleitet an embryonalen Tag überwachen der Entwicklung.

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Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

Im frühen Drosophila-Embryo sind viele Organellen beweglich. Im Prinzip können sie über spezifische fluoreszierende Sonden lebend abgebildet werden, aber die Eierschale verhindert eine direkte Anwendung auf den Embryo. Dieses Protokoll beschreibt, wie solche Sonden durch Mikroinjektion eingeführt und dann die Bewegung der Massenorganelle über die Teilchenbild-Velocimetrie analysiert werden.

Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von Drosophila melanogaster , die eNpHR2.0 oder ReaChR-Opsine im Herzen exprimieren, für die OCT-Bildgebung und die optogenetische Herzschrittbildung. Detaillierte Anweisungen für die Drosophila OCT-Bildgebung und Herzschlagmodulation, einschließlich der Simulation von wiederherstellbarem Herzstillstand, Bradykardie und Tachykardie bei lebenden Tieren in verschiedenen Entwicklungsstadien, werden berichtet.

Entwicklung von Drosophila melanogaster Modellen für die Bildgebung und optogenetische Kontrolle der Herzfunktion

Dieses Protokoll beschreibt die maßgeschneiderte antikörperbasierte Fluoreszenzmarkierung und Injektion in frühe Drosophila-Embryonen , um Live-Imaging von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder posttranslationalen Modifikationen zu ermöglichen, die mit herkömmlichen GFP/mCherry-Tag-Ansätzen nur schwer zu erkennen sind.

Visualisierung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und posttranslationalen Modifikationen in lebenden Drosophila-Embryonen mittels Fluoreszenz-Antikörper-Injektion

Das Drosophila-Protokoll für Herzschnitte und Fluoreszenzbildgebung vereinfacht die Untersuchung von Herzstrukturen und -pathologien. Dieser Ansatz beinhaltet einfaches Schneiden, Färben und Imaging, wobei das technische Know-how, das für die herkömmliche Dissektion erforderlich ist, umgangen wird. Es verbessert die Zugänglichkeit und macht Drosophila zu einem breiter nutzbaren Modell für die kardiale Forschung in der breiteren wissenschaftlichen Gemeinschaft.

Neuartige und effiziente Methode zur Fluoreszenzfärbung von Drosophila-Herzen mit Kryosektion

Lernen Sie die Fluoreszenzmarkierung von Herzstrukturen in Drosophila melanogaster für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende konfokale Mikroskopie und morphologische Analyse.

Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures

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