Drosophila Burrowing and Tunneling Assay: Eine Methode zur Beurteilung der Gewebehypoxie bei Fliegenlarven

- Um den Käfig zur Embryoentnahme einzurichten, verwenden Sie Traubensaft-Agar-Platten, die mit frischer Hefepaste ergänzt sind, und setzen Sie die Platten auf Käfige mit männlichen und weiblichen Drosophila-Fliegen des entsprechenden Genotyps. Der Geruch der Hefe und des Traubensaftes ist attraktiv und fördert die Eiablage durch die Weibchen. Lassen Sie die Eiablage für einen bestimmten Zeitraum zu. Entfernen Sie dann die erwachsenen Tiere und inkubieren Sie die Embryoplatten 24 Stunden lang, um die ersten Larven im Stadium zu erhalten. Übertragen Sie dann vorsichtig ein paar einzelne Larven von der Traubensaftplatte auf eine reine Agar-Testplatte, bei der ein Loch in der Mitte der Platte in den Agar ausgeschnitten und mit Hefepaste gefüllt wurde.

Junge Larven müssen fressen, um an Körpergewicht zuzunehmen, um sich zu entwickeln, also graben sie sich in die Nahrungsquelle, die Hefepaste, ein. Während ihrer Entwicklung treten die Larven in eine Wanderphase ein und tunneln sich von der Nahrung weg, um einen Ort für die Verpuppung zu suchen. Um die Hypoxie zu beurteilen, untersuchen Sie die Tunnelmuster, die die Larven im Substrat bilden. Fehlender oder unzureichender Tunnelbau ist ein Zeichen für Sauerstoffmangel. Im Beispielprotokoll sehen wir, wie der Burrowing- und Tunneling-Assay eingerichtet wird.

- Richten Sie die Kontroll- und experimentellen genetischen Kreuzungen in Eiablageschalen ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Halte die Fliegen mindestens zwei Tage lang im Dunkeln, bevor du mit dem zeitgesteuerten Sammeln von Eiern beginnst. Für eine zeitgesteuerte Eierentnahme setzen Sie die Erwachsenen früh am Tag auf neue Trauben-Agar-Platten um, die mit einem frischen Abstrich Hefepaste dekoriert sind, und lassen Sie die Erwachsenen vier Stunden lang Eier auf die Teller legen. Nach vier Stunden die erwachsenen Tiere auf frische Trauben-Agar-Platten umfüllen.

Inkubieren Sie anschließend die vierstündigen Sammelplatten über Nacht bei 25 Grad Celsius. Bis zum nächsten Nachmittag werden die meisten Larven geschlüpft sein. Planen Sie mindestens 50 für jede Versuchsgruppe ein.

Bereiten Sie für einen einzigen Durchlauf des Assays mindestens fünf Assay-Platten pro Versuchsgruppe vor. Fügen Sie 16 Gramm Flugagar in 700 Milliliter entionisiertes Wasser durch Erhitzen hinzu. Bereiten Sie 17,5 Milliliter Nipagen in 95% Ethanol vor. Erhitzen Sie die Agarlösung, bis sie sich fast vollständig aufgelöst hat. Geben Sie dann Nipagen-Lösung zur Agar-Lösung und erhitzen Sie, bis sich das Agar vollständig aufgelöst hat. Kühlen Sie die Agarlösung kurz ab, dann beladen Sie 10 Zentimeter große Platten mit 15 Millilitern der Agarlösung. Sobald das Agar geliert, legen Sie die Deckel auf die Platten und lassen Sie sie einige Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.

Ausgehärteter Agar muss sich fest anfühlen und nicht zerbröckeln, wenn Stücke herausgeschnitten werden. Sobald das Agar ausgehärtet ist, verwenden Sie einen 1,5 Zentimeter großen Korkbohrer, um ein zentrales Loch in das Agargel in jeder Platte zu bohren. Dann die Löcher ordentlich mit frischer Hefepaste füllen.

Um die Larven auf die Testplatte zu übertragen, stellen Sie ein einfaches Werkzeug her. Biege eine Kurve in die Spitze eines Plastik-Mikrospatels und tauche die Spitze in Hefepaste, damit sie an den Larven haftet. Nehmen Sie nun die ersten Larven des Stadiums einzeln auf und legen Sie sie auf die Agarplatte in der Nähe des Futterhügels. Für jede Versuchsgruppe sind mindestens fünf Platten mit je 10 Larven vorzubereiten.

Um die Reproduzierbarkeit zwischen den Assay-Replikaten zu gewährleisten, ist es wichtig, dass nur 10 Larven auf jeder Assay-Platte platziert werden. Achten Sie darauf, die Testplatte sorgfältig zu überprüfen, um festzustellen, dass jedes Mal, wenn Sie eine Larve mit der Mikrospatelspitze abgeben, nur eine Larve übertragen wird.

Sobald die Platte beladen ist, beschriften Sie sie, decken Sie sie ab und legen Sie sie dann mit dem Deckel nach oben bei Raumtemperatur in die Dunkelheit. Untersuchen Sie jeden Teller täglich, bis alle Larven abgestorben oder verpuppt sind. Im Folgenden finden Sie Beispiele für Platten für einen Wildtyp-Stamm vom zweiten bis zum achten Tag des Assays. Am zweiten Tag werden die Larven in der Nahrung vergraben und es findet kein Tunnelbau statt. Der Tunnelbau beginnt am dritten Tag und erreicht sein Maximum zwischen dem fünften und achten Tag, wenn die Larven aufhören zu wandern und sich in ihren Tunneln verpuppen.

Übertragen Sie die Puppen vorsichtig mit einer gebogenen Nadel auf eine Traubenplatte und zählen Sie, falls gewünscht, wie viele Puppen sich befinden. Achten Sie auf die Puppenbildung und untersuchen Sie die Puppen auf Anomalien.