Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Monozonen- und Poly-Ribosomenfraktionen von Zelllysaten zu trennen und zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zuerst die interessierenden Zellen kultiviert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Zelllysat herzustellen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Lysat durch einen Saccharosegradienten zu zentrifugieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Gradienten zu fraktionieren und die verschiedenen ribosomalen Populationen durch eine UV-Spur sichtbar zu machen. Letztendlich können durch die Analyse des Poly-Ribosomenprofils Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen in der Translation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zeigen.

Hallo, ich bin Anthony Esposito aus dem Labor von Dr. Terry Goss Kinsey in der Abteilung für Molekulargenetik, Mikrobiologie und Immunologie an der UMD und der J Robert Wood Johnson Medical School. Und ich bin Marcus Lewis. Auch vom McKinsey Lab hier bei R-W-J-M-S.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Poly-Ribosomen-Analyse. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Veränderungen und Proteinsynthesen zu untersuchen, die durch Mutationen oder Umweltfaktoren entstehen. Also lasst uns loslegen. Saccharose.

Gradienten sollten einen Tag vor der Verwendung vorbereitet werden, damit die Gradienten kontinuierlich werden. Mischen Sie die entsprechenden Volumina von 7%- und 47%Saccharose-Stammlösungen, um 48 Milliliter jeder der folgenden Saccharosekonzentrationen herzustellen: 7%17%27%37% und 47%Fügen Sie jeder Saccharoselösung ein molares DTT bis zu einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzu. Um die Farbgradienten zu gießen, befestigen Sie eine Nudelpipette an einer 20-Milliliter-Spritze, indem Sie sie mit Para-Folie sichern und versiegeln.

Geben Sie sieben Milliliter 7%ige Saccharose auf den Boden eines 1 Zoll x 3,5 Zoll großen Poly-Aamer Ultra-Zentrifugenröhrchens. Geben Sie als Nächstes sieben Milliliter 17%ige Saccharoselösung unter die 7%ige Lösung, indem Sie die Spitze der Nudelpipette langsam in die Nähe des Bodens der Röhrchenpipette legen. Es sollte nicht weniger als 20 Sekunden dauern, um jede Schicht zu gießen.

Wiederholen Sie dies mit je sieben Millilitern 27 %, 37 % und 47 % Saccharoselösungen, wenn der Gradient gebohrt wurde. Sie sollten klare Linien zwischen den Schichten beobachten, die darauf hinweisen, dass nur eine minimale Vermischung stattgefunden hat. Lagern Sie alle Gradienten von vier Grad Celsius über Nacht, zusammen mit den Rotoren, Flaschen und Röhrchen, die für die Probenentnahme verwendet werden.

Um Extrakte aus Hefezellen herzustellen, beginnen Sie damit, hundert 25 Milliliter Hefekultur auf einen OD 600 von 0,8 bis eins zu züchten. Geben Sie Cycloheide bis zu einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter in die Kultur und schütteln Sie sie 15 Minuten lang bei 30 Grad Celsius weiter. Nach 15 Minuten die Kultur in eine 250 Milliliter Zentrifugenflasche füllen und mit Eis auffüllen.

Halten Sie von diesem Zeitpunkt an alles auf Eis: Zentrifugieren Sie bei 8.000-facher Schwerkraft für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Reanimation, das Pellet in 10 Milliliter Eis suspendieren, kalt lyseieren, puffern und in 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen überführen. Zentrifugieren Sie bei 5.900-facher Schwerkraft für drei Minuten mit vier Grad Celsius Resus.

Suspendieren Sie das Pellet in 0,5 Millilitern Lysepuffer. Übertragen Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrofurchenröhrchen und fügen Sie dann 0,5 Milliliter gekühlte, gebackene, mit Säure gewaschene Glasperlen hinzu. Wirbeln Sie die Zellen für vier 32. Intervalle und rufen Sie die Röhre zwischen jedem Intervall 30 Sekunden lang auf Eis.

Geben Sie dann weitere 0,5 Milliliter Lysepuffer in die 1,5-Milliliter-Röhrchenzentrifuge in 5.000 Mal. Fünf Minuten Schwerkraft bei vier Grad Celsius. Den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Übertragen Sie zuletzt das Supinat in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentriröhrchen. Der Extrakt kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, um das Lysat auf den Saccharosegradienten zu übertragen. Legen Sie die Spitze der Pipette an die Wand des Röhrchens nahe der Oberfläche des Gradienten und schichten Sie das Lysat vorsichtig auf den Gradienten.

Für einen Gradienten von 35 Millilitern werden typischerweise 500 Mikroliter Lysat geladen. Senken Sie das Gefälle vorsichtig mit einer Pinzette in die Schaufel eines schwingenden Schaufelrotors ab. Zentrifugieren Sie die Gradienten bei der 100.000-fachen Schwerkraft vier Stunden lang bei vier Grad Celsius.

Etwa 30 Minuten vor Abschluss der vierstündigen Drehung. Befestigen Sie die Nadel am Tubendurchstecher und befestigen Sie den Pen an dem Online-Absorptionsfluoreszenzmonitor. Schalten Sie den Absorptionsmonitor ein, damit vor der Analyse der Proben eine stabile Ausgangsbasis erreicht werden kann.

elektronische Erfassung des PolyZone-Profils kann einfach in Echtzeit durch den Anschluss einer Datenerfassungseinheit DI 1 48 U erfolgen. Zum Diagrammschreiber, füllen Sie die Spritzenpumpe mit 50 Millilitern Florinnüssen in der Schnelleinstellung mit umgekehrtem Durchfluss. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.

Verbinden Sie den Schlauch von der Spritze mit dem Schlaucheinstecher. Und schalten Sie den Durchfluss von Flo inert bei sechs Millilitern pro Minute in Vorwärtsrichtung kurz ein. Um den Schlauch von Luftblasen zu befreien, legen Sie eine Reihe von Schläuchen unter den Schlauch am Ende der Durchflusszelle, um den Probenabfluss aufzufangen.

Bereiten Sie einen Eiskübel mit einer vorgeformten Vertiefung vor, in dem das Zentrifugenröhrchen mit dem Saccharosegradienten gehalten wird. Wenn die vierstündige Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Zentrifugenröhrchen vorsichtig vom Zentrifugenrotor und legen Sie sie auf Eis. Achten Sie darauf, die Steigungen nicht zu stören.

Um Zellextrakte zu analysieren, setzen Sie das Gradientenrohr auf den Röhrchenstecher und verbinden Sie die Oberseite des Röhrchens mit dem Auslass und sichern Sie es. Heben Sie die untere Stufe zum Zentrifugenröhrchen an, so dass die Nadel den Boden des Röhrchens durchbohrt. Beginnen Sie den Fluss des Florin-Alarms in Vorwärtsrichtung bei sechs Millilitern pro Minute.

Sobald die Flut in das Rohr zu fließen begonnen hat, überwachen Sie die Bewegung der Nadel auf dem Online-UV-Absorptionsmonitor. Sobald sich die Nadel zu bewegen beginnt, schalten Sie die Chartbewegung auf eine Geschwindigkeitseinstellung von 60 ein. Wenn das Ende des Poly-Ribosomenprofils erreicht ist, schalten Sie den Fluss von Flo inert zum Zentrifugenröhrchen aus und stoppen Sie die Bewegung des Diagramms am Absorptionsfluoreszenzmonitor.

Ziehen Sie das Flo inert aus dem Zentrifugenröhrchen in die Spritze zurück, indem Sie den Fluss in umgekehrter Richtung mit hoher Geschwindigkeit beginnen und darauf achten, dass keine Saccharose aus dem Röhrchen in die Spritze gezogen wird. Schrauben Sie das Zentrifugenröhrchen vom Röhrchenstecher ab, senken Sie die Nadel ab und entfernen Sie das Röhrchen. Eine repräsentative Spur eines Ribosomenextrakts, der aus Hefe in Gegenwart von Cycloheide hergestellt wurde, ist hier dargestellt.

UV-Absorptionspeaks, die Polyribosomen und A TS 60 s und 40 s Ribosomen enthalten, sind indiziert. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie eine Poly-Ribosomen-Analyse durchführen Wenn Sie dieses Verfahren durchführen. Es ist wichtig, daran zu denken, schnell zu arbeiten und die Proben kalt und RNAs frei zu halten.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.