Name: SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-23T04:53:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Lernen Sie die SDS-PAGE/Immunoblot-Detektion von Aβ-Multimeren in humanen kortikalen Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope-Retrieval. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Ergebnisse für die Alzheimer-Forschung.

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Vielen Dank an Elaine Pranski und Carolyn Suwyn für hervorragende technische Unterstützung und Harry LeVine III, M. Paul Murphy, und Marla Gearing für wichtige Gespräche. Die Finanzierung wurde von RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, die Woodruff-Stiftung und der Emory University Research Committee zur Verfügung gestellt.

Teil 1: Herstellung von geklärt Gewebehomogenaten <ol><li> Dounce homogenisieren fixierten kortikalen Gewebe in 4-fache Volumen von eiskaltem Puffer (0,1 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung [Ca + + - und Mg + +-freien] plus 2x Protease-Inhibitor-Cocktail [Santa Cruz]) mit ca. 30 sogar Pistill Schlägen (zB das Hinzufügen von 400μl Puffer bis 100 mg Gewebe). </li><li> Spin-Homogenate für 5 Minuten bei 3.000 g (4 ° C). Entfernen Sie vorsichtig geklärt Überstände und speichern Aliquots dieser Extrakte bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bestimmen Gesamt-Protein-Konzentration (ug / ul) für geklärt Homogenaten mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay, nach den Anweisungen des Herstellers (ThermoFisher). </li></ol> Teil 2: SDS-PAGE Probenvorbereitung <ol><li> Mit einem 10 gut, ist 10-20% Tricin-Gel (Invitrogen), die maximale Lautstärke, die pro Vertiefung geladen werden können ~ 25 &amp;mgr; l. Das Gesamtvolumen umfasst 2x SDS Probenpuffer und 10x Reduktionsmittel, so das maximale Volumen der Klärung Homogenat, dass pro Vertiefung geladen werden kann, ist 10 &amp;mgr; l. Geklärt 20% (w / v) kortikalen Homogenaten sollte eine Gesamt-Protein-Konzentration von mehr als 5 ug / ul, so dass für 50 Mikrogramm Gesamt-Protein pro Vertiefung. Proben mit weniger als 5mg/ml Protein wird notwendig loading insgesamt weniger Protein pro Well. Allerdings sind hohe Protein-Spiegel optimal für den Nachweis von monomeren und aggregierten Aß (50-60μg Gesamt-Protein ist optimal). Legen Sie immer die gleiche Menge an Gesamt-Protein pro Vertiefung. </li><li> Für jedes Gel, Last mindestens eine Vertiefung mit 10 &amp;mgr; l einer Molekulargewichtsmarker wie SeeBlue Plus2 (Invitrogen). Als positive Kontrolle, laufen 10-100 ng der synthetischen Aβ40 oder Aß42 Peptid (verdünnt in 1xPBS) in einen anderen Brunnen. </li><li> Bereiten Reaktionsmischungen auf Eis, mit frisch aufgetauten, geklärt Homogenaten. Vortex Rohre für 5-10 Sekunden, Wärme in einem trockenen Bad bei 100 ° C für 5 Minuten, dann schnell drehen alle Proben, um Kondensation in den Deckel zu entfernen. </li></ol> Teil 3: SDS-PAGE-Gel-Elektrophorese <ol><li> Laden gevortext Proben auf eine 10-20% Tricin-Gel in den XCell Sure Lock-Mini-Cell Gelbox mit Tricin SDS Laufpuffer, nach den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen), </li><li> Run Gel bei einer konstanten Spannung von 125V für etwa 90 Minuten. Lassen Proben laufen, bis die 4KDa Marker Band ist ca. 1 cm vom unteren Rand des Gels. </li></ol> Teil 4: Übertragen von Proteinen aus Gelen auf Membranen <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig Gele aus Kunststoff-Gehäuse und montieren die Übertragung Sandwich im Inneren des XCell II Blot Module, nach den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen). Vornässen Schreibunterlagen und 0,2 um Nitrozellulose-Membranen mit Tris-Glycin-Transfer-Puffer (20% Methanol), und entfernen Sie alle Blasen aus Schreibunterlagen oder das Filterpapier / Membran-Sandwich. </li><li> Im XCell Gelbox, füllen die innere Kammer mit Transfer-Puffer und füllen die äußere Kammer mit DIH 2 O (Methanol Belichtung kann zermürben die Kunststoff gelbox im Laufe der Zeit). </li><li> Führen Sie den Transfer für 2-3 Stunden bei einer konstanten Stromstärke von 25 mA. </li><li> Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, dekonstruieren das Sandwich und Ort der Gele in DIH 2 O und die Membranen in 1xPBS, sowohl in eckigen Kunststoff-Petrischalen (oder einem anderen geeigneten Behälter). </li><li> Zur Visualisierung der Effizienz von Protein zu übertragen, können Gele mit Simply Blue SafeStain (Invitrogen) gefärbt werden, und die Membranen mit roten Flecken Ponceau S (Sigma Aldrich), die beide nach den Anweisungen des Herstellers. Diese Färbung wird nicht mit Immunoblotting stören. Wenn Färbung zeigt ineffiziente Protein übertragen, ändern Transferzeit in Schritt 3. </li></ol> Teil 5. Antigen-Epitopdemaskierungslösung &amp; Immunoblotting <ol><li> Antigen-Retrieval ist ein wichtiger Schritt bei der Enthüllung des Aß-Epitope auf der Membran für die Antikörperbindung im Immunoblot. Alle Dampfgarer, Mikrowelle oder Wasserbad, dass eine konstante Temperatur von 100 ° C hält genügt. Für Antigen-Retrieval in einem Dampfer, Wärme-Dichtung der Membran in einer Heavy-Duty-Kapak Plastikbeutel mit 1xPBS gefüllt, bei Raumtemperatur. Legen Sie den Beutel flach in eine vorgewärmte Dampfer, einmal den Beutel beginnt zu expandieren, inkubieren für weitere 15 Minuten. Lassen Sie die Membran langsam abkühlen, bevor Sie sie aus dem Beutel, um eine übermäßige Faltenbildung zu verhindern. </li><li> Bei Raumtemperatur vorsichtig die Membran aus dem dampfenden Tasche und spülen Sie die Membran für 5 Minuten in 1xPBS, durch eine 5-minütige in TBS-T spülen (Saline, pH 8,0 mit 0,05% Tween-20 Tris-Buffered gefolgt [Sigma] ), auf einem Schüttler. Inkubieren Sie die Membran in Blocking-Lösung (2,5% Magermilch in TBS-T) für eine Stunde lang. Ohne Ausspülen, Transfer-Membran in eine Schale oder Kunststoff Beutel mit dem primären Antikörper in Blockierungslösung verdünnt (6E10 bei 1:1000 [1μg/ml] 1:5.000 [0.2μg/ml] Verdünnung Covance), Vermeidung von Blasens. Inkubieren auf einem Schüttler bei Raumtemperatur für 1 Stunde und dann 24-48 Stunden unter Schütteln bei 4 ° C (längere Inkubationszeit kann ein besseres Signal zu geben). </li><li> Spülen Sie die Membran für 30 Minuten in TBS-T (eine schnelle Spülung, gefolgt von 3 x 10 Minuten spült). </li><li> Inkubieren Sie die Membran in HRP-konjugierten sekundären Antikörper (Amersham ECL Schaf-Anti-Maus, GE Healthcare), bei 1:10.000 in Blocking-Lösung verdünnt, für 90 Minuten auf dem Schüttler bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie die Membran für 30 Minuten in TBS-T (eine schnelle Spülung, gefolgt von 3 x 10 Minuten spült). </li><li> Auf dem Schüttler inkubieren die Membran in frisch zubereiteten SuperSignal West Pico Elektrochemilumineszenz Reagenz (ThermoFisher) für 5 Minuten, tupfen Sie das überschüssige Reagenz auf fusselfreien Filterpapier und Ort der Membran in einer Filmkassette, zwischen Plastikfolie Protektoren. Blot off zusätzliche SuperSignal Reagenz mit staubfreien Kimwipes, wenn nötig. </li><li> Expose auf Kodak Biomax MR-Film für Intervalle von 30 Sekunden bis 30 Minuten und entwickeln in einem Film-Entwickler. Nach 5 Minuten wird die Aß Monomer-Banden wohl gesättigt sein. </li><li> Membranen können ausgezogen (nach dem Spülen in TBS-T) durch Schütteln in Restore Plus Stripping-Puffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur und reprobed mit zusätzlichen Antikörpern, wenn gewünscht. </li></ol> Teil 6: Repräsentative Immunoblot: <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1b.jpg" alt="Abbildung 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1b"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1c.jpg" alt="Abbildung 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1c"> Abbildungen 1a-c. Aufgeklärt Homogenate mit 50 Mikrogramm Gesamt-Protein von 7 Probanden werden auf das Vorhandensein von multimeren Aß und APP analysiert. Immunoblotting mit dem Antikörper 6E10 zeigt Aß Monomere, Dimere, Trimere, Tetramere und APP (Top-Band) in allen Alzheimer-Fälle, sowie reichlich höherem Molekulargewicht Aß-Multimere in 2 AD-Fälle. Synthetische Aβ40 bestätigt die Identität des niedermolekularen Banden. AD: Alzheimer, DLB: Demenz mit Lewy-Bodies, ND: Nondemented Menschen (a) 30 Minuten Filmbelichtung, (b) 5 Minuten Filmbelichtung, (c) 30 Sekunden Filmbelichtung..

<ol><li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Walker, L. C., LeVine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebral+proteopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">The cerebral proteopathies.</a> Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+amyloid%2C+and+Alzheimer%27s+disease%3A+a+perspective+in+honor%5BTitle%5D)+AND+%22of+Carl+Cotman.+Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor.</a> of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).</li>
<li>Walsh, D. M., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+oligomers+-+a+decade+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Abeta oligomers - a decade of discovery.</a> J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).</li>
<li>Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+immunoblot+sensitivity+by+heating+of+hydrated+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters.</a> Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).</li>
<li>Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hetergeneous+A4+peptides+in+human+cerebrospinal+fuid+and+blood+by+a+newly+developed+sensitive+Western+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay.</a> J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).</li>
</ol>

Trotz der Bedeutung der Aß Aggregation in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit 1,4,5, haben nur wenige Studien beschrieben oder quantifiziert die Verteilung der verschiedenen Aß-Multimere in menschlichen kortikalen Gewebeproben 2. Häufig verwendete immunhistochemische Techniken nicht für die Diskriminierung von unterschiedlichen multimeren Aß Spezies in festen kortikalen Gewebes ermöglichen. In fixierten kortikalen Gewebehomogenaten kann Aß Multimere getrennt und biochemisch untersucht mittels G...

<table><tbody><tr><td>Vollständige Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-29130</td><td>1 Tablette in 25 ml Puffer</td></tr><tr><td>BCA-Protein-Assay-Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell und XCell II Blot-Modul-Kit CE-Kennzeichnung</td><td>Invitrogen</td><td>EI0002</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS-Probe-Puffer (2X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Reduzierendes Reagenz (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Präfärbter Standard</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10-20 % Tricine-Gel 1,0 mm, 10 Vertiefungen</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625BOX</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose-Membranen, 0,2 &amp;mu;m Porengröße</td><td>Invitrogen</td><td>LC2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Laufpuffer (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycin-Transferpuffer (25X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>Stört die Immunfärbung nicht</td></tr><tr><td>ATX Ponceau S Rötungslösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09276</td><td>Stört die Immunfärbung nicht</td></tr><tr><td>Kapak wiederversiegelbare Kunststoffprobenbeutel</td><td>Fisher Scientific</td><td>0181225AA</td><td></td></tr><tr><td>6E10 Maus-monoklonaler Antikörper gegen A&amp;#946;(1-16)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>1:1.000 bis 1:5.000 für WB verdünnen</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>ECL Maus-IgG, HRP-gekoppeltes Ganzantikörper A&amp;#946; (aus Schaf)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>1:10.000 verdünnen</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico chemilumineszenter Substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>34077</td><td></td></tr><tr><td>Kodak Biomax MR Film</td><td>Carestream Health</td><td>870 1302</td><td></td></tr></tbody></table>

sds-page/immunoblot detektion von aß multimere in human kortikale gewebehomogenaten mit antigen-epitope retrieval

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

Die anomale Falten und Polymerisation des β-Amyloid (Aß)-Peptid wird angenommen, dass die neurodegenerative Kaskade in der Alzheimer-Pathogenese der Erkrankung einleiten<sup&gt; 1</sup&gt;. Aß ist vorwiegend ein 40 - oder 42-Aminosäuren-Peptid, die anfällig für Selbst-Aggregation in β-Faltblatt-reiche Amyloidfibrillen, dass in den Kernen der zerebralen senilen Plaques bei Alzheimer-Krankheit gefunden werden wird. Zunehmende Hinweise darauf, dass niedermolekulare, lösliche Aß Multimere toxischer als fibrillären Aß-Amyloid sind<sup&gt; 2</sup&gt;. Die Identifizierung und Quantifizierung von niedrig-und hochmolekularen multimeren Aß Arten in Hirngewebe ist ein wesentliches Ziel in Alzheimer-Forschung und der angewandten Methoden auch auf die Identifizierung und Charakterisierung von toxischen Multimere in anderen proteopathies angewendet werden<sup&gt; 3</sup&gt;. Natürlich vorkommende Aß Multimere kann durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese durch Immunoblot mit Aß-spezifische Antikörper, gefolgt erkannt werden. Allerdings erfordert die Trennung und Detektion von multimeren Aß die Verwendung von hochkonzentrierten kortikalen Homogenaten und Antigen-Retrieval in kleinen Porengröße Nitrocellulosemembranen. Hier beschreiben wir eine Technik für die Herstellung von geklärt menschlichen kortikalen Homogenate, Trennung von Proteinen durch SDS-PAGE und Antigen-Epitopdemaskierungslösung / Western-Blot mit einem Antikörper 6E10, die N-terminalen Region des Aß-Peptid. Mit diesem Protokoll, setzen wir konsequent erkennen Aß Monomere, Dimere, Trimere, Tetramere und höherem Molekulargewicht Multimere in kortikalen Gewebe von Menschen mit Alzheimer-Pathologie.

Wir beschreiben eine Technik für die Herstellung von geklärt menschlichen kortikalen Homogenate, Protein Trennung durch SDS-PAGE, Antigen-Retrieval und Immunoblot mit einem Antikörper gegen das Aß-Peptid. Mit diesem Protokoll, setzen wir konsequent erkennen monomeren und multimeren Aß in kortikalen Gewebe von Menschen mit Alzheimer-Pathologie.

SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval

Es wird angenommen, dass die anomale Faltung und Polymerisation des $\beta$-Amyloid-Peptids (A$\beta$) die neurodegenerative Kaskade bei Alzheimer ...

Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis von Beta-Maltasen in menschlichem kortikalem Gewebe. Zunächst wird das homogenisierte Gewebe mit einem Ultraschallsondiergerät behandelt und durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geklärt. Anschließend werden Proben in SDS-Puffer reduziert, gekocht und auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen.Die Proteine aus dem Gel werden auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, und die Membran wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Dampf erhitzt. Abschließend wird die Membran über Nacht auf einem rotierenden Schüttler in primärem Antikörper, danach in HRP-konjugiertem sekundärem Antikörper und schließlich in Luminal-Peroxid-Reagenz inkubiert, bevor sie Röntgenfilm ausgesetzt wird. Hallo, ich bin Rebecca Rosen aus dem Labor von Larry Walker in der Abteilung für Neurowissenschaften am Yerkes National Primate Research Center der Emory University.Heute zeigen wir Ihnen, wie man Aβ-Multimere und kortikale Homogenate mittels SDS-Gelelektrophorese und Immunschichtanalyse mit hitzeinduzierter Antigenrückgewinnung nachweisen kann. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Konzentrationen und Verteilungsmuster unterschiedlicher Aβ-Mu

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Die reversible Zugabe von Palmitat an Proteine ​​ist ein wichtiger Regulator des intrazellulären Protein-Trafficking. Dies ist von besonderem Interesse, wo viele Neuronen synaptische Proteine ​​palmitoyliert. Wir nutzen einen einfachen biochemischen Verfahren zur palmitoylierten Proteinen in kultivierten Neuronen, die für mehrere Zelltypen und Gewebe angepasst werden kann zu detektieren.

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von zunehmend unlöslichem/aggregiertem alpha-Synuclein (α-syn) aus postmortalem menschlichem Hirngewebe. Durch die Verwendung von Puffern mit zunehmender Detergensfestigkeit und Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugationstechniken können die variablen Eigenschaften der α-syn-Aggregation in erkranktem und nicht erkranktem Gewebe untersucht werden.

Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung von Proteineinheiten, die Antigene für IgM-Antikörper von Mensch und Maus mit spezifischen Kappa (Vκ) Leichtketten enthalten. Dieses Protokoll ist nicht auf Antikörper der IgM-Klasse beschränkt, sondern gilt für alle Immunglobulin-Isotypen, die bei Immunpräzipitationen mit ausreichend hoher Affinität auf ihr Antigen abzielen.

Antikörper Bindungsspezifität für Kappa (V &amp; kgr;) Leichte Kette enthaltende Human (IgM) Antikörper: Polysialinsäure (PSA) An NCAM als Fallstudie

Verfahren zur Stabilisierung und Trenn nativen Proteinkomplexe aus unmodifizierten Gewebelysat gekoppelt, um ein Amin-reaktives Protein Vernetzers unter Verwendung von auf eine neuartige zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -System dargestellt.

Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

Hier präsentieren die Autoren ein einfaches und effizientes Protokoll zur Definition eines linearen antigenen Epitops unter Verwendung eines gereinigten monoklonalen Antikörpers und Peptid-Scans durch Dot-Blot-Hybridisierung. Das identifizierte Epitop kann dann in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden.

Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

Eine abgekürzte Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn wird beschrieben.

Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aβ Oligomere aus einem synthetischen Peptid in Vitro vorzubereiten und relative Mengen der Aβ Oligomer durch eine Dot-Blot-Analyse zu bewerten.

A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse

Diese Arbeit beschreibt die Synthese und Charakterisierung eines pomalidomidbasierten, bifunktionellen Homo-PROTAC als einen neuartigen Ansatz zur Induzieren von Ubiquitination und Abbau des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon (CRBN), dem Ziel von Thalidomid-Analogen.

Chemische Inaktivierung des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon durch Pomalidomid-basierte Homo-PROTACs

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für die Aufklärung der Funktion von Zielproteinen, und die Co-Immunpräzipitation (co-IP) kann PPIs leicht bestätigen. Wir transfizierten transient ein Plasmid, das für ein Epitop-markiertes Protein kodiert, in HEK-293-Zellen und entwickelten eine Immunpräzipitationsmethode, um die Bindung von zwei Zielproteinen einfach zu bestätigen.

Immunpräzipitation mit einem Anti-Epitop-Tag-Affinitätsgel zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Hier beschreiben wir ein Hefesystem, das die humane γ-Sekretase rekonstituiert. Dieses System ermöglicht die Identifizierung und Untersuchung von Mutationen, die die Aktivität beeinflussen, sowie das Screening von γ-Sekretase-Inhibitoren (GSIs). Unter Ausnutzung des Verlusts der Funktionseigenschaften familiärer Alzheimer-Mutanten ist es möglich, nach γ-Sekretase-Modulatoren (GSMs) zu suchen.

Saccharomyces cerevisiae Modelle der Alzheimer-Krankheit zum Screening von Genen, Mutationen und Chemikalien, die die Amyloid-Beta-Produktion durch γ-Sekretase beeinflussen

Lernen Sie die SDS-PAGE/Immunoblot-Detektion von Aβ-Multimeren in humanen kortikalen Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope-Retrieval. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Ergebnisse für die Alzheimer-Forschung.

SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval

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