Isolating Stammzellen aus Soft-Gewebe des Bewegungsapparates

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, adulte Stammzellen aus weichen muskuloskelettalen Geweben wie dem Skelettmuskel zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Biopsie des Weichgewebes entnommen, dieses gereinigt und fein zerkleinert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der enzymatischen Verdauung des Gewebes.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Stammzellen durch wiederholte Vorplattierungsschritte zu isolieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Identifizierung der isolierten Stammzellen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die das morphologische und zelluläre Verhalten der Zellen mittels Immunfluoreszenz, Mikroskopie und/oder Durchflusszytometrie zeigen.

Hallo, ich bin y Lee vom Labor für Molekularpathologie der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Universität von Pittsburgh. Heute zeige ich Ihnen, wie man eine adulte Stammzelle aus den Weichgeweben des Muskel-Skelettsystems, wie beispielsweise dem Skelettmuskel, isoliert. Hallo, ich bin Dr. Johnny Ward.

Ich bin Professor an der University of Pittsburgh School of Medicine im Fachbereich Orthopädische Chirurgie. Ich arbeite eng mit Dr. Young Lee zusammen und beschäftige mich mit diesen Verfahren zur Isolierung verschiedener Arten von Stammzellen aus Skelettmuskel- und anderen Geweben wie beispielsweise Standardgewebe. In unserem Labor verwenden wir diese Verfahren zur Isolierung von Stammzellen für grundlegende Forschungsstudien zu Anwendungen in der translationalen Medizin.

Beginnen wir mit der Untersuchung. Zu den Geweben, aus denen Stammzellen isoliert werden können, gehören Sehnen und Skelettmuskeln, die aus der Tibia oder den Soleusmuskeln der Hintergliedmaßen von Wildtyp-Mäusen gewonnen wurden. Nach Entfernung von Haut- und Knochenresten werden die Gewebe in eine Schale mit kaltem HBSS, ergänzt mit 5 % FBS, gegeben.

Als Nächstes geben Sie das Gewebe getrennt auf mit Kollagen beschichtete Schalen, die kalte HBSS enthalten. Wir verwenden Skelettmuskelgewebe, um die grundlegenden Verfahren für die Gewebe-Dissociation und -Verdauung zu demonstrieren. Verwenden Sie Mikroscheren und/oder Skalpellklingen, um das Skelettgewebe zu einem groben Brei zu zerkleinern, der der enzymatischen Verdauung unterzogen wird.

Überführen Sie zunächst die MIT-Gewebesuspensionen in separate 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie diese bei etwa 3.500 U/min bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie die SANE-Waschlösung, indem Sie das Pellet in HBSS resuspendieren, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Nach dem Absaugen des Überstandes verdauen Sie die Suspensionen durch Zugabe von 10 Milliliter vorgewärmter 0,2 %iger Kollagenase.

Typ 11 für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, dabei die Röhrchen alle 10 Minuten von Hand schütteln. Nach Ablauf der 60-minütigen Inkubation zentrifugieren und die Suspensionen in 10 Milliliter DYS-Lösung resuspendieren. 45 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, dabei alle 10 Minuten von Hand schütteln. Nach der 45-minütigen Inkubation zentrifugieren und die Suspensionen in 10 Milliliter 0,2 % Trips in HBSS-Lösung resuspendieren.

Wir inkubieren normalerweise 15 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius, wobei die Röhrchen alle 10 Minuten invertiert werden; die Inkubation ist dann abgeschlossen. Wenn genügend Einzelzellen aus dem Gewebe freigesetzt wurden, wie hier dargestellt, zentrifugieren Sie die resultierenden Zellen und resuspendieren das Zellpellet in fünf Milliliter Proliferationsmedium PM. Dissoziiere die Zellsuspension, indem du das Extrakt zweimal durch eine 18-Gauge-Nadel, dann einmal durch eine 23-Gauge-Nadel und schließlich einmal durch eine 27-Gauge-Nadel leitest.

Zuletzt wird der Zellextrakt durch einen 70-Mikron-Zellsieb geleitet, um die PräPL-Technik zu beginnen. Zentrifugieren Sie den gerade hergestellten Zellextrakt und resuspendieren Sie die Pellets in Proliferationsmedium. Geben Sie fünf Milliliter der Zellsuspension auf einen mit Kollagen beschichteten T-25-Flasche und kennzeichnen Sie diese als PP1; inkubieren Sie sie 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5-%-CO₂-Inkubator für zwei Stunden.

Nach zwei Stunden werden die nicht-anklebenden Zellen in einen neuen, mit Kollagen beschichteten T25-Flasche überführt und als PP zwei bezeichnet. Fügen Sie fünf Milliliter PM in die vorherige T25-Flasche, die als PP eins gekennzeichnet ist.

Stellen Sie beide Kolben für 24 Stunden zurück in den Inkubator. Nach 24 Stunden überführen Sie die nicht-angewachsenen Zellen von PP zwei in einen neuen, mit kollagenem ENC beschichteten T-25-Kolben, und kennzeichnen Sie diesen als PP drei. Geben Sie fünf Milliliter Proliferationsmedium in den als PP zwei gekennzeichneten Kolben.

Stellen Sie die Kolben zurück in den Inkubator. Wiederholen Sie den Vorgang alle 24 Stunden, bis zur Population PP sechs. Die Stammzellpopulation wird erzeugt.

Die isolierten PP6-Zellen sind zahlenmäßig sehr gering und müssen in einem FBS-reichen Proliferationsmedium gehalten werden, das täglich gewechselt wird. Obwohl die meisten Zellen in der PP6-Kultur während der folgenden ein bis zwei Wochen Kultivierung absterben werden.

Eine große, gesunde PP-sechs-Bevölkerung wird normalerweise nach einer zusätzlichen ein- bis zweiwöchigen Expansion erzeugt. Pflegen Sie alle anderen Gruppen suspendierter Zellen ebenso, indem Sie sie proliferieren lassen und sie regelmäßig mit einem umgekehrten Mikroskop untersuchen. Die früh anhaftenden Zellen, die sich an den PP-eins- und PP-zwei-Flaschen anlagern, sind hauptsächlich fibrotische Zellen.

Zellen, die an kollagenbeschichteten Kolben haften, nach einem längeren Zeitraum innerhalb von 48 bis 96 Stunden. PP drei und PP vier bestehen hauptsächlich aus Myoblasten. Während Muskel-Satellitenzellen häufig vor allem in PP fünf zu finden sind, gelten die späteren Vorläuferzellen nach 96 Stunden oder später, PP sechs, als adulte Stammzellen und erscheinen klein, rund und durchscheinend.

Zu Beginn ihrer Isolierung können sie durch Immunhistochemie näher charakterisiert werden, um ihre Expression von Stammzellmarkern wie Stammzelle, Antigen eins und CDC 34 nachzuweisen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Stammzellen aus einer zweiten Masse der Maus isoliert. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, Steroide während aller Schritte beizubehalten.

Nachdem die Stammzelle isoliert wurde, sollten diese Zellen in geringer Dichte kultiviert werden, um die Stammzell-Eigenschaften der Zellen zu erhalten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment. Ich wünsche Ihnen viel Glück, dies in Ihrem Experiment anzuwenden.

Vielen Dank.