Vorbereitung, Entwicklung von peripheren olfaktorische Gewebe für Molekulare und immunhistochemische Analysen in Drosophila

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bühne und sezieren, olfaktorische Gewebe von Drosophila -Arten zu entwickeln. Das sezierte Gewebe kann später für Molekulare Analysen, wie quantitative RT-PCR (Reverse Transkription-Polymerase Chain Reaction) oder RNA Sequenzierung (RNAseq), sowie in-Vivo -Analysen wie Immunohistochemistry oder in Situ verwendet werden Hybridisierung.

Das übergeordnete Ziel der Stadieninszenierung und Dissektion von sich entwickelnden pupillen- und adulten peripheren Riechgeweben bei Drosophila-Arten besteht darin, Proben für molekulare und entwicklungsbezogene Analysen des peripheren Riechgewebes zu generieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklung und Evolution des olfaktorischen Systems zu beantworten, wie z.B. die Expressionsdynamik, das Niveau und die Muster spezifischer Gene in den sich entwickelnden peripheren Riechgeweben. Durch diese Methode können wir Einblicke in das sich entwickelnde periphere Geruchssystem bei Drosophila-Arten gewinnen.

Es kann auch auf andere sensorische Systeme angewendet werden, wie z. B. den peripheren Geschmack und das visuelle System. Planen Sie für ein RNA-Sequenzierungsexperiment, zwischen 100 und 200 Antennenscheiben oder Antennen für vier verschiedene Entwicklungsstadien zu sammeln. Für die Immunhistochemie planen Sie, 10 bis 20 Fliegen zu präparieren.

Reinigen Sie alle Materialien, die an der Dissektion beteiligt sind, mit 70 % Ethanol. Reinigen Sie dann die Materialien weiter mit RNase-Neutralisatoren. Und stellen Sie alle Lösungen mit nukleasefreiem oder DEPC-behandeltem Wasser her.

Um Puppen zu sammeln, überwachen Sie die Larven in Abständen von 30 Minuten. Und sammle Puppen in der APF-Vorbereitungsphase zur Stunde Null. Die Larven sind unbeweglich und von einer sehr hellen, fast weiß gefärbten Puppenhülle umgeben.

Setzen Sie die Larven zu diesem Zeitpunkt in eine kleine zwei Zoll große Petrischale mit einem feuchten Filterpapier um. Für Null-Stunden-Dissektionen im APF-Stadium fahren Sie sofort mit der Entnahme der präpupalen Antennenscheibe fort. Andernfalls decken Sie die Schale mit Paraffinfolie ab und lassen Sie die Tiere bei 25 Grad Celsius wachsen, bis sie sich in der interessierenden Entwicklungsphase befinden.

Um die Puppenentwicklung anderer Drosophila-Arten zu beobachten, sammeln Sie Null-Stunden-Präpuppenlarven und sortieren Sie sie in ein frisches Fläschchen. Notieren Sie dann die Anzahl der Tage von der Puppe bis zum Erwachsenenalter. Und skalieren Sie diese Zeit einfach auf die Zeitachse für Melanogaster.

Kühlen Sie zunächst 150 Mikroliter RNA-Isolierlösung in einem RNase-freien 1,5-Millimeter-Röhrchen. Als nächstes legen Sie mehrere separate Tröpfchen PBS auf das Sezierpad. Geben Sie in jeden Tropfen PBS eine Puppe, die präpariert werden soll.

Verwenden Sie für die null- bis zweistündigen Puppen eine Pinzette, um die Mundhaken zu greifen, und ziehen Sie an diesen Strukturen, um das Gehirn und die imaginalen Scheiben herauszureißen und freizulegen. Für die achtstündigen Puppen schälen Sie zuerst vorsichtig die Puppenhülle vom vordersten Viertel der Puppe, um den sich entwickelnden Kopf freizulegen. Lösen Sie dann den Kopf am Halsgelenk ab.

Die Antennenscheiben befinden sich in diesem Entwicklungsstadium im Kopf. Übertragen Sie nun das Gewebe, das die Antennenscheiben enthält, auf ein weiteres Tröpfchen PBS. Identifizieren Sie als Nächstes die Augenantennenscheibe, die an den Sehlappen mit dem Gehirn verbunden ist.

Trennen Sie mit einer Pinzette die Augenantennenscheibe und übertragen Sie sie auf ein neues Tröpfchen. Bei der achtstündigen Puppe umschließen die Augenscheiben die Antennenscheiben und beide befinden sich vor dem Gehirn. Im nächsten Tröpfchen teilst du das Auge und die Fühlerscheiben mit einer Pinzette.

Sammeln Sie dann mit einer P20-Pipettenspitze das präparierte Gewebe vorsichtig mit einer minimalen Menge Flüssigkeit. Legen Sie die Scheibe in das Reagenz der RNA-Isolationslösung und fahren Sie mit dem Präparieren der Antennenscheiben fort, bis mindestens 100 entnommen sind. 40 Stunden nach der Puppenbildung hat die adulte Antenne ihre endgültige Form angenommen, ist aber immer noch transparent.

Mindestens 50 Präpuppen werden in diesem Stadium für die RNA-Sequenzentnahme benötigt. Bereiten Sie zunächst 150 Mikroliter gekühlte RNA-Isolierlösung vor. Legen Sie auf das Sezierpad eine Puppe in ein Tröpfchen PBS.

Stabilisieren Sie dann den Körper mit einer Pinzette und ziehen Sie die Puppenhülle vorsichtig vom vordersten Viertel ab, um den Kopf freizulegen. Entfernen Sie dann vorsichtig den Kopf am Halsgelenk. Übertragen Sie nun den Kopf vorsichtig in ein sauberes Tröpfchen PBS.

Um die Membran um den Kopf herum zu entfernen, pipettieren Sie den Kopf im PBS auf und ab. Mit dieser Reinigung sollte die Antenne sichtbar werden. Trennen Sie nun die Antenne zwischen dem zweiten und dritten Segment an der Segmentfuge von der Membran

Das dritte Segment enthält die Geruchsrezeptoren der Antenne. Verwenden Sie dann eine Pipette, um das präparierte Gewebe vorsichtig in die RNA-Isolierlösung zu übertragen, um die übertragene Flüssigkeitsmenge zu minimieren. Für die RNA-Extraktion präparieren Sie Erwachsene, während sie auf einem CO2-Pad betäubt sind.

Behandeln Sie zunächst das CO2-Pad und die Pinzette mit RNase-Hemmern. Betäuben Sie dann die Erwachsenen und betrachten Sie das Pad unter einem Präpariermikroskop. Stabilisieren Sie den Körper mit zwei Pinzetten und ziehen oder kneifen Sie vorsichtig das dritte Antennensegment aus dem zweiten Antennensegment heraus, um das Gewebe zu sammeln.

Übertragen Sie die Antennen in ein Röhrchen mit RNA-Isolationslösung, indem Sie die Pinzette in die Flüssigkeit tauchen und loslassen. Die Antenne muss eingetaucht werden. Bleibt die Antenne an der Seitenwand hängen, wird die RNA vorzeitig abgebaut.

Nachdem Sie genügend Antennen gesammelt haben, fahren Sie mit der RNA-Extraktion fort. Oder lagern Sie das Sammelröhrchen unbegrenzt bei 80 Grad Celsius. Wenn die Antennen für die Immunhistochemie vorgesehen sind, führen Sie diese Dissektion auf einem Dissektionskissen durch, wobei die Fliege in PBS mit oder ohne Triton getaucht ist.

Das präparierte, sich entwickelnde olfaktorische Gewebe kann für die RNA-Extraktion verwendet werden, gefolgt von RT-PCR zur Beurteilung der Genexpression. Zum Beispiel kann auf diese Weise die Expression von Oberflächenrezeptortranskripten und Geruchsrezeptortranskripten untersucht werden. Alternativ können die Gewebe für die Immunhistochemie verwendet werden, um das Expressionsmuster und die subzelluläre Lokalisation von Genen von Interesse zu bestimmen.

So können beispielsweise transgene Rn-EGFP-Fliegen mit Anti-GFP- und Anti-Laminin-Antikörpern gefärbt werden. Die Analyse zeigt, dass 40 Stunden nach der Puppenbildung das Or67d-Gen in spezifischen Zellen in der Antenne aktiv ist und die Expression von GFP unter dem GAL4-UAS-System antreibt. Einmal gemeistert, können Dissektionen in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Zeit und eine entsprechend geplante Auswahl, Alterung und Präparierung einzuhalten, basierend auf dem Zeitrahmen für die Puppenentwicklung für jede Drosophila-Art. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie qRT-PCR, Immunhistochemie sowie andere in vivo Färbe- und Transkriptionsprofilierungstechniken durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu Mustern und Profilen der Transkription auf Systemebene innerhalb eines sich entwickelnden Gewebes zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Evolution und Entwicklung sensorischer Systeme ebnen, um die Transkriptionsdynamik und die Entdeckung neuer Gene in anderen sensorischen Systemen bei Drosophila-Arten zu erforschen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einer scharfen Pinzette, einigen RNA-Extraktionslösungen und Formaldehyd äußerst gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie vorheriges Üben mit Dissektionen, zur Entwicklung der Feinmotorik, hohe Aufmerksamkeit und das Tragen geeigneter Laborkleidung sollten bei der Durchführung dieses Eingriffs immer getroffen werden.