SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval

Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis von Beta-Maltasen in menschlichem kortikalem Gewebe. Zunächst wird das homogenisierte Gewebe mit einem Ultraschallsondiergerät behandelt und durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geklärt. Anschließend werden Proben in SDS-Puffer reduziert, gekocht und auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen.

Die Proteine aus dem Gel werden auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, und die Membran wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Dampf erhitzt. Abschließend wird die Membran über Nacht auf einem rotierenden Schüttler in primärem Antikörper, danach in HRP-konjugiertem sekundärem Antikörper und schließlich in Luminal-Peroxid-Reagenz inkubiert, bevor sie Röntgenfilm ausgesetzt wird. Hallo, ich bin Rebecca Rosen aus dem Labor von Larry Walker in der Abteilung für Neurowissenschaften am Yerkes National Primate Research Center der Emory University.

Heute zeigen wir Ihnen, wie man Aβ-Multimere und kortikale Homogenate mittels SDS-Gelelektrophorese und Immunschichtanalyse mit hitzeinduzierter Antigenrückgewinnung nachweisen kann. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Konzentrationen und Verteilungsmuster unterschiedlicher Aβ-Multimere in ungefestigten kortikalen Gewebeproben von Menschen mit Alzheimer-Krankheit sowie von altersentsprechenden nichtmenschlichen Primaten zu untersuchen. Beginnen wir also.

Beginnen Sie mit etwa hundert Milligramm ungefixiertem kortikalem Gewebe und homogenisieren Sie es durch etwa 30 gleichmäßige Stöße mit dem Pistill in ungefähr 400 Mikrolitern eiskaltem Puffer. Für eine 20-%-Gewichtsanteil pro Volumen sollte das Verhältnis von Gewebemasse zu Puffervolumen ein Milligramm zu vier Mikrolitern betragen. Nach der Homogenisierung überführen Sie die Homogenate in eine vier-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen und führen dreimal fünf Sekunden Ultraschallbehandlung bei Leistungsstufe fünf durch.

Nach der Sonikation die Homogenate in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und fünf Minuten bei 3000 ×g zentrifugieren. Den geklärten Überstand vorsichtig abheben und Aliquote von jeweils 50 µL dieser Extrakte bei −80 °C bis zur Verwendung lagern. Anschließend die Gesamtproteinkonzentration für frisch aufgetaute Aliquote der geklärten Homogenate mittels eines Bio-Säure- oder BCA-Assays gemäß den Herstelleranweisungen bestimmen. Geklärte 20 %ige kortikale Homogenate sollten eine Proteinkonzentration von mehr als 5 µg/µL aufweisen und können daher im Verhältnis 1:10 verdünnt werden, um im Messbereich des Plattenlesegeräts zu liegen. Für den BCA-Assay denaturierende Probeansätze mit denselben Aliquots der geklärten Homogenate vorbereiten.

Verwenden Sie etwa 50 bis 60 Mikrogramm Gesamtprotein und passen Sie das Volumen der kortikalen Homogenate entsprechend an, sodass jedes die gleiche Menge an Gesamtprotein enthält. Bereiten Sie die Proben auf ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern pro 10–20%-Trice-Gel vor. Für jedes Gel bereiten Sie eine positive Kontrolle aus 10 bis 100 Nanogramm synthetischem A-beta-40- oder A-beta-42-Peptid vor, das in 1× PBS auf 10 Mikroliter verdünnt wird, sowie 12,5 Mikroliter 2× SDS-Probenpuffer und 2,5 Mikroliter 10× Reduktionsmittel.

Nach der Vorbereitung aller Proben, einschließlich eines Beta-Kontroll-Vortex für fünf bis 10 Sekunden, erhitzen Sie sie in einem Trockenbad bei 100 Grad Celsius für fünf Minuten und zentrifugieren Sie anschließend alle Röhrchen kurz, um Kondenswasser im Deckel zu entfernen. Geben Sie die Proben auf ein in Tris-SDS-Laufpuffer in einer Elektrophoresekammer eingetauchtes Gel und füllen Sie mindestens ein Brunnen mit 10 Mikrolitern unverdünntem Molekulargewichtsmarker. Laufen Sie das Gel bei einer konstanten Spannung von 125 Volt für etwa 90 Minuten oder bis der 4-kDa-Marker sich etwa einen Zentimeter vom unteren Rand des Gels entfernt hat.

Entfernen Sie die Gele vorsichtig aus den Kunststoffhüllen und setzen Sie das Transfersandwich gemäß den Herstelleranweisungen zusammen. Benetzen Sie die Blotting-Pads vorab und pipettieren Sie Mikrometer-Nitrocellulosemembranen mit Tris-Glycin-Transferpuffer. Entfernen Sie alle Luftblasen aus den Blotting-Pads oder dem Filterpapiersandwich.

Füllen Sie die innere Kammer der Transfervorrichtung mit Transferpuffer und die äußere Kammer mit destilliertem Wasser. Führen Sie den Transfer zwei bis drei Stunden lang bei einer konstanten Stromstärke von 25 Milliampere durch. Wenn der Transfer abgeschlossen ist, demontieren Sie das Sandwich und legen Sie die Gele in eine Schale, die mit destilliertem Wasser gefüllt ist, und die Membranen in eine Schale, die mit einem XPBS für alle Protokollschritte gefüllt ist.

Stellen Sie sicher, dass Gele und Membranen vollständig mit Flüssigkeit bedeckt sind, um Austrocknung zu vermeiden. Um die Effizienz des Proteintransfers zu visualisieren, färben Sie die Gele mit unverdünnter Simply Blue Safe-Färbung für etwa eine Stunde und die Membranen mit 1× PON S Red-Färbung für etwa fünf Minuten. Die Inkubationszeiten richten sich nach den Herstellerangaben; diese Färbung beeinträchtigt die Immundetektion nicht.

Falls die Färbung eine ineffiziente Proteinübertragung anzeigt, passen Sie die Übertragungsdauer im dritten Schritt für die Antigen-Retrieval an. Erhitzen Sie in einem Dampfgarer die Membran in einer robusten CapEx-Kunststofftüte, die mit etwa 50 Millilitern 1×PBS bei Raumtemperatur gefüllt ist, unter Versiegelung. Sobald die Tüte zu expandieren beginnt, legen Sie sie flach in einen vorgeheizten Dampfgarer bei 100 Grad Celsius und inkubieren Sie weitere 15 Minuten, bevor Sie sie aus dem Dampfgarer entnehmen.

Lassen Sie die Membran langsam abkühlen, bevor Sie sie aus der Hülle entfernen, um übermäßiges Knittern bei Raumtemperatur zu vermeiden. Entfernen Sie die Membran vorsichtig aus der Hülle und spülen Sie sie fünf Minuten lang mit einem XPBS auf einem Rotationskorb nach, gefolgt von einer fünfminütigen Spülung in TBST auf einem Rotationskorb. Inkubieren Sie anschließend die Membran eine Stunde lang in Blockierungslösung auf einem Rotationskorb, ohne vorher zu spülen, und überführen Sie die Membran in eine Schale mit dem primären Antikörper sechs E 10, der spezifisch für den A-beta-terminale Bereich ist und in der Blockierungslösung im Verhältnis 1:1000 bis 1:5.000 verdünnt wurde.

Inkubieren Sie eine Stunde lang auf einem Rotations-Schüttler bei Raumtemperatur und anschließend 24 bis 48 Stunden unter Schütteln bei vier Grad Celsius. Nach einem kurzen Spülgang waschen Sie die Membran 30 Minuten lang. Danach führen Sie in TBST drei Spülgänge zu je 10 Minuten auf einem Rotations-Schüttler durch.

Die Membran 90 Minuten lang auf dem Schüttler bei Raumtemperatur in einer mit Blockierungslösung verdünnten, mit HRP konjugierten sekundären Antikörperlösung inkubieren, wobei das Verdünnungsverhältnis 1 zu 10.000 beträgt. In diesem Protokoll verwenden wir einen Schaf-anti-US-Antikörper. Spülen Sie die Membran anschließend erneut 30 Minuten lang in TBST aus, beginnend mit einem kurzen Spülgang, gefolgt von drei zehnminütigen Spülgängen auf einem Rotationsschüttler.

Nach dem letzten Spülschritt die Membran fünf Minuten lang in frisch zubereiteten, unverdünnten Super Signal West Pico ECL-Reagenzien inkubieren. Die Membran auf dem Schüttler bei hoher U/min-Zahl entnehmen und überschüssiges Reagenz abtropfen lassen. Mit fusselfreiem Filterpapier oder Kim-Tüchern die Membran zwischen Kunststoff-Schutzfolien in eine Filmkassette legen und zusätzliches Super Signal-Reagenz mit fusselfreien Kim-Tüchern abtupfen.

Falls erforderlich, Kodak Biomax MR-Film in Intervallen von 30 Sekunden bis zu 30 Minuten belichten und in einem Filmentwickler entwickeln. Nach fünf Minuten sind die A-Beta-Monomerbänder in diesem Experiment wahrscheinlich gesättigt. Klargestellte Homogenate, die 50 Mikrogramm Gesamtprotein von sieben menschlichen Probanden enthielten, wurden auf das Vorhandensein multimerer Beta-Amyloid- oder A-Beta- und Amyloid-Vorläuferproteine bzw. APP, dem transmembranen Protein, aus dem das A-Beta-Peptid gespalten wird, untersucht.

Hier zeigen wir repräsentative Bilder aus einem A-beta-a-PP-Western-Blot-Experiment mit 30 Minuten und fünf Minuten Belichtungszeit. Eine 30-minütige Belichtung ermöglicht die Sichtbarmachung der deutlich schwächeren Dimer-, Trimer-, Tetramer- und höhermolekularen oder Liganden-Banden von Abeta, führt jedoch zu einer Überbelichtung der anderen Lanes bei einer Belichtungszeit von fünf Minuten. Die gleiche Tetramer-Bande ist vorhanden, jedoch schwach, sodass die anderen Lanes deutlich sichtbar sind.

Kortikale Homogenate von Probanden mit Alzheimer-Krankheit oder AD sind in den Bahnen eins bis drei zu sehen, ein menschlicher Proband mit der Diagnose Demenz mit Lewy-Körperchen oder DLB und Alzheimer-Krankheit ist in Bahn vier zu sehen, Fälle von Demenz mit Lewy-Körperchen sind in Bahn fünf und sechs zu sehen und ein alter Mensch ohne Demenz als Kontrollfall. In Bahn sieben zeigte die Immunblotting mit dem Antikörper 6C10 Aβ-Monomere, -Dimere, -Trimere, -Tetramere und APP in allen Alzheimer-Fällen sowie reichlich vorhandene Aβ-Aggregate mit höherem Molekulargewicht in zwei AD-Fällen, was auf die Heterogenität der Aβ-Aggregation zwischen menschlichen Probanden hinweist.

Ein Beta 40 in der rechten Spur bestätigt die Identität der Banden mit niedrigerem Molekulargewicht. Wir haben Ihnen soeben ein SDS-Seiten-Western-Blot-Experiment gezeigt, mit dem Aβ-Multimere in nicht fixierten Gewebshomogenaten aus den Gehirnen von Menschen mit neurodegenerativen Erkrankungen identifiziert werden können. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, hochkonzentrierte kortikale Homogenate für die Trennung mittels Gelelektrophorese vorzubereiten, um Aβ-Multimere mit geringer Abundanz sichtbar zu machen.

Es ist außerdem wichtig, vor dem Immunoblotting mit einem Antikörper gegen das Abeta-Peptid eine hitzeinduzierte Antigen-Epitop-Aufbereitung durchzuführen. Die Antigen-Aufbereitung hilft dabei, verdeckte Abeta-Epitope freizulegen, um eine optimale Antikörperbindung während des Immunoblottings zu ermöglichen. Jeder Dampfgarer, Mikrowelle oder Wasserbad, das 100 Grad Celsius hält, ist geeignet.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.