Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen

Die Analyse der nicht verknüpften Zuckerketten auf Glykoproteinen beginnt mit der Markierung der Glykane und Zellen mit tritiiertem Mannose. Die Pulse-Platte wird auf Eis abgekühlt, während die Chase-Platte für einen gewünschten Chase-Zeitraum inkubiert wird, ohne Markierung. Anschließend werden die Proben lysiert, und ein Glykoprotein der Wahl wird immunpräzipitiert, denaturiert, und seine Glykane werden enzymatisch freigesetzt.

Die Oligosaccharide werden anschließend durch molekulare Filtration weitergereinigt, wodurch sie von Proteinen und anderen Kontaminanten, die größer als 30 Kilodalton sind, getrennt werden. Die Glykane werden danach mittels HPLC getrennt. Die Menge jeder Glykanform wird durch Messung der Intensität des radioaktiven Signals in jeder eluierten Fraktion bestimmt.

Hallo, ich bin Edward Azo aus dem Labor von Hi Geraldo Letter Kremer am Department für Zellforschung und Immunologie der Universität Tel Aviv. Ich gehöre außerdem zum Gerardo Letter Kremer-Slab. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung und Analyse metabolisch markierter und gebundener Oligosaccharide.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Dynamik der Zuckerkettenverarbeitung sowohl für gesamte zelluläre Glykoproteinpools als auch für einzelne Glykoproteine zu untersuchen. Gut, dann beginnen wir jetzt. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie NIH-3T3-Zellen verwenden, die über Nacht in einer 90 Millimeter Petrischale kultiviert wurden.

Für jede Probe wird die Kultur subkonfluent gehalten, um die Zellen von Glukose zu entziehen; bereiten Sie frisches zweifach konzentriertes, glukosefreies Medium vor, das mit 20 % dialysiertem FCS und 8 mmol/l Natriumpyruvat versetzt ist. Verdünnen Sie ein Volumen der gewünschten Menge des 2×-Mediums mit einem Volumen deionisiertem Wasser. Erwärmen Sie das Medium vor, und inkubieren Sie jede Zellprobe dann für 5 bis 15 Minuten in 5 mL des frischen, vorgewärmten Mediums. Falls eine längere Chase-Phase von mehr als 12 Stunden erforderlich ist, sollten die Zellen unter sterilen Bedingungen behandelt werden.

Am Ende der Inkubationszeit die Schalen entsprechend den Puls- und Chase-Proben kennzeichnen. Um die N-Glykane für die Glykoproteinanalyse mittels Immunpräzipitation zu markieren, das Verarmungsmedium durch ein Milliliter vorgewärmtes, glukosefreies Medium ersetzen, das mit 400 Mikrocurie pro Milliliter zwei mit Tritium markierten Mannosen ergänzt wurde. Für die Markierung und Analyse von Gesamtglykoproteinen 65 Mikrocurie pro Milliliter verwenden.

Nachdem das Verarmungsmedium ersetzt wurde, inkubieren Sie die Zellen unter normalen Zellkulturbedingungen für eine Stunde. Am Ende der einstündigen Inkubation entfernen Sie das Markierungsmedium vorsichtig von allen Proben. Geben Sie anschließend zwei Milliliter PBS bei vier Grad Celsius zu den den Puls-Proben entsprechenden Proben hinzu und stellen Sie diese auf Eis. Diese Proben werden als Pulse bezeichnet.

Verwenden Sie zwei Milliliter vorgewärmtes, normales komplettes Kulturmedium, um die Chase-Proben dreimal zu spülen. Geben Sie dann fünf Milliliter des vorgewärmten regulären Mediums zu den Zellen hinzu.

Stellen Sie die Chase-Proben für die gewünschten Chase-Zeiträume in einen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Während der Inkubation der Chase-Proben waschen Sie die Puls-Proben, die dreimal auf Eis lagen, dreimal mit je zwei Milliliter eiskalter PBS. Anschließend lösen Sie die Zellen mithilfe eines Zellabstreifers vom Probengefäß.

In zwei Millilitern PBS werden die freigesetzten Zellen in ein zwei Milliliter fassendes EOR-Gefäß gegeben. Die Zellen kurz bei 16.000 ×g für sechs bis 10 Sekunden zentrifugieren, um den Überstand zu entfernen, und das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Sobald die Inkubation der Chase-Proben abgeschlossen ist, spülen Sie diese ab.

Zentrifugieren und lagern Sie die Proben wie gerade für die Pulsproben gezeigt. Wenn Sie zur Zelllyse fortfahren möchten, nehmen Sie die Zellen aus dem Gefrierschrank. Für die IP-Analyse lysieren Sie die Zellen, indem Sie 300 Mikroliter Puffer hinzufügen.

Wirbeln Sie kurz und inkubieren Sie 20 Minuten auf Eis. Für die Analyse der Proben von gesamten Glykoproteinen 300 Mikroliter Puffer B. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten auf Eis, gefolgt von viermaliger Sonifikation, jeweils 10 Sekunden bei maximaler Amplitude. Anschließend die Proben fünf Minuten kochen.

Zentrifugieren Sie abschließend alle Lysate 20 Minuten bei 16.000 G und vier Grad Celsius. Überführen Sie das Überstand in ein neues EOR-Gefäß und entsorgen Sie den Pellet. Fahren Sie mit der Immunpräzipitation fort, um ein Protein der Wahl auf die hier demonstrierte Immunpräzipitation des H2A-Glykoproteins zu untersuchen.

Fügen Sie 20 µL pro Probe Protein, A agro speeds und 3 µL pro Probe des kaninchenspezifischen polyklonalen Anti-H-2A-Antikörpers des Labors zum Überstand der lysierten Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Proben vier bis 16 Stunden bei vier Grad Celsius unter ständigem Mischen durch langsame Rotation. Am Ende der Inkubation pelletieren Sie die Kügelchen durch Zentrifugation und entfernen vorsichtig den Überstand mittels Vakuum. Waschen Sie die Kügelchen viermal, indem Sie jeweils 500 µL Puffer T hinzufügen.

Viermal zentrifugieren, um die Perlen abzutrennen, und das Überstand entfernen, um die gebundenen Proteine von den Perlen freizusetzen. 10 Mikroliter Denaturierungspuffer aus dem Endo-H-Kit zum Pellet der Perlen hinzufügen und die Proben fünf Minuten lang kochen. Die Perlen erneut abzentrifugieren und den Überstand in ein neues EOR-Röhrchen überführen.

Die Ellu-Proteine sind nun bereit für die Deglykosylierung. Die Glykane werden mithilfe des Enzyms und OH sowohl aus den IP- als auch aus den Gesamtproben freigesetzt. Für die IP-Proben geben Sie 0,5 Mikroliter Endo-H-Enzym zu jeder Probe hinzu, zusammen mit 10 Mikrolitern des zweifachen Endo-H-Reaktionspuffers. Inkubieren Sie die Proben drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Für Gesamtglykoproteine das Überstand der Zelllysate auf einen MicroCon-Filter mit einer Grenze von 30 Kilodalton auftragen. Den Gesamtproteinauszug dreimal mit jeweils 100 Mikroliter Puffer E durch wiederholte Zentrifugation bei 14.000 G für drei Minuten waschen. Drei Mikroliter 10x Endo-H-Reaktionspuffer und 1,5 Mikroliter des Endo-H-Enzyms zum MicroCon hinzufügen, in dem die gewaschenen Proteine verbleiben, und gemeinsam mit den IP-Proben drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach der dreistündigen Inkubation verdünnen Sie die IP-Probe fünfmal mit entionisiertem Wasser und geben Sie sie auf einen neuen MicroCon-Filter, zentrifugieren Sie drei Minuten bei 14.000 G. Waschen Sie sowohl die IP- als auch die Gesamtproben durch Zugabe von 50 Mikrolitern entionisiertem Wasser und Zentrifugation. Wiederholen Sie dies noch zweimal. Bewahren Sie gegebenenfalls den Durchlauf, der die gespaltenen Glykane enthält, auf, um Endo-H-resistente Glykoproteine zu analysieren. Anschließend werden die resistente Glykoproteine mit 200 Milli-Einheiten N-Glycosidase F in 15 Mikrolitern Puffer C bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden inkubiert.

Die Elution mit entionisiertem Wasser erfolgt wie eben gezeigt. Trocknen Sie die Proben vollständig in einem Speed-Vak-Konzentrator unter Erwärmung bis zu 45 Grad Celsius, um den Prozess zu beschleunigen. Resuspendieren Sie die trockenen Pellets in 12 Mikrolitern HPLC-Lösungsmittel und geben Sie die Proben auf eine in der HPLC-Anlage installierte Sphä- oder Amino-Säule.

Führen Sie die Proben wie in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben durch. Sammeln Sie 48 Fraktionen für jeden Probendurchlauf. Messen Sie mithilfe eines Szintillationszählers die CPM-Werte der gesammelten Fraktionen und tragen Sie die CPM-Werte als Funktion der Fraktionsnummer auf.

Berechnen Sie den Prozentsatz der Manos-Reste aller Glykanspezies, wie in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Hier sind repräsentative Ergebnisse der Zuckerkettenanalyse von Gesamtglykoproteinen aus einer Probe mit einer Stunde Pulsmarkierung. Die CPM-Auslese der HPLC-Fraktionen wird als Funktion der Fraktionsnummer im resultierenden Profil dargestellt.

Jeder Peak stellt eine spezifische Glykanart dar, die durch einen HPLC-Lauf mit bekannten Glykanstandards identifiziert wurde. Für jede Glykanart wird deren molarer Anteil an den Gesamtglykanen als Funktion der Chase-Zeit aufgetragen. Die hier gezeigte Zeit repräsentiert eine solche Analyse für ein spezifisches fehlgefaltetes Glykoprotein, das mittels Immunpräzipitation aus einer mit dem Proteasom-Inhibitor MG 132 behandelten Probe isoliert wurde.

Die abgeschnittene Glykanspezies M fünf sechs reichert sich während der Chase-Phase an, was zu dem Schluss führt, dass Oligosaccharide auf fehlgefalteten Proteinen einer umfangreichen Mannose-Abspaltung vor dem Abbau unterzogen werden. Dies steht im Gegensatz zu den Oligosacchariden an gesamten Glykoproteinen aus Proben, die auf die gleiche Weise behandelt wurden. Hier bleiben M neun acht die vorherrschende Glykanspezies während der Chase-Phase, mit nur einer geringen Zunahme der Menge an M fünf sechs. Dies führt zu dem Schluss, dass nur ein kleiner Bruchteil des gesamten Glykoproteinpools für den mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziierten Proteinabbau bestimmt ist.

Gekürzte Rad. Wie im begleitenden schriftlichen Protokoll weiter erläutert, haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Kombination aus Palase in lebenden Zellen und HPLC-Analyse verwendet, um die Dynamik der Zusammensetzung unverknüpfter Oligosaccharide während der Lebensdauer eines Glykoproteins zu verfolgen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, Kontaminationen der Chase-Proben mit Spuren radioaktiver Substanzen zu vermeiden, da dies zu einer unerwünschten Markierung der Glykane während der Chase-Phasen bei der Größenseparation führen würde.

Es ist außerdem wichtig, das HPLC-System auf einen konstanten Druck einzustellen, um die Konsistenz der Glykan-Fraktionierung sicherzustellen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.