Encyclopedia of Experiments: Biology
Ein Abonnement für JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt ansehen zu können. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- For det første immunostain Drosophila larver med markører, der fremhæver forskellige aspekter af NMJs eller neuromuskulære vejkryds. Dette er den region, hvor afslutningen af en motor neuron axon kontakter en muskel, og dens morfologi bruges som en udlæsning af synaptisk funktion.
Axonen slutter i flere grene, der danner buler kaldet boutons. Neurotransmittere frigives fra boutons og forårsager muskelsammentrækning. Områder af neurotransmitter frigivelse kaldes aktive zoner. Her er en markør specifik for et synaptisk protein, der skitserer NMJ, og den anden markør er for et protein til stede i aktive zoner.
Derefter erhverveR NMJ-billeder ved hjælp af mikroskopi og vurderer kvantitativt deres morfologi med halvautomatisk billedanalysesoftware. Anvend en forudindstillet række softwarekommandoer på billederne. Outputfilerne indeholder analyserede NMJ-billeder og morfologiresultater. De funktioner, der kan måles, omfatter antal og overfladeareal af boutoner, NMJ-længde og grennummer, antal usammenhængende NMJ-rum og antal aktive zoner.
I følgende eksempel analyserer vi morfologien af Drosophila NMJs farvet med DLG1, en postsynaptisk markør og BRP, en aktiv zonemarkør.
- Til denne protokol skal du generere billedstakke af NMJs og gemme dem som individuelle TIFF-filer, hvor kanal 1 viser DLG1-farvning eller lignende markør, og kanal 2 viser BRP-farvning. For at begynde med skal du oprette Z-fremskrivninger og hyperstacks af NMJ-billedfilerne. Åbn plugin-indstillingerne og vælg Drosophila NMJometri morphcs.
Identificer nu den entydige filstreng, som mikroskopet har tildelt billedserien, når de gemmes som TIFF. Dette vil være i slutningen af billednavnet. Kopier og indsæt strengen, der er givet til det laveste plan- og kanalnummer, i det entydige filstrengindstillingsvindue. Vælg derefter undermakroen 'Konverter til stak' og vælg den mappe eller mappe, hvor billederne er placeret.
For hver billedfil laves to nye filer med standardnavnestakken og den flade stak efterfulgt af det oprindelige billednavn. De oprindelige filer kan derefter slettes for at spare lagerplads. Næste fra Drosophila NMJ-morfometrisk brugergrænseflade skal du vælge den definerede ROI-undermakro og vælge billedfilmappen.
Når den første projektion åbnes, skal du vælge værktøjet til frihåndsvalg og derefter bruge musen til at definere et område, der indeholder en komplet NMJ-terminal af interesse. Når den er valgt, skal du klikke på OK i det definerede terminalvindue. Fortsæt med at gøre dette, indtil NMJ-terminalerne er defineret i alle fremskrivningerne. Makroen fremmer processen automatisk.
For at kvantificere NMJ-funktionerne Først skal du gå til Drosophila NMJ morphometrics-grænsefladen og indstille skalaen. Hvis en pixel i billedet f.eks. svarer til 0,72 mikron, skal du indstille skaleringspixel til 1 og skalere afstand til 0,072. Vælg derefter undermakroen Analyser, og hvis der er to kanalbilleder, skal du også skifte Vent. Tryk på OK, og når du bliver bedt om det, skal du vælge billedfilmappen.
Efter analysen gemmes nye billedfiler for hver analyseret synapse i forældremappen, og de kvantitative målinger er i resultaterne.txt fil. Undersøg alle billederne, og udelad billeder med segmenteringsfejl.
For eksempel er dele af synaptisk terminal muligvis ikke inkluderet i den gule kontur. Dele af baggrunden kan være inkluderet i synaptisk terminal. En blå skeletlinje kan strække sig ud over synaptisk terminal. Der kan være for mange aktive zoner, eller nogle aktive zoner kan forblive uopdagede.
