Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis
15. Juni 2010
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion des Übersetzens Ribosomen aus eukaryotischen Zellen. Sobald extrahiert, Ribosomen in monosomes und Polyribosomen durch Saccharose-Gradienten Fraktionierung getrennt, um verschiedene ribosomale Populationen analysiert werden. Als solche ist diese Methode der Goldstandard für die Untersuchung der Regulation der Translation.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Mono- und Polyribosomen-Fraktionen aus Zelllysaten zu trennen und zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Zellen der gewünschten Art kultiviert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Herstellung des Zelllysats.
Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Lysat durch einen Saccharose-Gradienten zu zentrifugieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Fraktionierung des Gradienten und die Visualisierung der verschiedenen ribosomalen Populationen mittels einer UV-Messkurve. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Veränderungen der Translation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen durch die Analyse von Polyribosomen-Profilen zeigen.
Hallo, ich bin Anthony Esposito aus dem Labor von Dr. Terry Goss Kinsey in der Abteilung für Molekulargenetik, Mikrobiologie und Immunologie an der UMD und der J Robert Wood Johnson Medical School. Und ich bin Marcus Lewis, ebenfalls aus dem McKinsey-Labor hier an der R-W-J-M-S.
Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Polyribosomenanalyse. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Veränderungen der Proteinsynthese zu untersuchen, die durch Mutationen oder Umweltfaktoren entstehen. Beginnen wir. Saccharose.
Die Gradienten sollten einen Tag vor der Verwendung hergestellt werden, damit sie kontinuierlich werden können. Mischen Sie die entsprechenden Volumina der 7 %igen und 47 %igen Saccharoselösungen, um jeweils 48 Milliliter der folgenden Saccharosekonzentrationen herzustellen: 7 %, 17 %, 27 %, 37 % und 47 %. Geben Sie Einmolar DTT zu jeder Saccharoselösung, um eine Endkonzentration von einem Millimolar zu erreichen. Um die Gradienten aufzutragen, befestigen Sie eine Pastapipette an einer 20-Milliliter-Spritze, indem Sie sie mit Parafilm fixieren und abdichten.
Geben Sie sieben Milliliter 7%iger Saccharose in den Boden eines einen Zoll mal 3,5 Zoll großen Polyamid-Ultrazentrifugenrohrs. Fügen Sie anschließend sieben Milliliter 17%ige Saccharoselösung unter die 7%ige Lösung hinzu, indem Sie die Pipettenspitze nahe am Boden des Rohrs platzieren und langsam pipettieren. Das Einfüllen jeder Schicht sollte nicht weniger als 20 Sekunden dauern.
Wiederholen Sie den Vorgang mit jeweils sieben Milliliter 27 %, 37 % und 47 %iger Saccharoselösungen, nachdem das Gradientenrohr gebohrt wurde. Sie sollten klare Trennlinien zwischen den Schichten erkennen, was auf eine minimale Durchmischung hinweist. Lagern Sie alle Gradienten sowie die Rotoren, Flaschen und Röhrchen, die zur Probengewinnung verwendet werden, über Nacht bei vier Grad Celsius.
Um Extrakte aus Hefe-Zellen herzustellen, beginnen Sie mit dem Anzüchten von hundert 25-Milliliter-Kulturen bis zu einem OD 600 von 0,8 bis 1. Geben Sie Cyclohecid zur Kultur, um eine Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen, und schütteln Sie weitere 15 Minuten bei 30 Grad Celsius. Nach 15 Minuten gießen Sie die Kultur in eine 250-Milliliter-Zentrifugenflasche und füllen diese mit Eis auf.
Ab diesem Zeitpunkt alles auf Eis halten, Zentrifugation bei 8.000 ×g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter eiskaltem Lysepuffer und überführen Sie es in 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen. Zentrifugation bei 5.900 ×g für drei Minuten bei vier Grad Celsius, Resuspendieren.
Suspendieren Sie das Pellet in 0,5 Milliliter Lysepuffer. Überführen Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie dann 0,5 Milliliter gekühlte, gebackene, säuregewaschene Glasperlen hinzu. Vortexen Sie die Zellen in vier Intervallen zu je 32 Sekunden mit einer Abkühlung des Röhrchens auf Eis für 30 Sekunden zwischen jedem Intervall.
Fügen Sie dann weitere 0,5 Milliliter Lysepuffer in das 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzu und zentrifugieren Sie es bei 5.000 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Überführen Sie das Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es bei maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Überführen Sie schließlich das Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Der Extrakt kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, um das Lysat auf die Saccharose-Dichtegradienten aufzutragen. Halten Sie die Pipettenspitze an die Röhrenwand nahe der Oberfläche des Gradienten und schichten Sie das Lysat vorsichtig auf den Gradienten auf.
Für einen 35-Milliliter-Gradienten werden typischerweise 500 Mikroliter Lysat aufgetragen. Mit einer Pinzette den Gradienten vorsichtig in den Rotorbehälter eines Schwenkrotors absenken. Die Gradienten bei 100.000 × g für vier Stunden bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Etwa 30 Minuten vor Abschluss der vierstündigen Zentrifugation. Befestigen Sie die Nadel am Schlauchstecher und das Schreibgerät am Online-Absorptions-Fluoreszenzmonitor. Schalten Sie die Stromversorgung für den Absorptionsmonitor ein, um vor der Analyse der Proben eine stabile Grundlinie zu erreichen.
Die elektronische Erfassung des PolyZone-Profils kann einfach in Echtzeit durch Anschließen einer DI 1 48 U Datenerfassungseinheit erhalten werden. Füllen Sie die Spritzenpumpe mit 50 Milliliter Florinnüsse unter Verwendung der schnellen Rücklauf-Einstellung am Schreibgerät. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
Verbinden Sie den Schlauch der Spritze mit dem Tubusstecher. Schalten Sie kurzzeitig den Durchfluss von Flo-Inert in Vorwärtsrichtung mit sechs Millilitern pro Minute ein, um den Schlauch von eventuellen Luftblasen zu befreien. Platzieren Sie eine Reihe von Röhrchen unter dem Schlauch am Ende der Durchflusszelle, um das überschüssige Probenmaterial aufzufangen.
Bereiten Sie einen Eiskübel mit einer vorgeformten Vertiefung zur Aufnahme des Zentrifugenröhrchens mit dem Saccharosegradienten vor. Sobald die vierstündige Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Zentrifugenröhrchen vorsichtig aus dem Zentrifugenrotor und stellen Sie sie auf Eis, wobei Sie sicherstellen, dass die Gradienten nicht gestört werden.
Um Zelllysate zu analysieren, setzen Sie die Gradientenröhre auf den Röhrendurchstecher und verbinden das obere Ende der Röhre mit dem Auslass und sichern es. Heben Sie die untere Stufe an die Zentrifugenröhre an, sodass die Nadel das untere Ende der Röhre durchsticht. Starten Sie den Durchfluss von Florin alert in Vorwärtsrichtung mit sechs Milliliter pro Minute.
Sobald die Flüssigkeit beginnt, in das Röhrchen zu fließen, überwachen Sie die Bewegung der Nadel am Online-UV-Absorptionsmonitor. Sobald die Nadel sich zu bewegen beginnt, schalten Sie die Chart-Bewegung auf eine Geschwindigkeitseinstellung von 60 ein. Wenn das Ende des Poly-Ribosomen-Profils erreicht ist, schalten Sie den Durchfluss von Flo inert zum Zentrifugenröhrchen aus und stoppen Sie die Chart-Bewegung am Absorptions-Fluoreszenzmonitor.
Ziehen Sie das Flo-Inert mit einer schnellen Rückwärtsströmung aus dem Zentrifugenröhrchen in die Spritze zurück, wobei darauf geachtet werden muss, dass kein Saccharose aus dem Röhrchen in die Spritze aufgenommen wird. Schrauben Sie das Zentrifugenröhrchen von der Röhrchenstechvorrichtung ab, senken Sie die Nadel ab und nehmen Sie das Röhrchen heraus. Hier ist eine repräsentative Aufzeichnung eines Ribosomen-Extrakts dargestellt, der aus Hefe in Gegenwart von Cyclohecid hergestellt wurde.
Es sind UV-Absorptionspeaks angegeben, die Polyribosomen sowie A TS 60 S- und 40 S-Ribosomen enthalten. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man eine Polyribosomenanalyse durchführt. Bei dieser Methode ist es wichtig, schnell zu arbeiten, die Proben kalt zu halten und die RNA frei von Kontaminationen zu halten.
Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Isolierung translatierender Ribosomen aus eukaryotischen Zellen, das die Analyse verschiedener ribosomaler Populationen ermöglicht. Die Methode beinhaltet die Trennung von Ribosomen in Monosomen und Polyribosomen mittels Fraktionierung in einem Saccharosegradienten, was für die Untersuchung der Translationsregulation unerlässlich ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Das Verständnis der Ribosomenfunktion ist entscheidend für die Untersuchung der Proteinsynthese.
- Die Polyribosomen-Profilierung liefert Einblicke in die Regulation der Translation.
- Die Extraktion von Ribosomen ist eine grundlegende Methode in der molekularbiologischen Forschung.
- Umweltfaktoren und Mutationen können die Proteinsynthese verändern.
Zweck der Studie
- Trennung und Vergleich von Mono- und Polyribosomen-Fraktionen aus Zelllysaten.
- Sichtbarmachung unterschiedlicher ribosomaler Populationen mittels UV-Tracing.
- Analyse von Veränderungen der Translation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
Verwendete Methoden
- Kultivierung eukaryotischer Zellen und Herstellung von Zelllysaten.
- Zentrifugation durch einen Saccharose-Gradienten.
- Fraktionierung des Gradienten zur Isolierung ribosomaler Populationen.
- Sichtbarmachung ribosomaler Profile mittels UV-Absorptionsmessung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Trennung von Monosomen und Polyribosomen.
- Klare Visualisierung ribosomaler Populationen mittels UV-Tracing.
- Analysen der Translationsregulation unter verschiedenen Bedingungen.
- Erkenntnisse über die Auswirkungen von Mutationen auf die Proteinsynthese.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ist ein Goldstandard zur Untersuchung der Translationsregulation.
- Es ermöglicht Forschern, die Ribosomendynamik effektiv zu analysieren.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Translation bei.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Die Analyse des Polyribosomenprofils ermöglicht es Biopharma-Teams, translationsregulatorische Mechanismen zu untersuchen und Defekte in der Proteinsynthese an kritischen Entscheidungspunkten der Forschung zu erkennen. Diese Methode liefert quantitative Einblicke in die globale und transkriptspezifische Translation und unterstützt eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Zielvalidierung sowie die Minimierung mechanistischer Risiken. Ihre Anpassungsfähigkeit an verschiedene eukaryotische Systeme gewährleistet eine breite Relevanz für Portfolios in der frühen Forschung und Entwicklung sowie in der translationellen Forschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Beurteilung der translationalen Regulation unter genetischen oder umweltbedingten Störungen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem Defekte in der Initiation von jenen in der Elongation/Termination unterschieden werden.
- Erleichtert die funktionelle Target-Validierung durch Quantifizierung von Veränderungen in den Polyribosom-zu-Monosom-Verhältnissen.
- Bietet eine Plattform zur Bewertung des Einflusses von kandidatenbasierten Interventionen auf die Proteinsynthese.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte, quantitative Messwerte der Ribosomenbindung für die Assay-Standardisierung.
- Ermöglicht reproduzierbare Fraktionierung und UV-basierte Detektion von Ribosomenpopulationen.
- Bereitet biologische Extrakte auf, die für nachgeschaltete mRNA- oder Proteinanalysen geeignet sind.
- Ermöglicht das Screening von Substanzen, die die Translationsmaschinerie oder regulatorische Signalwege modulieren.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft die Entdeckung translationsbezogener Biomarker mit mechanistischen Erkenntnissen zur Regulation der Proteinsynthese.
- Stellt die Kontinuität von zellulären Modellen zu präklinischen Systemen sicher, indem Protokolle über eukaryotische Arten hinweg angepasst werden.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem translationsbedingte Defekte aufgedeckt werden, die mit Krankheitsmodellen assoziiert sind.
- Liefert einen mechanistischen Kontext für beobachtete Phänotypen in präklinischen Studien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Polyribosomen-Profiling ist in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase integriert, indem es eine hypothesengeleitete Untersuchung der Translation ermöglicht und sowohl die Zielvalidierung als auch die Identifizierung von Leitstrukturen unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Quantifiziert die translationale Produktion und verdeutlicht spezifische Regulationsmechanismen einzelner Signalwege.
- Screening: Bietet robuste, quantitative Fraktionierung und UV-Absorptionsmessungen zur Bereitschaft für Assays.
- Analytik: Ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung ribosomaler Populationen für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Verbindet zelluläre und präklinische Modelle, indem sie die Anpassung von Protokollen und die Abstimmung von Biomarkern ermöglicht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform für vielfältige translationale und mechanistische Studien über verschiedene F&E-Programme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in Studien zur translationalen Kontrolle.
- Operationaler Wert: Standardisiert Extraktions-, Fraktionierungs- und Nachweisabläufe hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem translationale Engpässe aufgedeckt und eine kapitaleffiziente Portfolio-Priorisierung ermöglicht wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen und Modellen basierend auf der Übereinstimmung der Translation.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Ribosomenbiologie und Gradientenfraktionierungstechniken.
- Benötigt Zugang zu Ultrazentrifugation und UV-Absorptionsmessgeräten.
- Erfordert strikte Standardisierung zwischen den Arbeitsgruppen für reproduzierbare Ergebnisse.
- Anpassbar an Hefe- und Säugerzellensysteme mit gegebenenfalls modifizierten Protokollen.
- Die Probeneinheit und RNase-freie Bedingungen sind entscheidend für zuverlässige Ergebnisse.
