Montage von adulten Drosophila-Gehirnen: Eine Methode zur Vorbereitung von Objektträgern für die konfokale Bildgebung

- Kleben Sie auf einen positiv geladenen Objektträger zwei Deckgläser mit genügend Abstand zueinander, um Platz für die Montage der Drosophila-Gehirne zu schaffen. Pipettieren Sie unter dem Stereomikroskop die Gehirne in Eindeckmedium in diesen Raum. Die negative Ladung des Gewebes hilft dem Gehirn, an der positiven Ladung auf der Oberfläche des Objektträgers zu haften.

Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium, um eine präzise Positionierung des Gehirns auf dem Objektträger in einem Gittermuster mit den Antennenlappen nach oben zu ermöglichen, und überbrücken Sie dann die beiden Deckgläser, indem Sie ein drittes Deckglas quer kleben, um das Gehirn abzudecken.

Um den Hohlraum zu füllen, geben Sie das Eindeckmittel tropfenweise in den Rand des Hohlraums und lassen Sie es durch Kapillarbewegung ausbreiten, so dass es das Gehirn nicht stört.

Versiegeln Sie den Hohlraum mit Nagellack und lagern Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius im Dunkeln, um die Fluoreszenz von verschmutztem Gewebe zu erhalten.

Im Beispielprotokoll werden wir Drosophila-Gehirne für die konfokale Bildgebung von immungefärbten Neuronen mounten.

- Um das Gehirn zu besteigen, baue eine Brückenrutsche. Positionieren Sie zwei Bodenabdeckungen im Abstand von etwa einem Zentimeter auf einer positiv geladenen Rutsche. Stellen Sie sicher, dass die positiv geladene Seite nach oben zeigt. Kleben Sie dann die Deckgläser mit Fingernagellack auf die Folie und lassen Sie den Lack vollständig trocknen, bevor Sie fortfahren.

Legen Sie dann den Objektträger unter ein Stereomikroskop und pipettieren Sie die Gehirne in Medium in den Raum zwischen den Deckgläsern. Achten Sie darauf, die Beleuchtung anzupassen, um die Visualisierung des Gehirns zu verbessern.

Saugen Sie als Nächstes das zusätzliche Einbettmedium von der Rutsche ab und achten Sie darauf, das Gehirn zu vermeiden. Entfernen Sie dann die restlichen überschüssigen Einbettmedien. Dadurch können die Gehirne präziser positioniert werden. Richten Sie nun die Gehirne mit einer Pinzette in einem Gittermuster aus, wobei die Antennenlappen nach oben zeigen.

Lege dann einen Deckzettel über das Gehirn und versiegele mit Fingernagellack die Kanten des oberen Deckglases, die an den Basisabdeckfolien befestigt sind.

Beladen Sie nun den mittleren Hohlraum tropfenweise mit frischem Einbettmedium, so dass das Medium durch Kapillarwirkung unter den Deckglas gezogen werden kann. Wenn der Hohlraum gefüllt ist, versiegeln Sie ihn vollständig mit klarem Fingernagellack.