SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

Rebecca F. Rosen; Yasushi Tomidokoro; Jorge A. Ghiso; Lary C. Walker

doi:10.3791/1916

SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-E...

JoVE Journal
Neuroscience

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SDS-PAGE/Immunoblot Detection of Aβ Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval

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10:48 min

April 23, 2010

DOI: 10.3791/1916-v

Rebecca F. Rosen¹, Yasushi Tomidokoro², Jorge A. Ghiso³, Lary C. Walker^1,4

¹Yerkes National Primate Research Center,Emory University, ²Department of Neurology, Institute of Clinical Medicine,Tsukuba University, ³Department of Pathology,New York University School of Medicine, ⁴Department of Neurology,Emory University

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Wir beschreiben eine Technik für die Herstellung von geklärt menschlichen kortikalen Homogenate, Protein Trennung durch SDS-PAGE, Antigen-Retrieval und Immunoblot mit einem Antikörper gegen das Aß-Peptid. Mit diesem Protokoll, setzen wir konsequent erkennen monomeren und multimeren Aß in kortikalen Gewebe von Menschen mit Alzheimer-Pathologie.

Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis eines Beta-Malters im menschlichen kortikalen Gewebe. Das erste homogenisierte Gewebe wird sondiert, beschallt und durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit geklärt. Als nächstes werden die Proben in SDS-Puffer gekocht und auf ein Polyacrylamid geladen.

Gelproteine werden auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und die Membran wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung dampferhitzt. Schließlich wird die Membran auf einem Orbitalschüttler über Nacht in einem primären Antikörper, einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper und dann einem luminalen Peroxidreagenz inkubiert, bevor sie dem Röntgenfilm ausgesetzt wird. Hallo, ich bin Rebecca Rosen aus dem Labor von Larry Walker in der Abteilung für Neurowissenschaften am Yerkes National Primate Research Center an der Emory University.

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