Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der Drosophila Larval Neuromuskuläre Junction

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, zu zeigen, wie quantitative Analysen anatomischer Merkmale durchgeführt werden können. Es wird die Quantifizierung von Phänotypen, die die Morphologie, Größe und Position der Zellkerne beeinflussen, mit den quergestreiften Muskeln der Drosophila-Larven demonstriert. Das Verständnis des molekularen Mechanismus, der die Morphologie, Größe und Verteilung intrazellulärer Organellen steuert, ist eine der wichtigsten Fragen der modernen Biologie.

In der Vergangenheit wurden morphologische Variationen zwischen und innerhalb von Versuchsgruppen nur einer qualitativen Analyse unterzogen. Hier schlagen wir vor, in quantitativer Analyse, die die Drosophila-Genetik mit morphometrischer quantitativer Analyse kombiniert, Gene zu identifizieren, die Größe, Form und Verteilung der Zellkerne in den Muskeln steuern. Bei der Demonstration des Verfahrens wird Leire Ledahawski, eine Doktorandin aus meinem Labor, helfen.

Nachdem Sie die neuromuskulären Verbindungen der Larve gemäß dem Textprotokoll präpariert und gefärbt haben, entnehmen Sie die Proben mit einer Pinzette aus dem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie auf einen Objektträger. Schneiden Sie mit einer Mikrodissektionschere den Kopf und den Schwanz von den Filets ab und halten Sie die Innenflächen oben. Bereiten Sie nun eine Montageschiene vor, indem Sie drei Streifen Zelluloseband im Abstand von einem Zentimeter um einen sauberen Objektträger wickeln.

Legen Sie den Deckglas über diesen Spalt, damit die Proben nicht flach gedrückt werden. Legen Sie dann etwa 20 Mikroliter des Einbettmediums zwischen die Zellulosebandstreifen und verteilen Sie das Medium mit einer sauberen Pinzette. Entferne nun das überschüssige Taschentuch von den Preps.

Ziehen Sie die präparierten Larven vom Verarbeitungsobjektträger auf den Eindeckschieber und in das Eindeckmedium, wobei Sie die Innenfläche nach oben halten. Tragen Sie anschließend vorsichtig einen Deckslip auf und achten Sie darauf, dass keine Luft eingeschlossen wird. Versiegeln Sie dann den Objektträger mit transparentem Nagellack und lassen Sie den Objektträger vor der Bildgebung mindestens 10 Minuten trocknen.

Für diese Analyse werden konfokale Bilder verwendet, die die Körperwandmuskulatur der Larven zeigen, die mit DeVAP-Antikörpern, Lamin-Antikörpern und einem Kernmarker gefärbt sind. Ziehen Sie dann die konfokalen Z-Stack-Bilder per Drag & Drop in die Arena. Doppelklicken Sie auf die Bilder, um sie automatisch in der Surpass-Ansicht zu öffnen, die über ein Symbolleistensymbol aufgerufen wird.

Die Surpass-Ansicht verfügt über drei Hauptbereiche im Arbeitsbereich. Ansichtsbereich, Objektliste und Bereich Objekteigenschaften. Klicken Sie anschließend auf das Symbol 3D-Ansicht, um ein volumengerendertes Dreikanalbild zu erstellen.

Wählen Sie dann in der Symbolleiste "Objekte" die Option "Neue Messpunkte hinzufügen" und folgen Sie dem Erstellungsassistenten im Bereich "Objekteigenschaften". Wählen Sie zuerst die Registerkarte Bearbeiten und dann unter Spezifischer Kanal entweder den Kernmarker oder den Laminkanal aus, um die Kerne hervorzuheben. Stellen Sie als Nächstes den Zeiger auf den Auswahlmodus ein, indem Sie die Registerkarte Escape drücken, und passen Sie dann die Größe des 3D-Cursorfelds mit dem Mausrad so an, dass es einen bestimmten Kern im Bild enthält.

Fügen Sie einen Messpunkt hinzu, indem Sie die Umschalttaste gedrückt halten und mit der linken Maustaste auf denselben Kern klicken. Fügen Sie dann den zweiten Punkt auf einem nahegelegenen Kern desselben Muskels mit der gleichen Technik hinzu. Zwischen den beiden Punkten wird automatisch eine Linie gezogen und der Abstand zwischen den beiden Kernen wird als statistische Variable angezeigt und aufgezeichnet.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle Kerne, die einen bestimmten Kern umgeben. Wählen Sie dann aus allen gesammelten Messpunkten, die Sie unter Statistik Detaillierte Entfernungsdaten finden, die kürzeste Entfernung aus. Wählen Sie im Bereich Objekteigenschaften die Option Statistik exportieren mit Registerkarte Anzeige in Datei verfügbar.

Dadurch werden die Daten in einer Tabelle gespeichert. Verwenden Sie für diese Analyse konfokale Bilder von Körperwandmuskeln, die mit Lamin und einem Kernmarker gefärbt sind, um die Zellkerne sichtbar zu machen. Um die Form der Myonukleen zu beurteilen, messen Sie ihre Sphärizität, die die Kernoberfläche mit der einer Kugel mit dem gleichen Volumen vergleicht.

Alternativ können Sie die Elliptizität messen, die Prolate, Oblaten oder Ellipsoide und Sphäroide unterscheidet. Öffnen Sie das Bild wie zuvor beschrieben. Klicken Sie dann auf das Symbol in der Symbolleiste Objekte Neue Oberflächen hinzufügen.

Wählen Sie im Erstellungsassistenten, der im Bereich Objekteigenschaften angezeigt wird, die Kernmarkerfärbung als Quellkanal aus, um die Kerne anzuzeigen. Legen Sie die Option Absolute Intensität als Schwellenwert fest. Stellen Sie sicher, dass die meisten Kerne eine glatte, nicht überladene Darstellung aufweisen, indem Sie den Wert auf der Schwellenwertkurve ändern.

Vermeiden Sie gleichzeitig das Vorhandensein von Löchern oder unvollständigen Masken von Zellkernen. Verwenden Sie anschließend das Filterwerkzeug, um Rauschen aus dem Oberflächen-Rendering zu entfernen. Teilen Sie auf der Registerkarte Bearbeiten der neu erstellten Oberflächenschicht die Zellkernoberflächen auf, die falsch gerendert wurden.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Zellkernoberflächen zusammenzuführen, die falsch gerendert wurden. Die Elliptizitäts- und Sphärizitätswerte der oberflächengerenderten Kerne sind auf der Registerkarte Statistik verfügbar. Exportieren Sie diese Daten zur Analyse.

Für dieses Protokoll werden konfokale Bilder verwendet, die Körperwandmuskeln zeigen, die mit einem nukleären Marker und mit Antikörpern gefärbt wurden, die spezifisch für Lamin und DeVAP sind. Öffnen Sie das gewünschte Bild über den Hauptmenüpunkt Bearbeiten und dann 3D zuschneiden. Befolgen Sie den Flächenerstellungsassistenten unter Verwendung des Laminkanals, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben.

Sobald die Oberfläche erstellt ist, klicken Sie im Bereich Objekteigenschaften auf Bearbeiten und wählen Sie Alle maskieren, um ein Signal im Kern zu isolieren. Wählen Sie als Nächstes das DeVAP-Signal aus. Klicken Sie im Dropdown-Menü Kanal auswählen auf die Option Voxel außerhalb der Oberfläche festlegen und setzen Sie diesen Wert auf Null.

Dadurch wird ein neuer maskierter Kanal erstellt, der im Fenster "Anzeigeanpassung" verfügbar ist. Um das Vorhandensein von Signalen im Kern zu visualisieren, erstellen Sie eine Konturebene, indem Sie auf das Symbol Neue Schnittebene hinzufügen in der Objektsymbolleiste klicken. Passen Sie dann interaktiv den Winkel der Clipping-Ebene und ihre Position an, um die Verteilung des Signals im Kern zu visualisieren.

Missense-Mutationen im humanen VAMP-assoziierten Protein B sind an der ALS-Pathogenese beteiligt. Unter Verwendung der beschriebenen Methode wurden quergestreifte Muskeln, die das Fliegenortholog-Gen DeVAP exprimieren, das die ALS-verursachende Mutation V2601 beherbergt, mit Kontrollen verglichen, die vergleichbare Konzentrationen von Wildtyp-DeVAP oder höhere Spiegel von Wildtyp-DeVAP exprimierten. Die Nearest-Neighbor-Analyse wurde verwendet, um die Verteilung der Kerne entlang der Muskelfasern zu bewerten.

Im Vergleich zu Kontrollmuskeln, die das mutierte DeVAP-Transgen exprimieren, oder solchen, die das Wildtyp-Protein überexprimieren, führte die interessierende Mutation zu einer dramatischen Verringerung des durchschnittlichen kürzesten Abstands zwischen den Zellkernen. Als nächstes wurde die Sphärizität der Kerne untersucht. Es wurde festgestellt, dass Transgene, die den Zellabstand reduzierten, auch das Zellkernvolumen vergrößerten.

3D-Rekonstruktionen und Volumendarstellungen der Zellkerne zeigten, dass Muskeln, die die interessierende Mutation exprimieren, Cluster bilden, die in den Zellkernen lokalisiert waren. Diese Methode kann auch auf die quantitative Analyse morphologischer Merkmale erweitert werden, die mit anderen Organellen, wie z. B. Mitochondrien, verbunden sind. Veränderungen der Kernarchitektur, der Position und der Größe wurden mit dem Altern und einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson und ALS in Verbindung gebracht.

Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Dyspraxisis zugrunde liegen, kann zur Identifizierung neuer pharmakologischer Ziele für wirksame therapeutische Interventionen führen.