Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures

Hallo, ich bin Nikita Ari vom Labor von Ralph Boer im Programm für Entwicklung und Altern am Burnham Institute for Medical Research. Ich bin Gil ler auch aus dem Bottom Lab. Heute zeigen wir Ihnen Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Laval und präsolaren Herzstrukturen bei Erwachsenen.

Dieses Verfahren nutzen wir im Labor, um die Herzschläuche für die morphologische und strukturelle Analyse mittels Konfokal- oder Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten, um Herzstrukturen bei adulten Drosophila fluoreszierend zu markieren. Machen Sie zunächst bei einem halb intakten Erwachsenen einen einzigen Schnitt zwischen Brustkorb und Bauch, um Körpersegmente zu trennen. Schneiden Sie dann die überhängenden ventralen Ränder der erwachsenen Nagelhaut ab.

Als nächstes werden adulte oder präparierte Larvenproben mit primären und sekundären Antikörpern übertragen und markiert. Nach dem Etikettieren der Halterung für gewaschene adulte Exemplare, indem Sie die Hautränder festhalten und mit der Herzseite nach unten auf einen Tropfen Vektorschild auf einem Deckglas legen, drehen Sie das Deckglas auf einen Tropfen Medium um, flankiert von zwei Deckgläsern auf einem Objektträger, um eine Brücke zu bilden. Mit den Herzen, die nun aufrecht aufgehängt sind, um Larvenherzen zu montieren.

Übertragen Sie die Proben mit den Bauchseiten nach unten auf einen Objektträger und montieren Sie zwei Deckgläser auf jeder Seite des Objektträgers. Zum Schluss bilde eine Brücke mit einem dritten Deckglas, indem du es zuerst auf das Deckglas in der Nähe der hinteren Enden der Larven legst. Die Herzen sind nun bereit für die Bildgebung.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie den folgenden A DH-Entspannungspuffer vor, der A DH enthält, wie in einem anderen Videoprotokoll in dieser Serie beschrieben, mit 10 μmolar EGTA-Fixativ bestehend aus 4 % Formaldehyd in einem X-P-B-S-P-B-S, TX und entsprechend verdünnten Primärantikörpern und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern. In PBS TX präparieren adulte und Larven-Drosophila, um die Herzschläuche freizulegen, nach der halbintakten Drosophila-Herzvorbereitung, die in den Videoprotokollen gezeigt wird, die das schlagende Herz im NMJ-Dissektionsprotokoll von Drosophila- und Drosophila-Larven visualisieren. Verwenden Sie jedoch bei Modifikationen während der Larvendissektion ein sauerstoffreiches DH und verschieben Sie die hinteren Stifte leicht von der ventralen Mittellinienlarve.

Entlang der ventralen Mittellinie schneiden. Entfernen Sie vor der Fixierung in den folgenden Schritten kein Gewebe. Beginnen Sie den Markierungsvorgang, indem Sie unter einem Mikroskop überprüfen, ob sich alle Herzen rhythmisch zusammenziehen und in sauerstoffreichem A DH entspannen. Ersetzen Sie dann schnell ein DH durch einen entspannenden Puffer und untersuchen Sie jeden Herzschlauch erneut, um sicherzustellen, dass die Kontraktionen gehemmt werden.

Fahren Sie mit der Fixierung der Herzen fort, indem Sie den entspannenden Puffer durch ein Fixiermittel ersetzen. 20 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. Beachten Sie, dass bei Larvenpräparaten kein Schütteln erforderlich ist und sogar die Integrität des Herzgewebes beeinträchtigen kann.

Nach Ablauf von 20 Minuten entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Proben dreimal für jeweils 10 Minuten mit P-B-S-T-X. Bei Raumtemperatur mit ständigem Schütteln für Erwachsene einen einzigen Schnitt zwischen Bauch und Brustkorb vorsichtig und sauber machen. Trennen Sie beide Körpersegmente, um eine minimale Schädigung des vorderen Bereichs des Herzens zu gewährleisten.

Achten Sie darauf, nicht in den vorderen Bauchbereich zu schneiden, wo sich die konische Kammer des Herzens befindet. Untersuchen Sie die Probe unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass ein sauberer Schnitt gemacht wurde. Schneiden Sie anschließend alle überhängenden ventralen Ränder der Bauchkutikula vorsichtig zurück, so dass das, was übrig bleibt, elliptischer und weniger rund ist.

Bei Larvenherzen mit einer feinen Pinzette den Fettkörper vorsichtig entfernen. Führen Sie dies mit äußerster Vorsicht aus. Da das Herz der Larve besonders zerbrechlich ist und nur sehr wenig Unterstützung durch andere Muskeln oder Bindegewebe hat, sollten Sie die Trachealäste nicht entfernen, da dies das Herz schädigen kann.

Als nächstes inkubieren Sie mit dem primären Antikörper, der in PVS TX verdünnt und in einer Menge von 50 Mikrolitern pro Vertiefung einer 96-Well-Platte abgegeben wird. Bei erwachsenen Fliegen halten Sie die abgeschnittene dorsale Kutikula an den Rändern, ohne den mittig gelegenen Herzschlauch zu berühren, und übertragen Sie sie auf die Platte. Setzen Sie nicht mehr als 12 Proben pro Vertiefung ein und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren.

Die Larvenproben mit einer Pinzette am Rand festhalten und in P-B-S-T-X gefüllt überführen. Auch hier gilt: Schütteln Sie die Larvenexemplare am Ende der Inkubation nicht. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung.

Waschen Sie die Herzen dreimal für jeweils 10 Minuten mit 100 Mikrolitern P-B-S-T-X bei Raumtemperatur, nach dem letzten Waschen bei 100 Mikrolitern des Sekundärantikörpers in PBS tx, ergänzt mit Alexa 5, 9, 4 Phin. Halten Sie die Proben abgedeckt, um ein Ausbleichen von Fluorvier von nun an zu verhindern, und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie die Herzen dreimal für jeweils 10 Minuten mit 100 Mikrolitern P-B-S-T-X bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie zum Schluss den TRITTON X 100, indem Sie die Herzen 10 Minuten lang in 100 Mikrolitern PBS spülen. Die Proben können vor der Montage mehrere Tage im Dunkeln bei vier Grad Celsius gelagert werden. Bereiten Sie zunächst die Rutsche für die Montage vor.

Tragen Sie drei gleichmäßig verteilte 10 Mikroliter Vector Shield Eindeckmedium auf ein Mikroskop auf. Schieben Sie zwei 18 x 18 Millimeter große Deckgläser auf die äußeren Tropfen, wobei die Deckgläser etwa 10 bis 15 Millimeter voneinander entfernt sind.

Platzieren Sie zusätzlich 20 Mikroliter Vektorschild in der Mitte eines dritten Deckglases. Halten Sie als Nächstes die präparierte adulte Fliege an den äußersten Rändern der Nagelhaut. Um es vorsichtig aus der PVS-Waschlösung zu entfernen, legen Sie es vorsichtig mit der Herzseite nach unten auf den Tropfen Eindeckmedium auf dem dritten Deckglas, nicht mehr als fünf Herzen pro Tropfen auf dem Deckglas.

Nachdem Sie die Herzen auf den Tropfen gelegt haben, der sich auf dem Deckglas befindet, überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob alle Herzen nach unten zeigen. Drehen Sie nun das Deckglas vorsichtig mit den Herzen um und legen Sie es schnell auf den Objektträger, der das Paar Deckgläser hält, so dass das Tröpfchen des umgedrehten Deckglases, das die Herzschläuche enthält, mit dem Vektorschildtröpfchen verschmilzt, das im Raum zwischen den Deckgläsern ruht. Auf diese Weise gekoppelt, bilden die drei Deckgläser eine Brücke.

Die Herzen werden zwischen dem mittleren Deckglas und dem Mikroskop aufgehängt. Schieben Sie unter der Brücke hindurch und prüfen Sie mit Nagellack unter dem Mikroskop, ob die erwachsenen Fliegenherzen nun nach oben zeigen. Befestigen Sie die Deckgläser an ihren Rändern.

Die Herzen sind nun bereit, um mittels Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskopie abgebildet zu werden. Um Larvenherzen zu montieren, geben Sie einen Tropfen von etwa 20 Mikrolitern BTA-Schild mit einer feinen Pinzette auf einen Objektträger. Fassen Sie die Larven an den Rändern der Nagelhaut und geben Sie sie vorsichtig in den Tropfen.

Richten Sie die Larven mit der Rückenseite nach unten mit Wolframnadeln aus. Platzieren Sie bis zu zwei Larven auf einem Objektträger. Ziehen Sie dann jedes Exemplar aus dem Einbettmedium und richten Sie die Larven parallel aus.

Lege mit einer Pinzette auf jede Seite der ausgerichteten Herzen ein Deckblatt. Legen Sie zuerst einen dritten Abdeckschub darauf, indem Sie eine Seite auf den vorderen Abdeckschub legen und ihn auf den hinteren Abdeckschirm absenken. So bildet sich eine Brücke.

Kapillarkräfte bewirken einen Fluss des Vektorschilds von hinten nach vorne, was die richtige Ausrichtung des Larvenherzens unterstützt. Zum Schluss fixieren Sie alle Deckgläser an ihren Rändern mit Nagellack und füllen den Zwischenraum zwischen den Deckgläsern vorsichtig mit 20 bis 30 Mikrolitern vector shield seal mit Nagellack und lagern Sie sie für die kurzfristige Lagerung bei vier Grad Celsius oder für einen längeren Zeitraum bei minus 20 Grad Celsius. Bei korrekter Ausführung sollten alle Komponenten und das zugehörige Gewebe des dorsalen Gefäßes intakt bleiben und leicht sichtbar gemacht werden können.

Die Hintergrundfluoreszenz sollte für Erwachsene minimal sein. Die ventrale Längsmuskelschicht färbt sich sehr gut ab und erzeugt ein substanzielles Signal. Die darunter liegenden zirkulären Kardiomyozyten neigen jedoch dazu, kein so intensives Signal zu erzeugen wie das, das von der darüber liegenden ventralen Schicht kommt.

Die Myozyten der vorderen konischen Kammer des erwachsenen Herzens enthalten eine beträchtliche Menge an kontraktilem Material, und daher erscheint diese Region im Verhältnis zum Rest des Herzschlauchs als die robusteste. Das Bild des Larvenherzens zeigt eine spiralförmige myofibrilläre Anordnung. Ähnlich wie bei den kontraktilen Kardiomyozyten bei Erwachsenen haben wir gerade Ihr Protokoll zur Vorbereitung und Färbung von Eizellenherzen für die Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie gezeigt.

Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, unnötige Handhabung zu begrenzen. Dies sorgt für eine besser intakte und erhaltene Herzstruktur. Dieses Protokoll dient nur als Ausgangspunkt.

Wie bei jeder anderen Immunhistochemie auch, benötigen unterschiedliche Antikörper unterschiedliche Bedingungen und müssen individuell optimiert werden. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihrer Färbung.