Isolating Stammzellen aus Soft-Gewebe des Bewegungsapparates

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, adulte Stammzellen aus muskuloskelettalen Weichteilen wie der Skelettmuskulatur zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Biopsie des Weichgewebes entnommen, entbridet und fein gehackt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gewebe enzymatisch zu verdauen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Stammzellen durch wiederholte Vorbeschichtungsschritte zu isolieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Identifizierung der isolierten Stammzellen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die das morphologische und zelluläre Verhalten der Zellen mittels Immunfluoreszenz, Mikroskopie und/oder Durchflusszytometrie zeigen.

Hallo, ich bin y Lee vom Labor für Molekulare Pathologie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der University of Pittsburgh. Heute zeige ich Ihnen, wie Sie eine adulte Stammzelle aus den Weichteilen des Muskelskelettsystems wie der Skelettmuskulatur isolieren können. Hallo, ich bin Dr. Johnny Ward.

Ich bin Professor an der University of Pittsburgh School of Medicine in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie. Ich habe eng mit Dr. Young Lee zusammengearbeitet und diese Verfahren dienen dazu, verschiedene Arten von Stammzellen aus der Skelettmuskulatur zu isolieren und Gewebe wie das Standardgewebe zu verändern. Wir verwenden die Verfahren in unserem Labor, um Stammzellen für grundlegende Forschungsstudien zu den Anwendungen der translationalen Medizin zu isolieren.

Also lasst uns studieren. Zu den Geweben, aus denen Stammzellen isoliert werden können, gehören Sehnen und Skelettmuskeln, die aus den Tibia- oder Soleus-Muskeln der Hintergliedmaßen von Wildtyp-Mäusen entnommen wurden. Legen Sie nach der Entfernung von Haut- und Knochenresten das Taschentuch in eine Schale, die kaltes HBSS enthält, das mit 5% FBS ergänzt ist.

Legen Sie das Taschentuch anschließend separat auf mit Kollagen überzogene Schalen, die kaltes HBSS enthalten. Wir werden Skelettmuskelgewebe verwenden, um die grundlegenden Verfahren zur Dissoziation und Verdauung des Gewebes zu demonstrieren. Verwenden Sie eine Mikroschere und/oder Skalpellklingen, um das Skelettgewebe zu einer groben Aufschlämmung zu zerkleinern, die einen pH-Wert aufweist und eine enzymatische Verdauung des Gewebes ermöglicht.

Beginnen Sie damit, die MIT-Gewebeschlämme in separate 15-Milliliter-Röhrchen zu überführen, die fünf Minuten lang bei etwa 3.500 U/min bei vier Grad Celsius zentrifugiert werden. Entfernen Sie die SANE-Waschung, indem Sie ein HBSS mit Resus aufhängen, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Nach dem Entfernen des Supernats verdauen Sie die Schlämme, indem Sie 10 Milliliter prewarm.0,2%Kollagenase hinzufügen.

Typ 11 inkubiert 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und schüttelt die Röhrchen alle 10 Minuten von Hand, wenn die 60-minütige Inkubation beendet ist. Zentrifugieren Sie die Schlämme und resuspendieren Sie sie dann in 10 Millilitern DYS-Raumlösung. Inkubieren Sie 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie alle 10 Minuten von Hand, nachdem die 45-minütige Inkubationszentrifuge und die Wiederbelebung die Schlämme in 10 Millilitern mit 0,2%-Trips in HBSS-Lösung suspendiert haben.

Wir inkubieren in der Regel 15 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius, während wir die Röhrchen alle 10 Minuten umdrehen, die Inkubation ist abgeschlossen. Wenn genügend Einzelzellen aus dem Gewebe freigesetzt werden, wie hier dargestellt, zentrifugieren Sie die resultierenden Zellen und reancieren Sie das Zellpellet in einer Proliferationsphase von fünf Millilitern. Medium PM dissoziiert die Zellsuspension, indem der Extrakt durch eine Reihe von Nadeln zweimal durch eine 18-Gauge-Nadel, dann einmal durch eine 23-Gauge-Nadel und schließlich einmal durch eine 27-Gauge-Nadel geleitet wird.

Zum Schluss wird der Zellextrakt durch ein 70-Mikron-Zellsieb geleitet, um mit der Vorbereitungstechnik zu beginnen. Zentrifugieren Sie den gerade hergestellten Zellextrakt und resuspendieren Sie die Pellets in der Proliferation. Medium Fünf Milliliter des Zellgemisches auf einen mit Kollagen überzogenen T 25-Kolben geben und als PP vermarkten, der in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wurde.

Nach zwei Stunden. Die nicht adhärenten Zellen werden in einen neuen, mit Kollagen überzogenen T 25-Kolben überführt und als PP zwei vermarktet. Geben Sie fünf Milliliter PM in den vorherigen Behälter T 25 mit der Bezeichnung PP one.

Beide Kolben für 24 Stunden wieder in den Inkubator stellen. Nach 24 Stunden werden nicht adhärente Zellen von PP zwei in einen neuen mit Kollagen ENC beschichteten T 25-Kolben überführt und als PP drei markiert. Fünf Milliliter Proliferationsmedium werden in den Kolben mit der Bezeichnung PP zwei gegeben.

Setzen Sie die Kolben wieder in den Inkubator ein. Wiederholen Sie den Vorgang alle 24 Stunden, bis die Population PP sechs erreicht ist. Die Stammzellpopulation wird erstellt.

Die isolierten PP-Sechs-Zellen sind sehr klein und müssen in FBS-reichem Proliferationsmedium aufbewahrt werden. Das hat sich täglich geändert. Obwohl die meisten Zellen in der PP-Sechs-Kultur in den folgenden ein bis zwei Wochen der Kultivierung absterben.

Eine große, gesunde PP six-Population entsteht in der Regel nach ein bis zwei Wochen zusätzlicher Expansion. Pflegen Sie auch alle anderen Gruppen suspendierter Zellen, lassen Sie sie sich vermehren und untersuchen Sie sie regelmäßig mit einem inversen Mikroskop. Die früh anhaftenden Zellen, die an die PP Eins- und PP Zweikolben anheften, sind meist fibrotische Zellen.

Zellen, die nach längerer Zeit innerhalb von 48 bis 96 Stunden an kollagenbeschichteten Kolben haften. PP drei und PP vier sind hauptsächlich Myoblasten. Während Muskelsatellitenzellen häufig vor allem in PP fünf zu sehen sind, gelten die späteren Präplzellen 96 Stunden oder später PP sechs als adulte Stammzellen und erscheinen klein, rund und durchscheinend.

Zu Beginn ihrer Isolierung können sie immunhistochemisch weiter für ihre Expression von Stammzellmarkern wie Stammzell, Antigen 1 und CDC 34 charakterisiert werden. Wir zeigen Ihnen gerade, wie Sie Stammzellen aus einer zweiten Masse der Maus isolieren können. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, das Steroid während aller Eingriffe aufrechtzuerhalten.

Sobald die Stammzelle isoliert wurde, stellen Sie sicher, dass diese Zellen mit geringer Dichte kultiviert werden, um die Stammzelleigenschaften der Zellen zu erhalten. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück mit Ihrer Erfahrung Und ich wünsche Ihnen viel Glück beim Versuch, dies in Ihrem Experiment zu verwenden.

Vielen Dank.