ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Elektrochemische) Verfahren zur Mykotoxin-Erkennung

Hallo, mein Name ist Francesco Lichi. Ich bin Postdoktorand am Bioanalytischen Labor von Professor Palki an der Universität Rom Tova Gata. Heute werde ich gemeinsam mit meinen Kollegen die Herstellung einer elektrochemischen CY zur Detektion von TCO-Mykotoxin in Lebensmittelproben vorführen.

Unter den verschiedenen Methoden, die in der Immunzellenanalyse verwendet werden, ist die enzymgebundene Immunzellenanalyse eine der beliebtesten. Dabei wird entweder das Antikörper oder das Antigen mit einem Enzym markiert. Kürzlich hat sich der Einsatz elektrochemischer Methoden zur Nachweisung des Enzyms als besonders vorteilhaft für bestimmte Anwendungen erwiesen.

Die Elektrochemie ist tatsächlich weniger anfällig für Störungen, eignet sich für die Miniaturisierung und für die Massenfertigung zu geringen Kosten. Vor diesem Hintergrund ist die Verwendung von Siebdruck-Elektroden von großer Bedeutung, um niedrige Kosten und Einfachheit des Verfahrens sicherzustellen. Darüber hinaus könnte die Verwendung magnetischer Trägermaterialien mit Siebdruck-Elektroden kombiniert werden, um die höchstmögliche Empfindlichkeit der Methode zu erzielen.

Heute zeigen wir Ihnen, wie man eine elektrochemische Mase unter Verwendung von Siebdruckelektroden und magnetischen Partikeln zur Detektion des Mykotoxins TCOs in Lebensmittelproben herstellt. Trics-Mykotoxine kommen häufig in Getreide vor und stellen daher eine ernste Bedrohung für die Sicherheit getreidebasierter Lebens- und Futtermittel dar. Die wichtigsten Turtin-Vertreter der Gruppe A sind die T-2- und HT-2-Toxine.

Wie wir sehen werden, kann diese Methode von nicht geschultem Personal leicht durchgeführt werden und erfordert kostengünstige sowie portable Instrumente. Dies ist eines der Hauptziele des integrierten Projekts bio, das von der Europäischen Gemeinschaft finanziert wurde und im Rahmen dessen diese Arbeit durchgeführt wurde. Nun schauen wir uns an, was das Prinzip der Methode und die verwendeten Materialien sind?

Beginnen wir also. Magnetische Kügelchen werden als Träger für die immunologische Kettenreaktion verwendet. Ein Streifen mit acht Siebdruckelektroden dient als Sensorelement.

Jeder Sensor besteht aus einer Graphit-Arbeitselektrode, einer Gegenelektrode und einer Silber-Referenzelektrode. Diese Sensoren können nacheinander und einzeln innerhalb sehr kurzer Zeit mittels eines tragbaren elektrochemischen Instruments, das nach dem Prinzip von palm Sense arbeitet, betrieben werden. Das Prinzip der Methode ist einfach und beruht auf einer kompetitiven immunologischen Reaktion.

Toxin und Antikörper binden an die magnetischen Kügelchen, die anschließend blockiert werden, um unspezifische Bindungen zu verhindern. Die Messung beginnt mit dem Kompetitionschritt. In dieser Phase reagieren die beschichteten Kügelchen mit einer festgelegten Menge monoklonalen Antikörpers; das im Probenmaterial enthaltene Toxin und das an den magnetischen Kügelchen immobilisierte Toxin konkurrieren dabei um die Bindungsstellen am Antikörper.

Die Menge an Antikörper, die an die codierten Kügelchen gebunden ist, steht umgekehrt proportional zur Menge des Toxins in einer Probe. Dem Konkurrenzschritt folgt anschließend der Markierungsschritt. In diesem Fall werden die magnetischen Kügelchen mit einem sekundären Antikörper, der mit einem Markierungsenzym konjugiert ist, zur Reaktion gebracht.

Der sekundäre Antikörper bindet den monoklonalen Antikörper und gewährleistet eine effiziente Markierung. Auf die Markierungsstufe folgt abschließend die Messstufe. In diesem Fall werden die magnetischen Partikel mithilfe der magnetischen Plattform gezielt auf der Elektrodenoberfläche angereichert, anschließend geben wir einfach das Enzymsubstrat 1-Naphthylphosphat hinzu und messen die Bildung von 1-Naphthol.

Die erzeugte Bindungskurve zeigt hohe Stromwerte bei niedrigen Toxin-Konzentrationen und niedrige Signale bei hohem Toxin-Gehalt. Die Toxin-Konzentration wird unter Verwendung einer Kalibrierkurve ermittelt, die in standardisierten gepufferten Lösungen erstellt wurde. Für den eigentlichen Assay bereiten wir einen Halter mit sauberen 2-mil-Fendor-Röhrchen vor, jeweils ein separates Röhrchen für jede Standardlösung der Kalibrierkurve sowie für die Proben.

Dann werden 10 Mikroliter der Bead-Suspension in jedes Röhrchen pipettiert. Diese Lösung enthält magnetische Beads, die zuvor mit dem Konjugattoxin beschichtet wurden. Vor Durchführung des Assays muss jedoch die Lagerflüssigkeit entfernt werden, da Natriumazid, das als Konservierungsmittel verwendet wird, die enzymatische Aktivität des Labels beeinträchtigen würde.

Dazu wird P-B-S-B-S-A-Puffer hinzugegeben. Die Röhrchen werden geschüttelt, dann wird der Magnet erneut eingesetzt und der Waschpuffer abpipettiert. Der erste eigentliche Durchgang des Assays wird als Blockierungsschritt bezeichnet.

Während dieses Schritts wird ein Milliliter Blockierungslösung zu jedem der Röhrchen hinzugegeben. Anschließend werden sie auf den rotierenden Probengefäßmischer gegeben und für eine halbe Stunde bei Temperatur inkubiert. Danach wird die Blockierungslösung entfernt, um den nächsten entscheidenden Schritt, den Kompetitionsschritt, durchzuführen. Wir geben monoklonale spezifische Antikörper- und Toxinlösungen zu jedem Röhrchen hinzu.

Dazu werden 200 Mikroliter monoklonaler Antikörper in der optimierten Konzentration injiziert. Anschließend werden 200 Mikroliter jeder Standardlösung oder Probe zu jedem Reagenzglas hinzugefügt. Die Reagenzien werden 30 Minuten lang inkubiert.

Um den Kontakt zwischen den auf der Oberfläche der magnetischen Partikel immobilisierten Reagenzien und den Molekülen in Lösung zu optimieren, um diesen Prozess einzuleiten, werden die Röhrchen zurück auf den rotierenden Probemischer gegeben, um den Markierungsschritt durchzuführen. Es ist notwendig, die Lösung aus dem vorherigen Schritt zu entfernen. Anschließend werden 400 µL markierter sekundärer Antikörper zu jedem Röhrchen hinzugefügt, und diese werden erneut auf den rotierenden Probemischer zurückgegeben und 30 Minuten lang inkubiert.

Danach führten wir nach Entfernung der Markierungsflüssigkeit Waschverfahren mit verschiedenen Puffern durch, um Störungen durch nicht gebundene enzymatische Reagenzien auszuschließen. Schließlich werden die magnetischen Partikel zur Vorbereitung der eigentlichen Messungen in 100 Mikrolitern DEA-Puffer resuspendiert, einem Puffer, der die enzymatische Aktivität der Markierung optimiert. Die Messung wird mit diesem potentiostatischen Palmensender durchgeführt, der wie hier gezeigt mit einem Acht-Elektroden-Streifen darunter verbunden ist.

Es gibt eine spezielle Halterung, auf der unterhalb der Oberfläche jeder Arbeitselektrode genau acht starke Magnete befestigt sind. Der Magnet dient dazu, die Kügelchen auf der Oberfläche der Arbeitselektrode zu konzentrieren. Wir pipettieren aus jedem EOR eine 20-Mikroliter-Aliquotprobe der reaktiven magnetischen Kügelchendispersion und geben sie auf die entsprechende Arbeitselektrodenoberfläche.

Um die eigentliche Messung durchzuführen, muss enzymatisches Substrat zugegeben werden, doch auch die Abfolge der Schritte muss sorgfältig kontrolliert werden. Wir geben ad Mikroliter enzymatische Substratlösung auf die erste Elektrodenoberfläche. Anschließend starten wir eine zweiminütige Abwärtszählung.

Nach 14 Sekunden geben wir die Substratlösung auf die zweite Elektrode. Nach weiteren 14 Sekunden fügen wir die Substratlösung der dritten Elektrode hinzu. Wir fahren mit dem gleichen Zeitintervall bis zur letzten Elektrode fort.

Tatsächlich wird das Intervall von 14 Sekunden als die Zeit berechnet, die der potentiometrische Sensor für die Durchführung der Messung benötigt. Gut, nach dem zweiminütigen Countdown ab dem ersten Ansatz der enzymatischen Substratlösung wird das elektrochemische Messprotokoll gestartet. Die eigentliche Messung des gebildeten Produkts erfolgt mittels differentieller Post-Telemetrie.

Die Kurven für die aufeinanderfolgenden Elektroden erscheinen nacheinander auf dem Bildschirm, da es sich um einen Wettbewerbsassay handelt. Die Stromintensität des erhaltenen Signals wird umgekehrt proportional zur Konzentration des Toxins sein, das im Rohr im Wettbewerbschritt vorhanden war. Das Stromsignal von Standardlösungen wird als sigmoide Kurve dargestellt, und der Toxingehalt unbekannter Proben wird durch Extrapolation des Konzentrationswerts aus dem aufgezeichneten Signal ermittelt.

Nun, ich hoffe, diese Demonstration war verständlich und hilfreich, um die Vorteile elektrochemischer Immunosensoren zu verstehen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.