Name: Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der Drosophila Larval Neuromuskuläre Junction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Analyse von Kernmorphologie bei Drosophila-Larven durch Konfokalmikroskopie und morphometrische Methoden. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung genetischer Einflüsse auf Größe, Form und Verteilung von Kernen in Skelettmuskeln.

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Wir danken Dr. Andrea Chai für ihre aufschlussreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde vom Wellcome Trust (Förderkennzeichen: Pennetta8920) und von der Motor Neuron Disease Association (Förderkennzeichen: Pennetta6231) unterstützt.

1. Experimentelle Vorbereitung Hinweis: Dissektionen und Immunhistochemie Verfahren in den Abschnitten 2 und 3 werden nach Referenzen durchgeführt 3-6, aber mit Modifikationen. <ol><li> Vorbereitung 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), und PBS enthaltend 0,1% Triton-X 100 (PBT). Halten Sie sie auf Eis. </li><li> Bereiten Sie Bouin-Fixiermittel (15 Pikrinsäure: 10 Formaldehyd: 1 Eisessig). Machen Sie dieses Reagenz frisch. </li><li> Wählen Sie sauber Edelstahl minutien Pins und einer feinen Pinzette. </li><li> Bereiten Sie Dissektion Platten eine Sylgard Scheibe in einer 5 cm Petrischale enthält. </li></ol> 2. Dissektion der im dritten Häutungsstadium Larval NMJs <ol><li> Pick-Wanderung im dritten Häutungsstadium Larven aus einem Fläschchen oder einer Flasche mit einem feinen Pinsel und legen Sie sie in eine 2 cm Petrischale mit 4 ° C PBS die restliche Nahrung weg zu waschen. </li><li> Legen Sie eine Larve auf der Oberseite der Sylgard Oberfläche der Dissektion Platte und stellen Sie sicher, dass es positi istoned mit seiner dorsalen Seite, so dass die beiden Längs Trachealtuben auf der Oberseite sichtbar sind. </li><li> die Zange Mit dem Stift, Pin die Larve nach unten an seinem vorderen Ende, direkt unter dem Mund Haken zu halten. Strecken Sie die Larve aus so viel wie möglich und Stift ihrem hinteren Ende nach unten. </li><li> Fügen Sie genug PBS Salz die Wände der Platte zu erreichen und tauchen vollständig die Larve. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.3 für andere Larven des gleichen Genotyps. Eine einzige 5 cm Petrischale Dissektion Platte kann bis zu 8 Larven leicht unterbringen. </li><li> Mit Hilfe der Mikro-Dissektion Schere leicht anheben, die dorsalen Kutikula und machen einen kleinen horizontalen Schnitt am hinteren Ende in der Nähe der Stift. </li><li> Legen einer Schere in den Einschnitt, schneiden Sie die Larve den ganzen Weg bis zum vorderen Ende entlang der Mittellinie zwischen den beiden Längsstriche der Trachea. Stellen Sie sicher, dass die Mittellinie schneidet oberflächlich genug, nur die Kutikula durchlaufen und zu vermeiden, durch die Muskeln Schneiden aufder Bauchseite. </li><li> An jedem Ende geschnitten, um zwei Kerben an der linken und der rechten Seite. </li><li> Öffnen des Kehl indem zwei Stifte auf beiden Seiten des vorderen Einschnitts. Wiederholen Sie das gleiche mit dem hinteren Ende. Wenn die Stifte platzieren, stellen Sie sicher auseinander, um die Körperwand zu verbreiten. </li><li> Reinigen Sie die inneren Organe mit einer Pinzette und PBS Salzlösung. Lassen Sie das zentrale Nervensystem intakt. dehnen Sie vorsichtig die Larve mit Eckpunkten, bis sie vollständig gestreckt wird, aber stellen Sie sicher, dass die Muskeln nicht während dieses Prozesses zerrissen. </li><li> Wiederholen Sie die gleiche Präparation Vorgang für die andere Larven auf der gleichen Präparation Platte. </li><li> Waschen mit PBS Salzlösung dreimal alle inneren Organe zu entfernen. </li><li> Ersetzen Sie die PBS mit Bouin-Fixiermittel und lassen für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie mehrmals mit PBT. </li><li> Entfernen Sie die Stifte sorgfältig und übertragen alle Vorbereitungen, die jetzt ziemlich starr sind, in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für Immunfärbung.</li></ol> 3. immunhistochemischen Anfärbung von Drosophila NMJs mit spezifischen Antikörpern für Muskeln und myonuclei <ol><li> Schnell die Larven Filets in PBT spülen. </li><li> Blockieren Sie die Vorbereitungen mit 10% normalem Ziegenserum inkubiert (NGS) in PBT für 2 Stunden unter ständigem Rühren. </li><li> Inkubieren eines Satzes von sezierten NMJs in PBT 5% NGS und ein Kaninchen-anti-lamin-Antikörper (bei einer Konzentration von 1: 500) enthält, und mit einem Meerschweinchen anti-DVAP Antikörper (bei einer Konzentration von 1: 500) für 2 Std bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ºC. Die Anti-DVAP Antikörper färbt die quergestreifte Muskulatur, während die anti-Lamin Färbung der Kontur des myonuclei erkennt. </li><li> Waschen Sie einmal schnell in PBT, die Antikörper im Überschuss zu entfernen. 2 h in PBT Waschen durch die PBT-Puffer alle 15 min zu ändern. </li><li> Inkubieren der Proben in PBT 5% NGS und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper bei 1 enthält: 500-Verdünnung für 2 h bei Raumtemperatur. Die gleichen Proben ceine unterzogen werden, mit mehreren Antikörpern gegen Färbung zur gleichen Zeit, wenn Sekundärantikörper konjugiert ist mit unterschiedlichen Chromophoren verwendet werden. </li><li> Entfernen Sekundärantikörper und waschen in PBT für 2 Stunden durch die PBT alle 15 min Puffer zu ändern. </li><li> Färben das Innere des myonuclei die Proben dreimal mit PBS waschen und gehen Sie wie folgt vor: <ol><li> Fügen Sie den Kernmarker TO-PRO-3 in einer Verdünnung von 1: 1000 in PBS und Inkubation für 20 Minuten unter ständigem Rühren. Dieser Marker wird in dieser Studie aber jede andere im Handel erhältliche Kernmarker können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Waschen Sie schnell dreimal in PBS vor der Montage. </li></ol></li></ol> 4. Montage Proben auf dem Objektträger <ol><li> Wählen Sie die Proben mit einer Pinzette aus der 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und legen sie auf einer Verarbeitungs nach unten rutschen. </li><li> Durch die Verwendung von Mikro-Dissektion Schere, schneiden Sie den Kopf und den Schwanz der Filets und halten ihre innere Oberfläche auf. </li><li> bereiten Sie the Montagegleitzone durch Umwickeln drei Streifen aus Zellstoffband auf jeder Seite eines sauberen Objektträger in einem Abstand von etwa 1 cm voneinander. Sobald das Deckglas auf der Oberseite der beiden Streifen positioniert ist, wird eine Lücke erzeugt, die von den Proben Abflachung vermeiden. Dies ist entscheidend, wenn dreidimensionale Volumen Renderings von Strukturen gemacht werden. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen von etwa 20 &amp; mgr; l des Eindeckmedium in der Mitte des Aufnahmeschlitten zwischen den drei Cellulosebandstreifen. </li><li> Das Eindeckmedium mit sauberen Pinzette Nach dem Verteilen, ziehen Sie die seziert Larven an der Befestigungsschieber in die Montagemedium, die Innenfläche nach oben zu halten. Versuchen Sie, sie in Reihen von vier oder fünf zu montieren. </li><li> Drop vorsichtig mit einem Deckglas auf der Oberseite des Befestigungsschlitten und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen erzeugt werden. Siegel die Folie mit transparentem Nagellack. Lassen Sie die Proben für mindestens 10 min vor der Bebilderung trocknen. </li></ol> 5. Die konfokale Einstellungen für Imaging Hinweis: Bilder in dieser Studie vorgestellt werden, damit eine Nikon A1R konfokalen Einheit mit integriert auf einem Ti: E inverses Mikroskop. Jedoch kann jedes konfokalen Mikroskop mit einem Minimum von 3 Lasereinheiten in den Wellenlängenbereichen von 488 nm, 561 nm und 642 nm und einem 3-Kanal-Detektionssystem ist für diesen Zweck geeignet. <ol><li> Schalten Sie den Laser, Detektoreinheit, Quecksilber-Lampe, Tischsteuerung, Mikroskop und den PC. Die Steuersoftware starten und sichern Sie den Schlitten auf der Bühne Halter. </li><li> Um Bildgebung schneller, wählen und alle Regionen von Interesse (ROI) auf die Probe zu markieren, indem ein 20x-Objektiv verwendet wird. </li><li> Vorsichtig schwenken die Mundstück auf die 60X höhere Vergrößerung Objektivlinse (60X Plan Apo VC / NA 1.4 OIL). </li><li> Geben Sie einen Tropfen des Eintauchens Öl auf die Objektivlinse und wählen Sie eine der markierten ROI von XYZ-Übersichtsfenster auf dem Computer. </li><li> Starten Sie Bildgebung durch die folgenden optischen Einstellungen: Wählen Sie die erste dichroitische Spiegel: 405/488/561/640. Wählen 488 nm-Laser mit Emissionsfilter 525/50 nm in Kanal 1, 561 nm-Lasers mit 595/50-Emissionsfilter in Kanal 2 und 642 nm-Laser mit Langpassfilter 650 nm in Kanal 3. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Scan-Einstellungen vor der Bildaufnahme starten: Wählen Sie Galvano-Scanner; Scan-Richtung: ein Weg; Scangeschwindigkeit: 0,5 Bilder pro Sekunde. </li><li> Wählen Sie Channel-Serie Kanaldurchbluten zu vermeiden. </li><li> Stellen Sie die Lochgröße auf 1 luftigen Einheit. Scannen und stellen Sie die Laserleistung, Detektions Verstärkungs- und Offset in geeigneter Weise für jeden Kanal Pixelsättigung und Hintergrundpegel zu vermeiden. </li><li> Erwerben z-Stapel von Voxel Größe unter Verwendung von 0,2 x 0,2 x 0,5 um 3 für alle ROIs und der Objektträger - Präparate. Wenn die Bilder auf Entfaltungs unterworfen werden setzt dann die Voxel - Größe bis 0,06 x 0,06 x 0,15 um 3. </li><li> Speichern von Bildern in .nd2 Dateiformat oder ics-Format. </li></ol> 6. Berechnung des Abstandes zwischen Nuclei innerhalb Striated60; Muskeln durch die Methode der Analyse nächstgelegener Nachbar <ol><li> Für diese Analyse verwenden Konfokalbilder Larvenkörperwand Muskeln gefärbt mit DVAP Antikörper Darstellung der Muskeln und mit Lamin-Antikörpern und einem Kern Marker sichtbar zu machen, die Kerne zu markieren. </li><li> Um die nächste Abstand zwischen den Kernen abschätzen zu können , verwenden Messpunkte innerhalb des MeasurementPro Modul der Bildanalyse - Software (zB Imaris). Andere ähnliche Softwareanwendungen für die Bildanalyse kann für die gleichen Zwecke verwendet werden. </li><li> Öffnen Sie die konfokale Bilder. So starten Sie einen Doppelklick auf das Software-Symbol. Drag &amp; Drop die konfokale z-Stapel-Bilder in die Arena. </li><li> Klicken Sie doppelt auf die Bilder um sie zu öffnen automatisch in der Ansicht Surpass, unter dem Menüwerkzeugleiste Symbol <img alt="Bild 1" src="/files/ftp_upload/53821/53821img1.jpg" /> . Die Surpass View verfügt über drei Hauptarbeitsplatten: Blick Region, Objektliste und Objekteigenschaften Bereich. </li><li> Erstellen Sie ein Volumen gemacht trei Kanal Bild von 3D-Ansicht auf das Menü-Symbol klicken <img alt="Bild 2" src="/files/ftp_upload/53821/53821img2.jpg" /> . </li><li> Klicken Sie auf das Hinzufügen neuer Messpunkte Symbol <img alt="Bild 3" src="/files/ftp_upload/53821/53821img3.jpg" /> von dem Symbolleiste Objekte und die Erstellung Assistenten, die im Objekteigenschaften Bereich angezeigt wird. </li><li> Vom Assistenten zum Erstellen von auf die Registerkarte Bearbeiten auswählen und dann bestimmten Kanal. Wählen Sie entweder die Kernmarker oder den Lamin-Kanal um die Kerne zu markieren. </li><li> Stellen Sie den Zeiger auf den Select-Modus, indem Sie die Esc-Taste Tab auf der Tastatur. </li><li> Passen Sie die Größe des 3D-Cursor-Box mit dem Mausrad einen gegebenen Kern im Bild enthalten. Fügen Sie einen Messpunkt durch die Shift-Taste und der linken Maustaste auf dem gleichen Kern zu halten. </li><li> Fügen Sie den zweiten Punkt auf einem nahe gelegenen Kern auf dem gleichen Muskel durch die vorherigen Schritte wiederholen. Eine Linie wird zwischen den zwei Punkten und dem gemessenen Abstand automatisch gezogen zwischen<html> die beiden Kerne wird angezeigt. Der Abstand zwischen den beiden Kernen ist nun als statistische Variable im Objekteigenschaften-Bereich unter der Registerkarte Statistik&gt; Detaillierte&gt; Entfernung Daten aufgezeichnet. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6,6-6,10 für alle Kerne eines gegebenen Kern umgibt. </li><li> Aus Statistiken&gt; Detail&gt; Entfernung Daten alle erfassten Messpunkte angezeigt werden, wählen Sie den kürzesten Abstand. </li><li> Mit einem Klick auf den Export Statistik Tab Anzeige in Datei <img alt="Bild 4" src="/files/ftp_upload/53821/53821img4.jpg" /> unter dem Objekteigenschaften Bereich zur Verfügung, werden die Daten auf einer Tabelle gespeichert. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen umgebenden Kerne und für eine ausgewählte Anzahl von Muskelfasern pro Genotyp. </li><li> Mit Hilfe der in ein Tabellenkalkulationsdatei exportiert Daten, die Berechnung der durchschnittlichen kürzesten Abstand (D ave) für alle M Anzahl von Muskeln , um die folgende Gleichung: OAD / 53821 / 53821eq1.jpg &quot;/&gt; Di ist der kürzeste Abstand zum benachbarten Zellkern für einen gegebenen Kern i, wo i von 0 bis N variiert und N die Anzahl der Kerne pro Muskel analysiert. Die Summierung von Werten von j = 0 bis j = m bezeichnet die Anzahl M der untersuchten Muskeln. </li><li> Alternativ verwenden Spots Assistent für die Erstellung und Spots zu Spots geringste Abstand der durchschnittlichen Entfernung zum nächstgelegenen Nachbar Kern zu schätzen. Dazu wird ein Matlab-Erweiterungsmodul erforderlich. <ol><li> Klicken Sie doppelt auf ein bestimmtes Bild auf der Arena und einem 3D-Volumenbild wird im Anzeigebereich angezeigt werden. Klicken Sie auf das Objekterstellung Symbol und New Spots <img alt="Bild 5" src="/files/ftp_upload/53821/53821img5.jpg" /> aus der Symbolleiste Objekte. </li><li> Vom Assistenten zum Erstellen im Objekteigenschaften-Bereich, klicken Sie auf die Option Überspringen Automatische Erstellung, Bearbeitung manuell. </li><li> Wählen Sie entweder den Lamin oder Kernmarker-Kanal die Kerne anzuzeigen. </li><li> Umschalttaste und klicken Sie auf left Maustaste auf alle Kerne eines bestimmten Muskels in dem Bild. Ein Fleck auf jedem Kern erscheint. </li><li> Wählen Sie Spots zu Spots Closest Entfernung zu finden unter der Registerkarte Extras im Objekteigenschaften-Area. Wählen Sie Spots Statistiken unter dem Ergebnis Modus und einem Matlab-Fenster erscheint. </li><li> Unter der Registerkarte Statistik, wählen Sie eine detaillierte und dann bestimmte Werte. Klicken Sie auf das Distmin und die Werte der Mindestabstände für jeden Kern wird angezeigt. </li><li> Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsdatei und berechnen den Mittelwert dieser Abstände pro Muskel. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Muskeln eines gegebenen Genotyps. </li></ol></li></ol> 7. Bestimmung der Form von Nuclei innerhalb der Körperwand Muskeln von Drosophila - Larven <ol><li> Für diese Analyse verwenden konfokale Bilder der Körperwand Muskeln gefärbt mit Lamin und einem Kernmarker die Kerne sichtbar zu machen. </li><li> Um die Form der myonuclei, messen Sphärizität (definiert als das Verhältnis von der Auswertungs surGesichtsbereichs einer Kugel mit dem gleichen Volumen wie dem Kern gegeben, um die Oberfläche des Kerns) oder Elliptizität (unterscheidet zwischen abgeplatteten / prolate Ellipsoide und Sphäroide). </li><li> Öffnen das Bild wie zuvor beschrieben. Klicken Sie auf die Symbolleiste Objekte Symbol hinzufügen Neue Oberflächen <img alt="Bild 6" src="/files/ftp_upload/53821/53821img6.jpg" /> . </li><li> In der Assistent für die Erstellung, die im Objekteigenschaften-Gebiet erscheint, wählen Sie die Kernmarker-Färbung als Quellkanal die Kerne anzuzeigen. </li><li> Setzen Sie die Option Absolute Intensität als die Schwelle. Stellen Sie sicher, dass die meisten der Kerne eine glatte und nicht überlastet Rendering zeigen, indem sie den Wert auf der Schwellenkurve ändern. Zur gleichen Zeit, zu vermeiden, das Vorhandensein von Löchern oder unvollständige Masken einem Kern die gleiche Kurve verwendet wird. </li><li> Verwenden Sie die Filter-Tool jedes Geräusch in der Oberflächendarstellung auszuschließen. Unter der Registerkarte Bearbeiten der neu geschaffenen Oberflächenschicht, Split oder die Kerne Oberflächen zusammenführen, die falsch sind neundered. </li><li> Export in eine Tabelle, die Elliptizität und Rundheitswerte der Oberfläche gemacht Kerne-Datei, die unter der Registerkarte Statistik zur Verfügung stehen. </li><li> Alternativ verwenden ImageJ oder Fiji Software, um die Kreisförmigkeit der Kerne zu messen, wo die Kreisförmigkeit (C) als C definiert ist, <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/53821/53821eq2.jpg" /> . Ein Wert von eins entspricht einen perfekten Kreis, während ein Wert gegen Null eine zunehmend längliche Form anzeigt. </li><li> Erstellen Sie maximale Intensität Projektionen der z-Stacks aus dem Menü Bilder&gt; Stacks&gt; Z-Projekt. Stellen Sie Projektionstyp Max Intensität. </li><li> Teilen Sie die Kanäle und wählen Sie den Kernmarker-Kanal. </li><li> Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bild&gt; Anpassen&gt; Schwellenwert. </li><li> Segment die Kerne durch die Intensitätsschwelle eingestellt wird. Wenn die in der Nähe Kerne als eine einzige Einheit segmentiert sind, klicken Sie auf Prozess&gt; Binary&gt; Watershed Werkzeug, um die Kerne zu trennen. </li><li> Aus dem Hauptmenü wählen Sie Bearbeiten&gt; SWahl&gt; erstellen Auswahl. </li><li> Fügen Sie alle ausgewählten ROIs auf die ROI-Manager durch Analysieren auf Menü klicken&gt; Tools&gt; ROI-Manager. Im ROI-Manager-Fenster klicken Sie auf Hinzufügen. Im gleichen Fenster wählen Sie Mehr&gt; Split. </li><li> Wählen Sie Formendeskriptoren in Analysieren&gt; Set Messungen. Im ROI-Manager-Fenster auf die Registerkarte klicken Messen. Dadurch wird eine Liste von Kreisförmigkeitswerte aller ausgewählten Kerne anzuzeigen. </li><li> Darüber hinaus das Kernvolumen zu messen, Oberflächen Assistent für die Erstellung mit Hilfe der Kernmarker Färbung Kanal folgen, wie 7,3-7,7 in den Unterabschnitten beschrieben. </li></ol> 8. 3D Volume Renderings von ausgewählten Kerne innerhalb der Drosophila Larven Körperwand Muskeln die Intranukleäre Lokalisierung eines spezifischen Proteins zur Bewertung <ol><li> Verwenden Sie Konfokalbilder Körperwand Muskeln mit einem Kernmarker und mit Antikörpern, die spezifisch an Lamin und DVAP gefärbt berichten. </li><li> Öffnen Sie die Bilder durch die Software zu initiieren und select die spezifische Zellkern untersucht werden. Dies kann durch die Auswahl des Hauptmenüpunkt Bearbeiten&gt; Zuschneiden 3D erfolgen. </li><li> Folgen Sie Oberfläche Assistent für die Erstellung mit Lamin-Kanal als 7,3-7,7 im Unterabschnitt beschrieben. </li><li> Sobald die Oberfläche erstellt wird, klicken Sie auf Bearbeiten im Objekteigenschaftenbereich und dann auf Alle wählen Maske das Signal innerhalb des Kerns zu isolieren. Dadurch entsteht ein neues Fenster. </li><li> Wählen Sie DVAP Signal aus dem Kanal wählen im Dropdown-Menü. Wählen Sie das DVAP Immunreaktivität Signal im Kern durch Klicken auf die Option Set Voxel außerhalb der Fläche auf Null. Eine neue maskierte Kanal erstellt und ist in der Anzeige Einstellungsfenster zur Auswahl. </li><li> Zur Visualisierung erstellen, das Vorhandensein des Signals innerhalb des Kerns eine Konturebene durch Klicken auf das Symbol New Clippingebene <img alt="Bild 7" src="/files/ftp_upload/53821/53821img7.jpg" /> aus der Symbolleiste Objekte. </li><li> Interaktives stellen Sie den Winkel des ClippingFlugzeug und seine Position um die Verteilung des Signals innerhalb des Kerns zu visualisieren. </li></ol>

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<li>Smith, D. E., Gruenbaum, Y., Berrios, M., Fisher, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+interconversion+of+Drosophila+nuclear+lamin+isoforms+during+normal+growth+and+in+response+to+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock.</a> J Cell Biol. 105 (2), 771-790 (1987).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In der Vergangenheit morphologischen Variationen innerhalb und zwischen den Versuchsgruppen wurden nur selten berücksichtigt. Jedoch ist die Anwendung quantitativer Verfahren jetzt immer die Norm in vergleichenden Untersuchungen der Morphologie und mathematische Beschreibung der anatomischen Formen berechnet. Die Verwendung von quantitativen Analysen in die Auswirkungen von genetischen Manipulationen auf spezifische zelluläre Prozesse der Beurteilung halten Versprechen bei der Verbesserung unserer Fähigkeit morphologischen Veränderungen zu erfassen und die Genauigkeit zu verbessern, mit der diese Veränderungen beschrieben sind. Darüber hinaus ermöglicht die statistische Analyse von quantitativen Daten uns ob die beobachteten Unterschiede zwischen den Phänotypen signifikant zu bewerten sind. In quergestreiften Muskulatur weisen Kerne eine deutliche gerundete Struktur und sind entlang der Muskelfasern gleichmäßig verteilt. Obwohl die molekularen Mechanismen, Einführung und Aufrechterhaltung von Größe, Form und Architektur der Kerne nicht bekannt sind, sind diese Kernfunktionen wahrscheinlich to spielen eine fundamentale Rolle Muskelfunktion bei der Kontrolle. Tatsächlich sind mehrere Myopathien durch Mutationen in Genen verursacht Morphologie und Position der Kerne in den Muskeln zu regulieren. Die funktionale Bedeutung der Form und Verteilung von Kernen innerhalb einer Zelle auf Muskeln beschränkt. Akkumulieren Beweise zeigen , dass die Kern Defekte werden auch mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Parkinson 18,24 verbunden. Darüber hinaus beginnen wir, dass die Morphologie, Größe und intrazelluläre Verteilung von anderen Organellen einschließlich endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien zu schätzen funktionelle Auswirkungen haben. Zum Beispiel 25 Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie mit neurologischen Erkrankungen wie Optikusatrophie Typ-1 (OPA1) und Charcot-Marie-Tooth - Typ 2A Neuropathie in Verbindung gebracht. Zur Unterstützung im Prozess der molekularen Mechanismen der Aufklärung diese wichtigen Prozesse zugrunde liegen, schlagen wir eine hohe Auflösung der konfokalen zu kombinierenDaten mit Bildbearbeitungssoftware und morphometrische Analysen quantitativ zu bewerten, wie genetische Manipulationen Form beeinflussen können, Größe und Lage der Kerne innerhalb Muskelfasern. Die Leistungsfähigkeit und Vielseitigkeit der Drosophila Genetik zusammen mit dem sehr klischee Natur des neuromuskulären Systems in Drosophila - Larven machen die Larven NMJ ein experimentelles Modell besonders geeignet für diese Art von Analysen. An den Larven NMJs können phänotypische Analyse bei einer einzelnen Synapse Auflösung durchgeführt werden , um eine genaue morphometrische Analyse ermöglicht , wo eine Anzahl von NMJs kann innerhalb derselben Fliege und sogar die gleiche identifizierbare NMJ zwischen Fliegen verschiedener Genotypen werden 3,4 im Vergleich untersucht werden. Phänotypischen Charakterisierung von Kern Position, Form und Größe an der Drosophila Larven NMJ beginnt durch Immunfärbung von seziert NMJs mit Antikörpern durchführen , die Muskeln und Kerne in den Muskeln hervorheben. Im Protokoll thi skizziertes Papier, myonuclei wurden mit polyklonalen Antikörpern gegen lamin, einem Marker der Kernhülle gebeizt, mit einem nuklearen Marker Hervorhebung der Kerninnen und mit Antikörpern, die spezifisch an DVAP die gesamte Muskel zu färben. Die lamin Antikörper in diesen Experimenten verwendet wurden von Paul Fisher freundlicherweise 19-22 aber alternative Quellen von anti-lamin Antikörper können verwendet werden. Darüber hinaus sind eine Reihe anderer Antikörper, die spezifisch für die Kernhülle im Handel erhältlich. Schließlich sind Kern Marker, wie DAPI und Propidiumiodid, auch während Muskeln durch Färbung mit anti-Aktin oder anti-Tubulin-Antikörpern sichtbar gemacht werden konnten. Wenn andere Antikörper als die in diesem Versuchsverfahren verwendet, eingesetzt werden, wird die Immunfärbungsprotokoll erfordern Extraschritte, bei denen Fixierungsbedingungen und Arbeitskonzentrationen für die neuen Antikörper müssen optimiert werden. Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll, vor allem, wenn Volumen Renderings analysiert werden müssen, ist the Montage der Proben auf der Folie. In diesem Fall ist es wichtig, Abstandshalter zwischen dem Objektträger und dem Deckglas aufzunehmen, so dass die Proben werden nicht zerquetscht. Drei Bänder aus Celluloseband um die Folie auf beiden Seiten des Deckglases gewickelt stellen eine einfache Möglichkeit, Abstandhalter zu machen. Während ImageJ für 2D-Bilder verwendet wurde, analysiert die meisten 3D-Multi-Channel-Bild in diesem Papier, wurden unter Verwendung von Imaris getan wegen seiner im Haus vorhanden sind. Jedoch kann jede andere ähnliche kommerzielle Software-Paket kann für diese Anwendungen verwendet werden. Es gibt mehrere Open-Source (zB ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME und andere) und kommerzielle Software-Plattformen zur Verfügung für die Analyse von konfokalen Bildern. ImageJ 26, die freie Software von der NIH oder seine erweiterte Version, wie FiJi bekannt 27, hat eine große Anzahl von Import - Filter, Makros und Plugins für die weltweite Kommunika - Bildgebungty. Die meisten dieser Plugins sind auf die Verarbeitung der Informationen auf einer Scheibe-für-Scheibe Weise fokussiert. Es gibt auch Plugins für die Visualisierung und Analyse von mehrkanaligen 3D-Bildern. Allerdings sind sie oft für eine bestimmte Aufgabe entwickelt und Benutzer müssen diese Plugins, um ihre eigenen Bedürfnisse zu erweitern oder anpassen. Auf der anderen Seite, Ziel kommerziellen Plattformen relativ unerfahrene Anwender und werden oft konzentrierte sich auf einfache zu bedienende, breite Abdeckung von Bildverarbeitungsaufgaben mit einer unglaublichen Geschwindigkeit. Das experimentelle Verfahren zusammen mit der quantitativen in diesem Protokoll beschriebenen phänotypische Analyse kann helfen, die molekularen Mechanismen bei der Aufklärung Organell Morphologie zu steuern und deren Verteilung innerhalb einer Zelle. Jedoch hat dieser Ansatz die offensichtliche Einschränkung dieser Prozesse zu einem bestimmten Endpunkt-Analyse. Das Verfahren Morphologie und Verteilung von Organellen des Steuerns ist wahrscheinlich sehr dynamisch sein und variieren nicht nur zwischen verschiedenen Zell types, sondern auch innerhalb der gleichen Zelle auf der Entwicklungs-oder physiologischen Zustand abhängig. Eine weitere Anwendung dieser Analyse würde durch Zeitrafferabbildungs ​​dargestellt werden, die Änderungen in Organell Morphologie und Position ermöglicht über die Zeit überwacht werden.

Die qualitative Analyse beschränkt den Fokus der meisten experimentellen Studien auf die Untersuchung genetischer Manipulationen, die zu großen phänotypischen Effekten führen, oder auf Phänotypen, die nicht quantifiziert werden können, z.B. Abwesenheit/Anwesenheit. Eine Quantifizierung der Phänotypen wird in der Regel nicht durchgeführt und Variationen, die innerhalb der Mitglieder einer phänotypischen Gruppe vorhanden sind, werden nicht berücksichtigt. Darüber hinaus kann es ohne mathematische Beschreibungen der Morphologien schwierig sein zu bestimmen, ob feinskalige phänotypische Veränderungen das Ergebnis genetisch induzierter Veränderungen sind oder ob beobachtete Veränderungen einfach auf zufällige Fluktuationen zurückzuführen sind. 
Wir schlagen vor, dass für eine genaue und unvoreingenommene Analyse von phänotypischen Defekten aufgrund von Genstörungen quantitative Methoden traditionellere qualitative Ansätze begleiten sollten. Die quantitative Bewertung von Phänotypen ist besonders vorteilhaft für Strukturen wie Synapsen, die aufgrund ihrer intrinsischen morphologischen und funktionellen Plastizität ein hohes Maß an Variabilität aufweisen. Wir haben Beispiele für quantitative Analysen ausgewählt, die auf Untersuchungsbereiche angewendet werden, mit denen wir am besten vertraut sind, nämlich die neuromuskulären Verbindungen (NMJs) der Drosophila-Larven. Konzepte und Prinzipien lassen sich jedoch genauso gut auf andere experimentelle Systeme übertragen. 
Das Larven-NMJ ist aufgrund der stark stereotypen Natur seiner Struktur ein ausgezeichnetes Modellsystem, um die synaptische Entwicklung und Funktion zu untersuchen. Jedes Hemisegment des neuromuskulären Systems der Larve enthält 32 identifizierbare Motoneuronen, die synaptische Kontakte mit ihrem postsynaptischen Zielmuskel bilden. Jedes Hemisegment enthält auch eine feste Anzahl von Muskeln, die als mehrkernige Fasern sichtbar sind und an der inneren Oberfläche der Kutikulabefestigt sind 1. Ein weiterer Vorteil der Verwendung des neuromuskulären Larvensystems ist die Leistungsfähigkeit und Vielseitigkeit der Drosophila-Genetik, die es ermöglicht, auf einfache Weise eine Reihe von mutierten Allelen zu erzeugen und die Genexpression zeit- und gewebebegrenzt zu modifizieren. Schließlich haben 75% der menschlichen Gene, die eine Krankheit verursachen, in Drosophila2 ein evolutionär konserviertes Ortholog. Tatsächlich sind ganze genetische Signalwege zwischen Fliegen und Menschen konserviert. Aus diesem Grund ist das neuromuskuläre System der Drosophila-Larven ein sehr beliebtes experimentelles Modell, um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die einer Reihe von menschlichen Krankheiten zugrunde liegen, einschließlich der amyotrophen Lateralsklerose (ALS)1. 
Hier zeigen wir, dass die Verfügbarkeit mehrerer zuverlässiger immunhistochemischer Marker, kombiniert mit Bio-Imaging-Techniken und genauen morphometrischen Analysen, anatomische Merkmale beschreiben kann, die wahrscheinlich eine wichtige funktionelle Rolle spielen3,4,5. Unter den zellulären Prozessen, die für quantitative Analysen zugänglich sind, konzentrieren wir uns auf Veränderungen in Form, Größe und Position intrazellulärer Strukturen wie der Zellkerne. All das sind Prozesse, über die wir sehr wenig wissen.
Die Herausforderung für Molekulargenetiker in den kommenden Jahrzehnten wird darin bestehen, unser aktuelles Wissen zu erweitern, indem wir die Auswirkungen genetischer Mutationen analysieren, die sehr subtile phänotypische Defekte hervorrufen. Quantitative Methoden, die es Forschern ermöglichen, die Auswirkungen genetischer Mutationen akribisch zu untersuchen, können ein umfassenderes Verständnis dafür liefern, wie Genotypen mit Phänotypen zusammenhängen, insbesondere bei schlecht verstandenen zellulären Prozessen.

<table><tbody><tr><td>Mikro-Pinzetten 0,3 mm x 0,25 mm</td><td>Feinmechanik-Werkzeuge&nbsp;</td><td>11030-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Präparierplatten&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>76103</td><td>Mischen Sie die vorgewogene Elastomerbasis mit dem Härter. Die Mischung in eine 5 cm große Petrischale geben. Lassen Sie es bei 60 Grad aushärten; C für mindestens 24 Stunden</td></tr> Edelstahl<tr><td>/Stahl Minutien Pins 0,1 mm Durchmesser</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodissektionsschere (ultrafein) &nbsp;</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge&nbsp;</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung). Zusammensetzung: 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)</td></tr><tr><td>Die Lösung von Bouin. Zusammensetzung: Pikrinsäure, Formaldehyd, Essigsäure (15:10:1)</td><td></td><td></td><td>Pikrinsäure (SIGMA 197378), Formaldehyd (F8775), Essigsäure (SIGMA-1005706)</td></tr><tr><td>1x PBT (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Triton). 1x PBS + 0,1% Triton&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Triton-X100. SIGMA-T8787</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>SIGMA</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Meerschweinchen-Anti-DVAP-Antikörper</td><td></td><td></td><td>Zur Verfügung gestellt von Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Anwendung bei einer Verdünnung von 1:200 in 5% NGS</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-HRP (Meerrettichperoxidase)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>Anwendung bei 1:500 Verdünnung in PBT mit 5% NGS</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Lamin Antikörper</td><td></td><td></td><td>Bereitgestellt von Dr. Paul Fisher (State University of New York at Stony Brook). Bei einer Verdünnung von 1:500 in PBT mit 5 % NGS&nbsp;</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Molecular Probes</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-Antikörper aus der Ziege, Alexa Fluor488, konjugiert</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>bs-295G-A555-BSS</td><td>Verwendung bei 1:500 Verdünnung in PBT mit 5 % NGS</td></tr><tr><td>Anti-Meerschweinchen-IgG-Antikörper aus Ziege, Cy3, konjugiert</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>bs-0358G-Cy3-BSS</td><td>Verwendung bei 1:500 Verdünnung in PBT mit 5 % NGS</td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium für Fluoreszenz</td><td>Vector Laboratorien</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

warum quantifizierung von bedeutung: charakterisierung von phänotypen bei der<em&gt; drosophila</em&gt; larval neuromuskuläre junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Die meisten Studien über Morphogenese verlassen sich auf qualitative Beschreibungen, wie anatomische Merkmale durch die Unterbrechung von spezifischen Genen und genetischen Pfade betroffen sind. Quantitative Beschreibungen werden selten durchgeführt, obwohl genetische Manipulationen eine Reihe von phänotypischen Effekte erzeugen und Variationen sind auch unter den Individuen innerhalb der Kontrollgruppe beobachtet. Beweise Schwellen zeigt, dass die Morphologie, Größe und Lage von Organellen eine bisher unterschätzten, aber fundamentale Rolle in der Zellfunktion und das Überleben spielen. Hier stellen wir Schritt- für -Schritt - Anleitungen zur Durchführung von quantitativen Analysen von Phänotypen an der Drosophila Larven neuromuskulären Synapse (NMJ). Wir verwenden mehrere zuverlässige immunhistochemischen Marker mit Bio-Imaging-Techniken kombiniert und morphologisch analysiert die Auswirkungen von genetischen Mutationen auf spezifische zelluläre Prozesse zu untersuchen. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die quantitative Analyse von Phänotypen Morphologie, Größe und Position von n zu beeinflussenuclei innerhalb der quergestreiften Muskeln von Drosophila - Larven. Die Drosophila Larven NMJ ist eine wertvolle experimentellen Modell die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen , die die Struktur und die Funktion des neuromuskulären Systems, sowohl bei Gesundheit und Krankheit zu untersuchen. die Methoden wir hier beschreiben, können jedoch auch auf andere Systeme ausgedehnt werden.

ALS ist eine degenerative Erkrankung spezifisch motorischen Neuronen beeinflussen 7 auf eine progressive und tödliche Lähmung der quergestreiften Muskulatur führt. Missense - Mutationen im menschlichen VAMP-Associated Protein B (hVAPB) verursachen eine Reihe von Motoneuron - Erkrankungen einschließlich ALS Typ 8-12 August. A Missense - Mutation (V234I) im hVAPB Gen wurde in einem Fall von typischen ALS beim Menschen 13 kürzlich identifiziert. Um sein pathogenes Potential beurteilen zu können , haben wir einen transgenen Fliegen , die hVAPB Drosophila Ortholog DVAP Expression der krankheitsverursachenden Mutation tragen (DVAP-V260I). Mit der UAS / GAL4 - System und den muskelspezifischen Treiber BG57-Gal4 14,15 Die Expression dieses Transgen in die Muskeln gezielt. Die Wirkung von DVAP-V260I transgenen Expression wurde verglichen und die der beiden anderen Transgenen (DVAP-WT1 und DVAP-WT2) gegenübergestellt , die 16 - Protein verschiedenen Ebenen des Wildtyp DVAP auszudrücken. More gesagt, ist die Zunahme der DVAP Immunreaktivität höherer 2,2fach als bei den Kontrollen für die DVAP-WT2 Linie während DVAP-V260I und DVAP-WT1 zeigen vergleichbare und unteren Ebenen des gleichen Signals 16. Nuclear Veränderungen haben mit dem Altern und neurodegenerativen Erkrankungen , einschließlich der Parkinson-Krankheit 17,18 in Verbindung gebracht worden. Um zu beurteilen , ob unsere Fliegenmodell für ALS8 zeigt Änderungen in der Kern Architektur, Lage und Größe, gefärbt wir Kerne innerhalb quergestreiften Muskulatur geeigneter Genotypen mit einem nuklearen Marker und dem anti-Lamin Antikörper 19-22, die die Kernhülle visualisiert. Um die Muskeln zu markieren, ein DVAP spezifischen Antikörper wurde auch mit den gleichen Proben (Figur 1) gegeben. Konfokale Bilder wurden gesammelt und detaillierte morphometrischen Analysen wurden unter Verwendung einer Bildanalysesoftware durchgeführt. In Kontroll Muskeln wurden Kerne gefunden entlang der Muskulatur gleichmäßig verteilt werdenFasern , während in DVAP-V260I und DVAP-WT Muskeln ausdrückt, Kerne eine Tendenz aufweisen , eng verbunden Cluster (Abbildung 1) zu verteilen , in. Wir führten eine Nächste-Nachbar-Analyse eine quantitative Auswertung der Verteilung der Kerne entlang der Muskelfasern jedes Genotyps durchzuführen. Eine nächste Nachbar-Analyse identifiziert zuerst den nächsten Nachbarn für jeden Kern, der durch den Abstand zwischen der Mitte eines gegebenen Kern und Mittelpunkt jeder anderen umgebenden Kern zu messen. Dieses Verfahren wird für alle anderen Kerne entlang der Muskelfasern dann wiederholt. Schließlich wird der kürzeste Abstand zwischen den Kernen innerhalb eines bestimmten Muskels, berechnet durch die kürzesten Abstände von jedem Kern und seinen nächsten Nachbarn gemittelt. (2A - C). Im Vergleich zu den Kontrollen, die Muskeln, die entweder die DVAP-V260I Transgen oder einen der Transgene, die das Wildtyp-Protein überexprimierenpräsentieren, eine drastische Reduzierung der durchschnittlichen kürzesten Abstand zwischen den Kernen und, als Folge, Kerne scheinen eng in Clustern zugeordnet werden. Die Wirkung des ALS - Allel verursacht DVAP-V260I ist schwerer als die mit der Überexpression des Wildtyp - Proteins verbunden ist , selbst wenn die stärksten DVAP-WT2 Transgen verwendet wird (Figur 1 und Figur 2D). Überexpression von entweder DVAP-V260I oder DVAP-WT Transgenen zeigt auch eine erhebliche Verschlechterung des Kernarchitektur wodurch verformte Kerne mit einer länglichen Struktur (Abbildung 1). Diese strukturelle Aberration wurde unter Verwendung der ImageJ Software quantifiziert, in dem Zirkularität durch die Formel C definiert ist, <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/53821/53821eq3.jpg" /> , Was die Breite zu Länge-Verhältnis von jedem Kern mit C = 1 repräsentiert einen perfekten Kreis und C = 0 ein unendlich verlängerte Polygon messen. in control Kerne eine deutliche runde Form aufweisen, ist C gleich 1 , während in den transgenen Mutanten eine Änderung der Form mit damit verbundenen Verlust der Zirkularität, eine signifikante Abweichung von diesem Wert (Abbildung 1 und Abbildung 3) verursacht. Wir fanden auch in Muskeln, die die gleichen Transgene exprimieren, Kerne eine deutliche vergrößerte Kernvolumen angezeigt werden Kontrollen im Vergleich zu, obwohl die ALS verursachen Allel effizienter in diesen Phänotyp zu induzieren , verglichen mit den DVAP-WT Transgene (Abbildung 4) zu sein scheint. Fast alle neurodegenerativen Erkrankungen werden durch die intrazelluläre Akkumulation von Aggregaten gekennzeichnet das pathogene Protein enthält. Wir haben 3D-Rekonstruktionen und Volumen-Renderings von Kernen und wir fanden heraus, dass in den Muskeln des mutierten Transgen exprimieren, oder das Wildtyp-Protein überexprimieren, DVAP Immunreaktivität Cluster bildeten einend dass einige von ihnen auch in die Kerne lokalisiert wurden (Abbildung 5). Umgekehrt wird in Steuer NMJs wird DVAP Immunreaktivität schwach ganzen Muskelfaser dispergiert und aus dem Kern 16 ausgeschlossen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig1.jpg" /> . Abbildung 1: Die konfokale Bilder von myonuclei in gestreifter Muskeln entweder die DVAP-WT oder die DVAP-260i Transgene (A) BG57-Gal4 / + Steuerung, (B) BG57 zum Ausdruck bringen; DVAP-V260I, (C) BG57; DVAP-WT1 und (D) BG57; DVAP-WT2 Muskeln die angegebenen Transgene exprimieren , werden mit Antikörpern , die spezifisch für DVAP (rotes Signal) gefärbt, Lamin (grünes Signal) und mit einem Kern spezifischer Marker , die Kerne (blau - Signal) zu visualisieren. Maßstabsbalken = 30 &amp; mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig1large.jpg" target="_blank">um anzuzeigen</a>Größere Version der Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Nächster - Nachbar - Analyse der durchschnittliche Abstand zwischen einem Kern und seinem einzigen nächsten Nachbarn (B) Repräsentative Ergebnisse zeigen veränderte Kern Positionierung in Muskeln Überexpression des DVAP-WT2 Transgen , um zu bestimmen , im Vergleich zu den Kontrollen in (A). Durchschnittliche Atomabstand in Muskeln der angegebenen Genotypen wurde unter Verwendung der Formel in (C) geschätzt , und die Daten werden in (D) angegeben. Larval NMJs sind mit Antikörpern, die spezifisch für DVAP (rotes Signal), Lamin (grün) und mit einem Kernmarker (blaues Signal) gefärbt. Sternchen bezeichnen statistische Signifikanz. *** P &lt;0,001, ** P &lt;0,01. Für die statistische Analyse dieses Experiment und alle berichteten Experimente unter einen Einweg-ANOVA-Test wurde verwendet, und ein Tukey-multiple-Vergleichstest wurde als Post-hoc-Test angewendet, wenn die Unterschiede zwischen den Genotypen durch den ANOVA-Test als signifikant befunden wurden. Die Fehlerbalken stellen SEM. Maßstabsbalken = 30 &amp; mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Bilder zeigen repräsentative Schritte bei der Berechnung des Kernvolumens (A) Ein repräsentatives Bild zeigt segmentierte Kerne der Oberfläche Erstellungsassistenten. Nuclei an der Grenze der Bilder wurden ignoriert. (B) Bild der Kern DVAP Signal nach der umgebenden DVAP Färbung zeigt wurde durch die Verwendung der Oberfläche im Kernmarkierungskanal geschaffen maskiert. (C) Oberflächenschicht enthält Informationen von zusätzlichen Parameterneinschließlich des Kernvolumens und der Rundheitsgrad. (D) Daten über die Kernvolumen verschiedener Genotypen. Sternchen bezeichnen statistische Signifikanz. Dissected NMJs wurden mit anti-DVAP Antikörper (rotes Signal), Anti-Lamin Antikörper (grünes Signal) und einem Kernmarker (blaues Signal) gefärbt. *** P &lt;0,001, ** P &lt;0,01. Die Fehlerbalken stellen SEM. Maßstabsbalken = 30 &amp; mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig4.jpg" /> Abbildung 4: Bilder zeigen repräsentative Schritte bei der Schätzung der Kernform von ImageJ. &#160;&#160; Maximale Intensität Projektion von Bildern wurden mit ImageJ analysiert Zirkularität der Kerne in den Muskeln zu schätzen. (A) Ein repräsentatives Beispiel des Intensitätsprojektionsdes Dreikanalbild, wie in Schritt 7.9 des Protokolls. (B) Bild zeigt Schritt 7.10 des Protokolls , in dem Kanäle aufgeteilt sind und die Kernmarker - Kanal ausgewählt ist. (C) Ein repräsentatives Bild zeigt , dass Intensitätsschwelle zu segmentieren nach dem Auftragen der Kerne und ROI - Manager - Plugin in ImageJ, alle Kerne von Interesse ausgewählt und deren Form gemessen durch Form - Deskriptoren werden kann (Schritte 7,11-7,15). (D) Die Quantifizierung der Zirkularität von verschiedenen Genotypen. Auf den Larven NMJs zeigt das rote Signal DVAP Färbung, während die grüne Kerne umreißt und entspricht der Lamin-Färbung. Das Innere jeder Kern mit einem Kernmarker aufgrund der Färbung in blau markiert. Sternchen bezeichnen statistische Signifikanz. *** P &lt;0,001, ** P &lt;0,01. Die Fehlerbalken stellen SEM. Maßstabsbalken = 30 &amp; mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken sie</a>e eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig5.jpg" /> Abbildung 5: Bilder konkrete Schritte bei der Erstellung von Volumen - Renderings von myonuclei zeigt. (A) Bild 3D - Intensität zeigt , gemischt Ansicht von Muskeln gefärbt mit DVAP Protein (rot), die Lamin (grün) und die DNA - Marker (blau). (B) Bild , das eine Oberflächenschicht unter Verwendung des Lamin - Kanal - Segment die Kerne erzeugt darstellt. (C) Bild repräsentiert einen Kern , in dem die Oberflächenschicht verwendet wurde , außerhalb des ausgewählten Kerns die DVAP Signal zu maskieren. Hervorgehoben in gelb ist eine Clipping-Ebene, die dem Bild hinzugefügt wurde. Dessen Blickwinkel und die Position kann interaktiv die Verteilung des Signals innerhalb des Kerns zu visualisieren eingestellt werden. (D) Ein Bild einer Querschnittsansicht der Schicht der Kernoberfläche erzeugt usi Berichterstattungng der Lamin Kanal fusionierte mit unmaskierten DVAP und Kernmarkierungssignale. (E und F) weiteren Schnittvolumen Renderings des gleichen Kerns. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Morphologie, Größe und Lage intrazellulärer Organellen sind evolutionär konserviert und scheinen ihre Funktion direkt zu beeinflussen. Die molekularen Mechanismen, die diesen Prozessen zugrunde liegen, zu verstehen, ist zu einem wichtigen Ziel der modernen Biologie geworden. Hier zeigen wir, wie diese Studien durch die Anwendung quantitativer Techniken erleichtert werden können.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, zu zeigen, wie quantitative Analysen anatomischer Merkmale durchgeführt werden können. Es wird die Quantifizierung von Phänotypen, die die Morphologie, Größe und Position der Zellkerne beeinflussen, mit den quergestreiften Muskeln der Drosophila-Larven demonstriert. Das Verständnis des molekularen Mechanismus, der die Morphologie, Größe und Verteilung intrazellulärer Organellen steuert, ist eine der wichtigsten Fragen der modernen Biologie.In der Vergangenheit wurden morphologische Variationen zwischen und innerhalb von Versuchsgruppen nur einer qualitativen Analyse unterzogen. Hier schlagen wir vor, in quantitativer Analyse, die die Drosophila-Genetik mit morphometrischer quantitativer Analyse kombiniert, Gene zu identifizieren, die Größe, Form und Verteilung der Zellkerne in den Muskeln steuern. Bei der Demonstration des Verfahrens wird Leire Ledahawski, eine Doktorandin aus meinem Labor, helfen.Nachdem Sie die neuromuskulären Verbindungen der Larve gemäß dem Textprotokoll präpariert und gefärbt haben, entnehmen Sie die Proben mit einer Pinzette aus dem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie auf einen Objektträger. Schneiden Sie mit einer Mikrodissektionschere den Kopf und den Schwanz von den Filets ab und halten Sie die Innenflächen oben. Bereiten Sie nun eine Montageschiene vor, indem Sie drei Streifen Zelluloseband im Abstand von einem Zentimeter um einen sauberen Objektträger wickeln.Legen Sie den Deckglas über diesen Spalt, damit die Proben nicht flach gedrückt werden. Legen Sie dann etwa 20 Mikroliter des Einbettmediums zwischen die Zellulosebandstreifen und verteilen Sie das Medium mit einer sauberen Pinzette. Entferne nun das überschüssige Taschentuch von den Preps.Ziehen Sie die präparierten Larven vom Verarbeitungsobjektträger auf den Eindeckschieber und in das Eindeckmedium, wobei Sie die Innenfläche nach oben halten. Tragen Sie anschließend vorsichtig einen Deckslip auf und achten Sie darauf, dass keine Luft eingeschlossen wird. Versiegeln Sie dann den Objektträger mit transparentem Nagellack und lassen Sie den Objektträger vor der Bildgebung mindestens 10 Minuten trocknen.Für diese Analyse werden konfokale Bilder verwendet, die die Körperwandmuskulatur der Larven zeigen, die mit DeVAP-Antikörpern, Lamin-Antikörpern und einem Kernmarker gefärbt sind. Ziehen Sie dann die konfokalen Z-Stack-Bilder per Drag & Drop in die Arena. Doppelklicken Sie auf die Bilder, um sie automatisch in der Surpass-Ansicht zu öffnen, die über ein Symbolleistensymbol aufgerufen wird.Die Surpass-Ansicht verfügt über drei Hauptbereiche im Arbeitsbereich. Ansichtsbereich, Objektliste und Bereich Objekteigenschaften. Klicken Sie anschließend auf das Symbol 3D-Ansicht, um ein volumengerendertes Dreikanalbild zu erstellen.Wählen Sie dann in der Symbolleiste "Objekte" die Option "Neue Messpunkte hinzufügen" und folgen Sie dem Erstellungsassistenten im Bereich "Objekteigenschaften". Wählen Sie zuerst die Registerkarte Bearbeiten und dann unter Spezifischer Kanal entweder den Kernmarker oder den Laminkanal aus, um die Kerne hervorzuheben. Stellen Sie als Nächstes den Zeiger auf den Auswahlmodus ein, indem Sie die Registerkarte Escape drücken, und passen Sie dann die Größe des 3D-Cursorfelds mit dem Mausrad so an, dass es einen bestimmten Kern im Bild enthält.Fügen Sie einen Messpunkt hinzu, indem Sie die Umschalttaste gedrückt halten und mit der linken Maustaste auf denselben Kern klicken. Fügen Sie dann den zweiten Punkt auf einem nahegelegenen Kern desselben Muskels mit der gleichen Technik hinzu. Zwischen den beiden Punkten wird automatisch eine Linie gezogen und der Abstand zwischen den beiden Kernen wird als statistische Variable angezeigt und aufgezeichnet.Wiederholen Sie den Vorgang für alle Kerne, die einen bestimmten Kern umgeben. Wählen Sie dann aus allen gesammelten Messpunkten, die Sie unter Statistik Detaillierte Entfernungsdaten finden, die kürzeste Entfernung aus. Wählen Sie im Bereich Objekteigenschaften die Option Statistik exportieren mit Registerkarte Anzeige in Datei verfügbar.Dadurch werden die Daten in einer Tabelle gespeichert. Verwenden Sie für diese Analyse konfokale Bilder von Körperwandmuskeln, die mit Lamin und einem Kernmarker gefärbt sind, um die Zellkerne sichtbar zu machen. Um die Form der Myonukleen zu beurteilen, messen Sie ihre Sphärizität, die die Kernoberfläche mit der einer Kugel mit dem gleichen Volumen vergleicht.Alternativ können Sie die Elliptizität messen, die Prolate, Oblaten oder Ellipsoide und Sphäroide unterscheidet. Öffnen Sie das Bild wie zuvor beschrieben. Klicken Sie dann auf das Symbol in der Symbolleiste Objekte Neue Oberflächen hinzufügen.Wählen Sie im Erstellungsassistenten, der im Bereich Objekteigenschaften angezeigt wird, die Kernmarkerfärbung als Quellkanal aus, um die Kerne anzuzeigen. Legen Sie die Option Absolute Intensität als Schwellenwert fest. Stellen Sie sicher, dass die meisten Kerne eine glatte, nicht überladene Darstellung aufweisen, indem Sie den Wert auf der Schwellenwertkurve ändern.Vermeiden Sie gleichzeitig das Vorhandensein von Löchern oder unvollständigen Masken von Zellkernen. Verwenden Sie anschließend das Filterwerkzeug, um Rauschen aus dem Oberflächen-Rendering zu entfernen. Teilen Sie auf der Registerkarte Bearbeiten der neu erstellten Oberflächenschicht die Zellkernoberflächen auf, die falsch gerendert wurden.Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Zellkernoberflächen zusammenzuführen, die falsch gerendert wurden. Die Elliptizitäts- und Sphärizitätswerte der oberflächengerenderten Kerne sind auf der Registerkarte Statistik verfügbar. Exportieren Sie diese Daten zur Analyse.Für dieses Protokoll werden konfokale Bilder verwendet, die Körperwandmuskeln zeigen, die mit einem nukleären Marker und mit Antikörpern gefärbt wurden, die spezifisch für Lamin und DeVAP sind. Öffnen Sie das gewünschte Bild über den Hauptmenüpunkt Bearbeiten und dann 3D zuschneiden. Befolgen Sie den Flächenerstellungsassistenten unter Verwendung des Laminkanals, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben.Sobald die Oberfläche erstellt ist, klicken Sie im Bereich Objekteigenschaften auf Bearbeiten und wählen Sie Alle maskieren, um ein Signal im Kern zu isolieren. Wählen Sie als Nächstes das DeVAP-Signal aus. Klicken Sie im Dropdown-Menü Kanal auswählen auf die Option Voxel außerhalb der Oberfläche festlegen und setzen Sie diesen Wert auf Null.Dadurch wird ein neuer maskierter Kanal erstellt, der im Fenster "Anzeigeanpassung" verfügbar ist. Um das Vorhandensein von Signalen im Kern zu visualisieren, erstellen Sie eine Konturebene, indem Sie auf das Symbol Neue Schnittebene hinzufügen in der Objektsymbolleiste klicken. Passen Sie dann interaktiv den Winkel der Clipping-Ebene und ihre Position an, um die Verteilung des Signals im Kern zu visualisieren.Missense-Mutationen im humanen VAMP-assoziierten Protein B sind an der ALS-Pathogenese beteiligt. Unter Verwendung der beschriebenen Methode wurden quergestreifte Muskeln, die das Fliegenortholog-Gen DeVAP exprimieren, das die ALS-verursachende Mutation V2601 beherbergt, mit Kontrollen verglichen, die vergleichbare Konzentrationen von Wildtyp-DeVAP oder höhere Spiegel von Wildtyp-DeVAP exprimierten. Die Nearest-Neighbor-Analyse wurde verwendet, um die Verteilung der Kerne entlang der Muskelfasern zu bewerten.Im Vergleich zu Kontrollmuskeln, die das mutierte DeVAP-Transgen exprimieren, oder solchen, die das Wildtyp-Protein überexprimieren, führte die interessierende Mutation zu einer dramatischen Verringerung des durchschnittlichen kürzesten Abstands zwischen den Zellkernen. Als nächstes wurde die Sphärizität der Kerne untersucht. Es wurde festgestellt, dass Transgene, die den Zellabstand reduzierten, auch das Zellkernvolumen vergrößerten.3D-Rekonstruktionen und Volumendarstellungen der Zellkerne zeigten, dass Muskeln, die die interessierende Mutation exprimieren, Cluster bilden, die in den Zellkernen lokalisiert waren. Diese Methode kann auch auf die quantitative Analyse morphologischer Merkmale erweitert werden, die mit anderen Organellen, wie z. B. Mitochondrien, verbunden sind. Veränderungen der Kernarchitektur, der Position und der Größe wurden mit dem Altern und einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson und ALS in Verbindung gebracht.Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Dyspraxisis zugrunde liegen, kann zur Identifizierung neuer pharmakologischer Ziele für wirksame therapeutische Interventionen führen.

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