Name: Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-27T17:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Lernen Sie die Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Glykanen in Säugerzellen mit metabolischer Markierung und HPLC. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Dynamik von Glykoproteinbiosynthese im Zeitverlauf.

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Wir danken Zehavit Frenkel und Sandra Tolchinsky für technische Unterstützung. Forschung im Zusammenhang mit dieser Arbeit wird durch Zuschüsse von der Israel Science Foundation (1229-1207) und Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP-DFG) unterstützt.

Das folgende Protokoll ist für die Analyse der Zuckerketten von insgesamt Glykoproteine ​​oder eines bestimmten Glykoproteins von Interesse bestimmt. Das Verfahren ist grundsätzlich das gleiche für die beiden Fälle mit ein paar Änderungen, wie in dem Protokoll angegeben. <ol><li> Für metabolische Markierung von N-verknüpften Glykane, muss man eine subkonfluenten Kultur von Säugerzellen über Nacht in einer 90 mm-Schale für jede Probe gewachsen verwenden (Proben repräsentieren verschiedene Zeitpunkte oder Behandlungen). Dieses Protokoll wird für NIH 3T3-Zellen optimiert. </li><li> Hungern der Zellen für Glukose durch Inkubation in 5 ml frisch zubereiteter vorgewärmten (37 ° C) Glucose-freiem Medium mit 10% dialysiert FCS und 4 mM Natriumpyruvat für 5-15 Minuten geliefert. </li><li> Ersetzen Sie den Hungertod Medium mit 1 ml vorgewärmten (37 ° C) Glucose-freiem Medium mit 400 uCi [2 bis 3 H]-markierte Mannose (niedrigere Konzentration von 65 Ci / ml ist für die Kennzeichnung von insgesamt Glykoproteine ​​verwendet werden), und inkubieren Sie die Zellen in den normalen Gewebekulturen Bedingungen für 1 Stunde. </li><li> Entfernen Sie die Markierung Medium von jeder Probe, und vorsichtig 2 ml PBS bei 4 ° C, um die Proben entsprechend Puls und legen sie auf Eis (dieser Proben werden als Impulse bezeichnet), während die Proben entsprechend der Jagd zu sein brauchen gespült 3 mal mit 2 ml vorgewärmten (37 ° C) normal komplettem Kulturmedium, und dann in einer CO 2-Inkubator bei 37 ° C mit 5 ml vorgewärmten regelmäßigen Medium für die gewünschte Chase Perioden. </li><li> Spülen Sie den Puls Proben (vorher auf Eis gelegt) 3 mal mit 2 ml eiskaltem PBS. Die Zellen werden dann von der Schüssel in 2 ml PBS mit einem Zellschaber abgekratzt, und in ein 2 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Short-spin die Zellen bei 16000Xg (6-10 sec), den Überstand verwerfen und frieren das Zellpellet bei -80 ° C. </li><li> Führen Sie die Schritte 5 und 6 auch für die Jagd Proben am Ende der Verfolgungsjagd Zeit. </li><li> Entfernen Sie die Zellen aus dem Gefrierschrank und lysieren sie durch Zugabe von 300 ul Puffer A, Vortexen kurz und Inkubation für 20 min auf Eis oder im Falle von insgesamt Glykoproteine ​​Analyse durch Inkubation 20 min auf Eis mit Puffer B, mit anschließender Ultraschallbehandlung (4-mal, 10 sec, maximale Amplitude), dann kochen die Proben für 5min. </li><li> Zentrifugieren Sie die Lysate bei 16000Xg für 20 min bei 4 ° C. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Eppendorf Tube und entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Wenn die Analyse insgesamt Glykoproteine, die molekulare Filtration und Deglykosylierung (Schritt 17) fort. Für Immunpräzipitation der H2a Glykoprotein hier demonstriert, fügen 20l/sample von (Repligen) Protein A-Agarose-Beads 1:1 Aufhängung und 3 pl / Probe unserer polyklonalen Kaninchen-anti H2a Antikörper für die gewünschte Glycoprotein (in unserem Beispiel anti-H2a Antikörper ), der Überstand aus Schritt 9 fort. </li><li> Inkubieren Sie die Proben für 4-16 Stunden bei 4 ° C, dauernd Mischen durch langsame Rotation. </li><li> Spin down die Perlen an 16000Xg für 30 Sekunden, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand mittels Vakuum. </li><li> Spülen Sie die Perlen, durch Zugabe von 500 ul Puffer D und Vortexen. Spin wie in Schritt 12 und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die 3 x waschen. </li><li> Add 10 &amp;mgr; l Denaturierungspuffer (im Lieferumfang der NEB endo-H-Kit), um den Wulst Pellet und kochen die Proben für 5 min (bei insgesamt Proteine ​​analysiert werden, die Deglykosylierung befindet sich auf der Microcon Filter, Schritt 17 durchgeführt). </li><li> Spin down die Perlen (16000Xg für 30 Sekunden) und den Überstand in ein neues Eppendorf-Röhrchen. Dann 0.5μl von Endo H-Enzym sind zu jeder Probe zusammen mit 10 ul des Reaktionspuffer (auch mit der NEB Endo H-Kit im Lieferumfang enthalten) hinzugefügt und die Proben werden bei 37 ° C für 3 Stunden. </li><li> Zur Trennung der freigesetzten Glykane von den Proteinen, wird die Probe 5 mal mit deionisiertem Wasser verdünnt und auf der Spitze eines molekularen Filter (Microcon Ultracel YM30), mit einem 30-kDa cut-off, dann 14000Xg für 3 min zentrifugiert. Übernehmen 50 ul entionisiertem Wasser und wiederholen Zentrifugation der Proben. Das Auswaschen wird 2 weitere Male wiederholt, halten die Durchströmung. </li><li> Wenn Sie die Analyse insgesamt Glykoproteine ​​sind, gelten dem Überstand der Lysate (aus Schritt 9), die Microcon Filter. Der Extrakt wird mit 100 ul Puffer E, 3-mal durch wiederholte Zentrifugation bei 14000Xg für 3 min. Add 3 ul 10x Endo H Reaktionspuffer und 1,5 ul des Endo H-Enzym, die Microcon Retentat, und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C. Die freigesetzten Glykane sind mit entionisiertem Wasser durch 3 wiederholt Zentrifugationen eluiert, wie in Schritt 16. </li><li> Falls gewünscht, werden Retentate aus den Schritten 16 und 17, mit Endo H-resistente Glykoproteine ​​dann mit 200mU von N-Glycosidase F in 15 ul Puffer C inkubiert, bei 37 ° C für 16 h Elution mit deionisiertem Wasser wird wie in Schritt 16 durchgeführt. </li><li> Das Röhrchen mit dem Endo H Reaktion Flow-Through-(Stufen 16 und 17) in einem SpeedVac KonzentratorUnd trocknen die Proben vollständig (dies kann bis zu 45 erfolgen ° C, um diesen Prozess zu beschleunigen). </li><li> Zur Vorbereitung der Proben für die HPLC, resuspendieren die trockenen Pellets in 12 ul der HPLC Lösungsmittel (Acetonitril: Wasser, 60:40, 1% Phosphorsäure). </li><li> Passen Sie die HPLC-Gerät (verbunden mit dem Spherisorb Spalte) zu konstanten Fluss des Lösungsmittels (1 ml / min) und Druck (ein bestimmter Wert zwischen 1000 und 2000 psi), und setzen Sie ein Fraktionssammler Änderungen ein Rohr alle 1 Minute. </li><li> Laden Sie die Proben in die HPLC-Gerät und starten Sie den Fraktionssammler gleichzeitig. </li><li> Sammeln Sie 48 Fraktionen von 1 ml von jeder Probe laufen und ab einer Auflage von einer Standard-Oligosaccharid-Gemisch. </li><li> Transfer 500 ul von jeder Fraktion ein Scintillationsfläschchen, und mischen Sie den Inhalt mit 3 ml Wasser mischbar Szintillationsflüssigkeit. </li><li> Laden Sie das Fläschchen und lesen in einem Szintillationszähler. </li><li> Die cpm-Anzeige wird als Funktion der Fraktion Zahl aufgetragen. </li><li> Die cpm-Werte innerhalb einer Spitzenleistung stellen eine besondere Glycanspezies wie folgt: Fraktionen 18-21 bis M5, Fraktionen 22-26 bis M6, Fraktionen 27-31 bis M7, Fraktionen 32-35 entsprechen M8, Fraktionen 36-39 bis M9, Fraktionen 40-42 zu G1M9 und Fraktionen 43-45 zu G2M9. </li><li> Die Summe der cpm-Werte für die Fraktionen innerhalb der einzelnen Gipfel spiegelt die absolute Menge eines bestimmten Glycanspezies. Die absolute Höhe der einzelnen Glycanspezies wird durch die Anzahl der Mannoseresten, die es enthält unterteilt: Um sich für die Tatsache, dass Spezies mit mehr Mannoseresten mehr label, die "relative molare Menge" von jedem Glycanspezies berechnet sich wie folgt erwerben zu kompensieren . Dieser Wert wird dann durch die Summe der relativen molaren Mengen aller Glycanspezies erhalten, um die "Prozent aller" für jede spezifische Glycanspezies dividiert. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td style="text-align:center;"> Chase (h) </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td> Freigegeben mit Endo H (cpm) eine </td><td> 90000 </td><td> 16800 </td></tr><tr><td> Freigegeben mit N-Glycosidase F (cpm) b </td><td> 20400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td> Glykoproteine ​​in Retentat (cpm) c </td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td> Dolichol-Oligosaccharide in Retentat (cpm) d </td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td> Dolichol-Oligosaccharide in Retentat (%) e </td><td> 1,4 ± 0,7 </td><td> 0,2 ± 0,2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Analyse der Freisetzung von N-verknüpften Zuckerketten mit deglycosidases und der Anwesenheit von Dolichol-Oligosaccharide in Glykoprotein Proben. Wir wendeten die Pulse-Chase-Verfahren, um ein Lysat von NIH 3T3-Zellen. Nach Microcon Filtration, wurden als N-gebundene Oligosaccharide in erster Linie mit Endo H nach Puls Kennzeichnung (high Mannose-Typ) und bei weiterer Behandlung mit N-Glycosidase F nach einer Verfolgungsjagd aus, was zu komplexen Typs (Golgi-verarbeitet Glykane) entsprechen würde entlassen, Endo H resistent Oligosaccharide. Diese quantitative Analyse festgestellt, dass Dolichol-Oligosaccharide, entfielen einen unbedeutenden Bruchteil des Etiketts in der ersten Retentat. Notes: <ol class="lalpha"><li> NIH 3T3-Zellen wurden Puls mit [2 bis 3 H] Mannose und jagte mit Komplett-Medium. Nach Zelllyse und Filtration durch Microcon YM30 wurden hohe Mannose N-gebundene Oligosaccharide aus Retentate durch Inkubation mit Endo H. veröffentlicht </li><li> Endo H-resistentem Material in Microcon Retentate aus (a) wurde dann mit N-Glycosidase F inkubiert und freigegeben Oligosaccharide in einem Szintillationszähler gemessen. </li><li> : Methanol: Wasser 10.10.03 um Vorläufer Glykolipide entfernen, und die extrahierten Material in 1N NaOH gelöst und in einem Szintillationszähler Microcon Retentate wie in (a) vor dem Endo H-Behandlung wurden 4 mal mit Chloroform extrahiert wird. </li><li> Dolichol-Oligosaccharide wurden aus Extrakten aus (c) wie in 1 beschrieben und in einem Szintillationszähler gereinigt. </li><li> Durchschnitt von 3 Experimenten für Prozent Dolichol-Oligosaccharide (d) der gesamten cpm in Retentat (c + d). </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Pulse-Chase Analyse der gesamten NIH 3T3 Glykoproteine ​​in unbehandelten Zellen und auf proteasomalen Hemmung Nach 1h Puls-Markierung mit. [2 bis 3 H] erhielten wir eine erwartete Profil mit einigen glucosyliertenVorläufer restlichen (Glc 2 Man 9 GlcNAc 2 (G2M9) und G1M9), aber die meisten der Label in M9 und M8 Arten, wobei letztere das Ergebnis Trimmen aller Glucose und einem Mannoserest (Abbildung 1 A). Kein freier Mannose oder andere kleine Vorstufen festgestellt wurden, hervorgeht, dass die Gründlichkeit der Reinigung. Nach einer ziemlich langen 8h jagen gab es umfangreichere Trimmen M7-6 und eine kleine Menge von M5, aber die großen Arten weiter M9 und M8 (Abbildung 1 B). Wenn die Jagd in der Gegenwart eines proteasomalen Inhibitor (30 uM MG-132) durchgeführt wurde, gab es nur eine geringe Akkumulation dieser gleichen getrimmt Spezies (Abbildung 1 C). <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Quantitative Analyse der Zuckerketten eines ERAD Substrat insgesamt Glykoproteine ​​verglichen. (A) In einem Experiment, ähnlich dem in Abbildung 1 wurden relative molare Mengen von jedem Oligosaccharid Arten basierend auf Mannose-Gehalt berechnet. Wir konvertierten die cpm-Werte für jedes Glycanspezies erhalten, der prozentuale Anteil der einzelnen Arten bezogen auf die gesamte Summe der relativen molaren Mengen aller Arten, die damals als eine Funktion der Jagd Zeit für einen Durchschnitt von zwei Experimenten aufgetragen. (B) Ähnliche zu (A), außer dass Glykane vom ERAD Substrat ASGPR H2a veröffentlicht wurden analysiert nach dem Puls Kennzeichnung und Verfolgung von bis zu 4h, in der Gegenwart oder Abwesenheit des proteasomalen Inhibitor MG-132. (C)-Werte für 4h Jagd in der Gegenwart von MG-132 aus (A) und (B) sind für ASGPR H2a und das Glykoprotein Pool verglichen. (D) Schema von N-verknüpften Zucker-Kette Trimmen Prozesse in der ER. Zucker Trimmen Prozesse, die M6-5-Leitung in Verbindung mit Proteinen (R), dass eine gezielte, um ERAD sind im Vergleich zu M9-8 auf diejenigen, Ausgang zum Golgi und darüber hinaus. Die Ergebnisse zeigen, dass die ERAD-Prozess mit dem Mannose Trimmen von N-Glykane von Arten mit 5-6 Mannoseresten restliche Ausbeute verbunden ist.

<ol><li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li>
<li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+%28ER%29+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li>
<li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li>
<li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+%28ER%29+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li>
<li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li>
<li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li>
</ol>

Die Pulse-Chase Analyse der Glykane in lebende Zellen mit HPLC-Trennung bietet eine Methode zur Untersuchung der Dynamik von Oligosaccharid bauliche Veränderungen während der gesamten Lebensdauer eines Glykoproteins. Es gibt zunehmend Beweise, dass solche Änderungen bei der Erzeugung der Signale für ER falten, Qualitätskontrolle und-handel Systemen 2-5 sind beteiligt. Die Methode kann nicht nur für einen bestimmten Glykoprotein von Interesse, sondern auch für die Analyse der Dynamik der Struktur der gesamten ...

<table><tbody><tr><td>600E Multisolvat-Zuführungssystem-Controller</td><td>Waters</td><td>WAT062710</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril LiChrosolv (Gradientenqualität für Flüssigkeitschromatographie)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.0003</td><td></td></tr><tr><td>Microcon Amicon Ultra 0,5 ml 30K oder Centricon ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC503024 oder 4208</td><td></td></tr><tr><td>Konzentrator 5301, inkl. 48 x 1,5 / 2,0 ml Rotor mit festem Winkel</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.016</td><td></td></tr><tr><td>Dialysiertes F&amp;#8211;tales Kälberserum</td><td>Biological Industries</td><td>04-011-1A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modifiziertes Eagle&amp;rsquo;s Medium</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modifiziertes Eagle&amp;rsquo;s Medium – glucosefrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Natriumsalz (Titriplex III)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1084180250</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf Kit (1.000.000 Einheiten/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>p0703S</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;tales Kälberserum (FCS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Frac-100 Fraktionssammler</td><td>Amersham</td><td>18-1000-77</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigkeits-Zählgeräte LS 6500 für Szintillationszählung</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>510720</td><td></td></tr><tr><td>Mannose, D-[2-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H(N)]- (Spezifische Aktivität: 15–30 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET570A</td><td></td></tr><tr><td>N-Carbobenzyloxy-leucyl-leucyl-leucinal (MG-132)</td><td>Calbiochem</td><td>474790</td><td></td></tr><tr><td>N-Glycosidase F (1000 Einheiten/ml)</td><td>Roche Group</td><td>11365177</td><td></td></tr><tr><td>N-Octylglucosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3757</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3-Zellen</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Flour</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6013199</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorsäurelösung (49–51 %, für HPLC)</td><td>Fluka</td><td>79607</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Protein A-Sepharose-Kügelchen</td><td>Repligen</td><td>IPA300</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen-polyklonaler anti-H2 karboxyterminaler &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat-Lösung (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Spherisorb NH2-Säule, 5 &amp;mu;m, 4,6 x 250 mm</td><td>Waters</td><td>PSS831115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-Cell Ultraschallprozessoren VCX 750</td><td>Sonics and Materials, Inc.</td><td>690-003</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Puffer A:&lt;/strong&gt; 1 % Triton X-100, 0,5 % (w/v) Natriumdesoxycholat, Protease-Inhibitor-Cocktail 2 % (v/v) in PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Puffer B:&lt;/strong&gt; 0,5 % (w/v) SDS, Protease-Inhibitor-Cocktail 2 % (v/v) in PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Puffer C:&lt;/strong&gt; Reaktionspuffer für N-Glycosidase F: 200 mM Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 8,0, 4 mM EDTA, 1,5 % N-Octylglucosid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 stabil exprimierend H2a &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Puffer D:&lt;/strong&gt; 0,5 % Triton X-100, 0,25 % (w/v) Natriumdesoxycholat, 0,5 % (w/v) SDS, Protease-Inhibitor-Cocktail 2 % (v/v) in PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Puffer E:&lt;/strong&gt; 0,5 % (w/v) SDS, 1 % (v/v) 2-Mercapt&amp;#8211;ethanol, Protease-Inhibitor-Cocktail 2 % (v/v) in PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

pulse-chase-analyse von n-verknüpften zuckerketten von glykoproteinen in säugerzellen

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Die Befestigung der Glc<sub&gt; 3</sub&gt; Man<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; Vorläufer Oligosaccharid entstehenden Polypeptide in der Notaufnahme ist eine übliche Variante für sekretorische Proteine. Obwohl diese Änderung in mehrere biologische Prozesse verwickelt war, sind weitere Aspekte ihrer Funktion entstehenden, mit den letzten Beweis für seine Rolle in der Produktion von Signalen für Glykoprotein Qualitätskontrolle und-handel. So sind Phänomene im Zusammenhang mit N-Glycane und deren Verarbeitung intensiv untersucht. Methoden, die kürzlich für Proteomanalyse entwickelt haben stark die Charakterisierung von Glykoprotein N-Glycane verbessert. Dennoch liefern sie keine Einsicht in die Dynamik des Zuckers Kette der Verarbeitung beteiligt. Dafür sind die Kennzeichnung und Pulse-Chase Analyse-Protokolle verwendet, sind meist komplex und geben sehr geringen Ausbeuten. Wir beschreiben hier eine einfache Methode zur Isolierung und Analyse von metabolisch markierten N-gebundene Oligosaccharide. Das Protokoll ist für die Kennzeichnung von Zellen mit [2 basiert -<sup&gt; 3</sup&gt; H] Mannose, denaturierenden Lyse und enzymatische Freisetzung der Oligosaccharide entweder aus einem speziell immunpräzipitiert Protein von Interesse oder aus dem allgemeinen Glykoprotein-Pool durch sequentielle Behandlung mit Endo H und N-Glycosidase F, durch molekulare Filtration (Amicon) gefolgt. Bei dieser Methode der isolierten Oligosaccharide dienen als Input für die HPLC-Analyse, die eine Diskriminierung zwischen verschiedenen Glykanstrukturen ermöglicht je nach Anzahl der Monosaccharideinheiten aus ihnen, mit einer Auflösung von einem Monosaccharid. Mit dieser Methode konnten wir hohe Mannose N-linked Oligosaccharid Profile von insgesamt Zelle Glykoproteine ​​nach Pulse-Chase in normalen Bedingungen und unter Proteasom-Hemmung. Diese Profile wurden mit denen aus einem immunpräzipitiert ER-assoziierte Degradation (ERAD) Substrat verglichen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die meisten NIH 3T3 Zellen Glykoproteine ​​relativ stabil sind und dass die meisten ihrer Oligosaccharide sind auf den Menschen zugeschnitten<sub&gt; 9-8</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. Im Gegensatz dazu sind instabil ERAD Substrate Man getrimmt<sub&gt; 6-5</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; Und Glykoproteine ​​tragen diese Arten sammeln auf Hemmung der Proteasom abgebaut.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Analyse der Veränderung der N-Glycane durch das frühe Leben von Glykoproteinen nach ihrer Biosynthese in Säugetierzellen. Dies wird durch Puls-Chase Analyse der metabolisch markierten Glykane, enzymatische Freisetzung von Glykoproteinen und Prüfung durch HPLC erreicht.

Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen

Die Anheftung des Vorläufer-Oligosaccharids Glc3Man9GlcNAc2 an naszierende Polypeptide im ER ist eine weitverbreitete Modifikation für sekretorische Proteine. Obwohl ...

Die Analyse der nicht verknüpften Zuckerketten auf Glykoproteinen beginnt mit der Markierung der Glykane und Zellen mit tritiiertem Mannose. Die Pulse-Platte wird auf Eis abgekühlt, während die Chase-Platte für einen gewünschten Chase-Zeitraum inkubiert wird, ohne Markierung. Anschließend werden die Proben lysiert, und ein Glykoprotein der Wahl wird immunpräzipitiert, denaturiert, und seine Glykane werden enzymatisch freigesetzt.Die Oligosaccharide werden anschließend durch molekulare Filtration weitergereinigt, wodurch sie von Proteinen und anderen Kontaminanten, die größer als 30 Kilodalton sind, getrennt werden. Die Glykane werden danach mittels HPLC getrennt. Die Menge jeder Glykanform wird durch Messung der Intensität des radioaktiven Signals in jeder eluierten Fraktion bestimmt.Hallo, ich bin Edward Azo aus dem Labor von Hi Geraldo Letter Kremer am Department für Zellforschung und Immunologie der Universität Tel Aviv. Ich gehöre außerdem zum Gerardo Letter Kremer-Slab. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung und Analyse metabolisch markierter und gebundener Oligosaccharide.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Dynamik der Zuckerkettenverarbeitung

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Die Bestimmung der Zellzyklus-Position eine Population von Zellen, oder zu verstehen, wie Signale Verbreitung beeinflussen, kann leicht durch Durchflusszytometrie mit diesem Protokoll gemessen werden. Wir berichten über einen einfachen experimentellen Ansatz zur Färbung von Zellen und die Quantifizierung ihrer Position in den Zellzyklus.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

Zelloberflächen-Proteine ​​sind biologisch wichtige und weithin glykosyliert. Wir stellen hier eine Glykopeptid-Capture-Ansatz für einfache LC-MS basierte Proteomanalysen löslich zu machen, zu bereichern, und deglycosylieren diese Proteine.

Glycopeptid-Capture für Zelloberflächen Proteomics

Um die Vielfalt von O-verknüpften Glykanen umfassend zu erforschen, wird ein neues Verfahren zur reduktiven In-Gel-β-Eliminierung, kombiniert mit Permethylierung und einer schnellen Phasenteilungsmethode, auf die Analyse von O-verknüpften Glykanen angewendet, die direkt von Glykoproteinen freigesetzt werden, die durch SDS-PAGE aufgelöst wurden und für eine anschließende glykomische Analyse mittels Massenspektrometrie zugänglich sind.

Verbesserte In-Gel-reduktive β-Elimination für umfassende O-gebundene und Sulfo-Glykomik durch Massenspektrometrie

Es wurde ein Hochdurchsatzprotokoll für die kombinierte Proteomik- und Glykomik-Aufreinigung und die LC-MS/MS-Quantifizierung im Plasma entwickelt. Die Deamidierungsanalyse von N-verknüpften Glykosylierungsmotiven war spezifisch für deglykosylierte Stellen. Eine genaue Quantifizierung der N-Glykane wurde durch die Kopplung der filtergestützten N-Glykan-Trennung an die Individualitätsnormalisierung bei der Markierung mit der Glykanhydrazid-Tag-Strategie erreicht.

Eine quantitative Glycomics und Proteomics Kombinierte Reinigungsstrategie

Dieser Artikel stellt eine verbesserte Form einer neuartigen Bottom-up-Glykomics-Technik vor, die entwickelt wurde, um das gepoolte Zusammensetzungsprofil von Glykanen in unfraktionierten Bioflüssigkeiten durch die chemische Zerlegung von Glykanen in ihre konstituierenden bindungsspezifischen Monosaccharide für den Nachweis durch GC-MS zu analysieren. Mögliche Anwendungen sind die Früherkennung von Krebs und anderen glykan-affektiven Störungen.

Glycan Knoten Analyse: Ein Bottom-up-Ansatz Glycomics

Wir beschreiben eine modifizierte Methode zur Membranfraktion isoliert von menschlichen Zellen und die Probenvorbereitung für den Nachweis von SCAP N -glycosylation und Gesamtprotein durch Western - Blot verwendet wird . Wir stellen ferner eine GFP-Markierungsverfahren SCAP Handel mittels konfokaler Mikroskopie zu überwachen. Dieses Protokoll kann in regelmäßigen biologischen Laboratorien verwendet werden.

Analyse von SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Und Handel in menschlichen Zellen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine allgemeine Puls-Jagd-Methode, die die kinetische Analyse der Faltung, Transport und Abbau von Proteinen in lebenden Zellen einzuhaltenden erlaubt.

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Immunglobulin G (IgG) N-Glycanwird durch hydrophile Wechselwirkungschromatographie UPLC charakterisiert. Darüber hinaus ist die Struktur von IgG N-Glycan klar getrennt. Hier wird eine Einführung in diese experimentelle Methode vorgestellt, so dass sie in der Forschung weit verbreitet werden kann.

Immunglobulin G N-Glycan Analyse durch Ultra-Performance Liquid Chromatographie

Posttranslationale Modifikationen (PTMs) verändern Proteinstrukturen und -funktionen. Methoden zur gleichzeitigen Anreicherung mehrerer PTM-Typen können die Abdeckung in Analysen maximieren. Wir präsentieren ein Protokoll mit dual-funktioneller Ti(IV)-immobilisierter Metallaffinitätschromatographie, gefolgt von Massenspektrometrie zur gleichzeitigen Anreicherung und Analyse der Protein-N-Glykosylierung und Phosphorylierung in Pankreasgeweben.

Eine Spin-Tip-Anreicherungsstrategie zur simultanen Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe

Hier schlagen wir ein einfaches Protokoll vor, das metabolisches Oligosaccharid-Engineering, Click-Chemie und Expansionsmikroskopie kombiniert und die Biobildgebung von intrazellulären sialylierten N-Glykoproteinen mit verbesserter Auflösung unter Verwendung von Routinemikroskopiegeräten ermöglicht.

Visualisierung der intrazellulären Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie

Lernen Sie die Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Glykanen in Säugerzellen mit metabolischer Markierung und HPLC. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Dynamik von Glykoproteinbiosynthese im Zeitverlauf.

Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen

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