Name: Isolating Stammzellen aus Soft-Gewebe des Bewegungsapparates (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung adulter Stammzellen aus Skelettmuskelgewebe durch Biopsie, enzymatische Verdauung und wiederholtes Pre-Plating. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Verhaltensweisen mittels Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie.

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Die Autoren sind dankbar für die Frau Haiying Pan und Herr Ian Bellayr für die technische Hilfe auf Zellisolation für den aktuellen Filmen und Mr. Kyle Holden und Mr. Jonathan Lucas für ihre Hilfe auf Folie bearbeiten. Vielen Dank an die folgende Liste von Personen, die mit der Entwicklung der modifizierten Vorbeschichtungszyklus Techniken in den letzten Jahren beteiligt waren: Drs. Burhan Gharaibeh, Baohong Cao, Deasy Bridget, Thomas R. Payne, Aiping Lu, Hairong Peng, Hideki Oshima, Bo Zeng, Xiaodong Mu, Kimimasa Tobita, Ron Jankowski, Makato Ikezawa. Wir sind dankbar für die technische Unterstützung von James H. Cummins, Ryan Pruchnic, Joseph Feduska, Rebecca C. Schugar, Haiying Pan und Jessica Tebbets. Der Autor möchte auch die finanzielle Unterstützung für diese Arbeit von der Gesellschaft für Muskeldystrophie (MDA), der National Institutes of Health (NIH), das Department of Defense (DOD), dem Kinderkrankenhaus von Pittsburgh von UPMC, das Department of anerkennen Orthopädische Chirurgie und der University of Pittsburgh.

In der Regel erfordert die vollständige geändert Vorbeschichtungszyklus Verfahren 1-2 Tage Vorbereitung, 1 Woche für die Durchführung der technischen Verfahren, 2-3 Tage der Zelle Identifikation mit Immunzytochemie, und eine zusätzliche 2-3 Wochen von Stammzellen Bevölkerung Expansion. Die Ausrüstung für die Stammzell-Kultur erforderlich sind, ähnlich wie bei anderen Zellkulturen, die eine Tischzentrifuge, CO 2-Inkubator, Laminar Flow Gewebekultur Kapuze und einem inversen Mikroskop mit Fluoreszenz-und einer digitalen Kamera ausgestattet sind. Die isolierten Stammzellen können auch geklont werden können und langfristig aufbewahrt in flüssigem Stickstoff für die aktuelle und zukünftige Studien 1,2 sein. Alle Reagenzien und Materialien für dieses Verfahren verwendet werden, müssen steril sein und behandelt aseptisch. Schritt 1: Vorbereitung <ol><li> Collagen Mantel Gewebekulturschalen und Flaschen: Typ I Kollagen aus Kalbsleder (0,1 g in 1 Liter; Sigma-Aldrich) abgeleitet. Die Kunststoffprodukte zu beschichten sind: T-25 Flaschen, 6 oder 12-Well-Platten, Geschirr (60 und 100 mm, BD Falcon) nach wie vor 1,2 beschrieben. Schütteln Sie die Kunststoffprodukte jede halbe Stunde, 4 Stunden auf eine gleichmäßige Beschichtung des Kollagens zu gewährleisten. Das Kollagen wird dann entfernt. Und die beschichtete Kunststoffprodukte ist dann erlaubt, in der Gewebekultur Kapuze mit dem UV-Licht und die Haube sowohl auf trockenen, um die Sterilität zu gewährleisten, und schließlich wieder verschlossen oder abgedeckt für eine spätere Verwendung. </li><li> Bereiten Zellkulturmedium: 400ml DMEM (DMEM, hohe Glukose; Invitrogen), 50 mL Hitze inaktiviertes fötales Rinderserum (FBS, Invitrogen), 50 mL Pferdeserum (HS, Invitrogen) und 5 mL Hühnerembryo-Extrakt (CEE; Accurate Chemical Co. ) wird im Vakuum filtriert mit einem Einweg 0,22-um 500-ml sterile Filter-System (Corning) werden. Sterile Penicillin / Streptomycin-Lösung (Invitrogen) wird schließlich 100 Einheiten / ml zugesetzt werden. Die hergestellten Lösungen können bei 4 ° C für mindestens einen Monat gelagert werden. Diese Lösung wird verwendet, um die Zellen aus der Flasche lösen beim Aufteilen Kulturen oder der Vorbereitung der Zellen zur Transplantation. </li><li> Warm up-Lösungen für die Zell-Trennung: Die folgenden Reagenzien müssen bis zu 37 ° C erwärmt werden vor ihrem Einsatz für die Zell-Trennung: Hanks Salzlösung (HBSS, Invitrogen), 0,2% (wt / vol) Kollagenase Typ XI (Sigma -Aldrich), mit einem Durchschnitt von 3.200 Kollagen Verdauung Einheiten pro ml HBSS; Dispase 2,4 units/1mL (Invitrogen), 0,5% (wt / vol) Trypsin (Invitrogen). </li><li> Sterilisieren chirurgische Geräte in Vorbereitung: Chirurgischer Eingriff erfordern sterile OP-Instrumente, einschließlich: unterschiedlich große Zange, Mikro-Schere, Schere Iris und / oder Skalpellklingen. Zusätzlich, 15 und 50-mL Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (BD Falcon); Zellsieb (Porengröße 70 m) (BD Falcon), 18 -, 23 - und 27-Gauge-Nadeln (BD PrecisionGlide) und 10 - oder 20-ml sterile Spritzen (BD). </li></ol> Schritt 2: Gewebeproben, Isolation und mechanischen Dissoziation 1-4 Die Gewebeproben werden unter einer sterilen Abzug durchgeführt und beinhalten frisch geernteten Sehnen und Muskulatur werden aus der Tibia oder soleus Muskeln der hinteren Gliedmaßen von Wildtyp-Mäusen (weiblich C57BL/6J, 4-5 Wochen alt oder jünger, Jackson erhalten Laboratory). Jede sichtbare Bindegewebe, Blutgefäße und Fettgewebe werden dann von der Biopsie-Proben entnommen. Die Gewebe der Sehnen und Muskeln werden dann vorsichtig unter einem chirurgischen Präpariermikroskop um Reste von Haut und Knochen entfernen identifiziert und in eine Schüssel mit kaltem (4 ° C) HBSS (ergänzt durch Zusatz von 5% der FBS). Die isolierten Gewebe werden dann separat auf Kollagen beschichtete Platten mit kaltem HBSS gelegt und wird zerkleinert (&lt;1x1 mm 3) in einem groben Brei mit Mikro-Schere und / oder Skalpellklingen werden. Schritt 3: Enzymatische Verdauung der Gewebe: Das zerkleinerte Gewebe wird dann enzymatisch gespalten durch eine Reihe von Schritten 2,4,5 <ol><li> Übertragen Sie die zerkleinerten Gewebes Schlämmen in einzelne 15-ml-Tuben und Zentrifuge bei ~ 3500 rpm bei 4 ° C für 5 Minuten. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit HBSS gewaschen und wiederholen Sie die Zentrifugation erneut. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und verdauen diese Schlämme durch Zugabe von 10 ml vorgewärmtem 0,2% Kollagenase Typ XI (Sigma). Inkubieren für 60 Minuten bei 37 ° C unter ständigem vorsichtiges Schwenken der Röhrchen. Alternativ kann durch die Hand zu schütteln alle 10 min. </li><li> Zentrifuge und resuspendieren diese Schlämme in 10 ml Dispase (2,4 Einheiten / ml, Gibco)-Lösung. Inkubieren für 45 Minuten bei 37 ° C, Schütteln mit der Hand oder sanft schaukelnden alle 10 min. </li><li> Zentrifuge und resuspendieren diese Schlämme in 10 ml 0,2% Trypsin HBSS-Lösung. Inkubation wird basierend auf dem Ausmaß, in dem die einzelnen Zellen aus dem Gewebe, das durch die Beobachtung der Aufhängung unter dem Mikroskop durchgeführt werden können freigesetzt werden, variieren. Es ist nicht zu empfehlen, 30 Minuten bei 37 ° C überschreiten mit Umdrehen der Röhrchen oder sanft schaukelnden alle 10 min. </li><li> Centrifuge die resultierende Zelles und Resuspension des Zellpellets in 10 ml Medium Proliferation (PM). </li><li> Dissoziieren die Zellsuspension, indem der Extrakt durch eine Reihe von Nadeln. Die Zellen werden dann 2 mal durch eine 18G weitergegeben, dann 23G, und schließlich eine 27G Nadel. </li><li> Pass der Zellextrakt durch eine 70-um Zellsieb. </li></ol> Schritt 4: Preplating unterschiedliche Zellpopulationen auf die Zelladhäsion bei 1-3 basiert isolieren <ol><li> Zentrifuge und resuspendieren die Zellpellets in Proliferation Medium. </li><li> Platte der Zelle Mischungen auf eine Kollagen-beschichtete T-25-Kolben (oder 60 mm-Schale) und markieren Sie ihn als PP1. Die Zellsuspension sollte besitzt eine große Anzahl von brechenden Kernen und andere Ablagerungen unter dem Mikroskop beobachtet werden. </li><li> Bei 37 ° C in einer befeuchteten, 5% CO 2-Inkubator für 2 Stunden. </li><li> Transfer nicht anhaftenden Zellen zu einem neuen Collagen-beschichteten T-25-Kolben (oder 60 mm-Schale) und markieren Sie als PP2. 5 ml PM in die Platte gekennzeichnet PP1. Die frühen anhaftenden Zellen, die in den Kolben befestigen sind meist Myofibroblasten 3. </li><li> Bringen Sie den Kolben in den Inkubator für weitere 24 Stunden, Transfer nicht anhaftenden Zellen zu einem neuen Collagen-beschichteten T-25-Kolben (oder Gericht) und markieren Sie ihn als PP3. 5 ml Medium Proliferation in der Platte bezeichnet PP2. Diese anhaftenden Zellen, die zu dieser Kolben befestigen sind meist Fibroblasten 2,3. </li><li> Zurück Flaschen in den Inkubator und wiederholen Sie den Vorgang in einem anderen 24 Stunden, bis der Bevölkerung PP6 erstellt. Halten Sie jede Gruppe von suspendierten Zellen und lassen sie sich zu vermehren und untersuchte sie regelmäßig mit einem inversen Mikroskop. PP3-PP4 sind meist Myoblasten während Muskel-Satelliten-Zellen sind oft vor allem in PP5 2 zu sehen. </li><li> Die meisten der langsam anhaftenden Zellen in der Regel durch PP6 befestigen. In diesem Stadium erscheinen die Zellen kleine, runde, Lichtbrechung und sind sehr spärlich an Zahl und gelten als eine Stammzelle Bevölkerung 1,2 sein. </li></ol> Schritt 5: Identifizierung und Ausbau von isolierten Stammzellen <ol><li> Die isolierte PP6 Zellen sind sehr gering an Zahl und müssen in FBS reiche Proliferation Medium (20% FBS in DMEM), die täglich gewechselt beibehalten werden. Die meisten Zellen im PP6 Kultur sterben in den folgenden 1-2 Wochen der Kultivierung, sondern eine große, gesunde PP6 Bevölkerung ist in der Regel nach einer weiteren 1-2 Wochen nach der Erweiterung geschaffen. Die Stammzellen aus Mäusen isoliert hoch ausdrückliche Stammzellen-Antigen 1 (SCA1), CD34, fetale Leber-Kinase 1 (Flk1) und andere Stammzellen Marker 1,2,6,7, die visualisiert werden über immunzytochemische Färbung kann. Diese Stammzellen weisen auch mehrere Differenzierung Kapazitäten 3,6,8. </li><li> Die isolierten Zellen werden gepflegt und ausgebaut zu einem niedrigen Zelldichte in der Kultur (12-Well-Schalen bei 50-100 Zellen / Well oder &lt;20-30% Konfluenz in der Flasche oder Schale), die Differenzierung 1,2 zu vermeiden. Sehr wenige Zellen bilden Klone während der Expansion, und diese geklonten Stammzellen können lange Zeit Proliferation (LTP) für jeden anderen Kompetenz-Studien unterzogen. Das geklonte Stammzellen auch speichern kann in flüssigem Stickstoff mit allgemeinen Zelle Speicherung Verfahren, z. B. PM-Medium mit 10% DMSO. Machen Sie eine Reihe von niedrigen Durchgang Aktien der Stammzellen für alle anderen Backup-Studien. </li></ol>

<ol><li>Gharaibeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qu-Petersen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+population+of+muscle+stem+cells+in+mice%3A+potential+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration.</a> J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).</li>
<li>Li, Y. &amp, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+muscle-derived+cells+into+myofibroblasts+in+injured+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle.</a> Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).</li>
<li>Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &amp, Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+donor+muscle+precursor+cells+into+an+area+of+muscle+regeneration+in+the+host+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse.</a> J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).</li>
<li>Lu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myogenic+progenitor+populations+from+Pax7-deficient+skeletal+muscle+based+on+adhesion+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics.</a> Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+muscle-derived+cells+capable+of+enhancing+muscle+regeneration+and+bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing.</a> J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).</li>
<li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptors+in+the+maturation-dependent+adenoviral+transduction+of+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers.</a> Gene Ther. 8, 627-637 (2001).</li>
<li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells+differentiate+into+haematopoietic+lineages+but+retain+myogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential.</a> Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).</li>
<li>Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+based+on+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Musculoskelet+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine based on muscle stem cells.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).</li>
<li>Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &amp, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+for+the+musculoskeletal+system+based+on+muscle-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Orthop+Surg%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells.</a> J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).</li>
</ol>

Es wurde erkannt, dass einige adulten Geweben mehrere Stammzellen enthalten. In den letzten Jahren des Studiums, haben Stammzellen in das weiche Gewebe des Bewegungsapparates, einschließlich Skelettmuskel und Sehne festgestellt. Das aktuelle Protokoll Einzelheiten eines Verfahrens, wie die modifizierte Vorbeschichtungszyklus Technik, die bereits erfolgreich in unserem Labor verwendet werden, um adulte Stammzellen aus Sehnen und Skelettmuskulatur zu isolieren bekannt. Mit dem modifizierten Vorbeschichtungszyklus Technik ...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11995-073</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes Pferdeserum</td><td>Invitrogen</td><td>#26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Hühnerembryonal-Extrakt</td><td>Accurate Chemical</td><td>#CE650T-10</td><td></td></tr><tr><td>100 U/ml Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS</td><td>Invitrogen</td><td>#14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Hank’s Pufferlösung mit Salz</td><td>Invitrogen</td><td>#24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ XI 0,2 % (Gewicht/Volumen)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C7657</td><td></td></tr><tr><td>Dispase 2,4 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>#17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,5 % (Gewicht/Volumen) (10x; 5 g/Liter Trypsin (1:250))</td><td>Invitrogen</td><td>#15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen zur Beschichtung von Kolben: Typ I-Kollagen aus Kälberhaut, 0,1 g/Liter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C-9791</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>#D-2650</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating stammzellen aus soft-gewebe des bewegungsapparates

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

Adulte Stammzellen sind seit langem in Bezug auf ihre Anwendung in der regenerativen Medizin diskutiert. Adulte Stammzellen haben eine große Aufregung für die Behandlung von verletzten und erkrankten Geweben durch ihre beeindruckenden Fähigkeiten, um multi-lineage Zelldifferenzierung und ihre Selbst-Erneuerung unterzogen Fähigkeit generiert. Am wichtigsten ist, haben diese Eigenschaften machten sie vorteilhaft für die Verwendung bei der autologen Stammzelltransplantation Therapien. Das aktuelle Protokoll wird der Leser auf die veränderten Vorbeschichtungszyklus Technik, bei der Weichteile des Bewegungsapparates, zB Sehnen und Muskeln, sind 1 einführen<sup&gt; St</sup&gt; Enzymatisch gespalten und dann in Kollagen beschichtet Kolben mit Medium. Der Überstand, der mittleren und die restlichen schwimmenden Zellen zusammengesetzt ist, ist seriell übertragen täglich zu neuen Flaschen. Die Stammzellen sind die langsamsten auf die Kolben, welche dauert in der Regel beträgt 5-7 Tage (serielle Übertragungen oder preplates) einzuhalten. Durch den Einsatz dieser Technik, präsentieren adulten Stammzellen in diesen Geweben kann leicht durch relativ nicht-invasive Verfahren gewonnen werden.

Isolating adulten Stammzellen aus Muskel-Skelett Weichteile auf der Grundlage der Zelle Einhaltung Geschwindigkeit Kolben.

Isolating Stammzellen aus Soft-Gewebe des Bewegungsapparates

Adulte Stammzellen werden seit langem im Hinblick auf ihre Anwendung in der regenerativen Medizin diskutiert. Adulte Stammzellen haben ein großes Maß an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, adulte Stammzellen aus weichen muskuloskelettalen Geweben wie dem Skelettmuskel zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Biopsie des Weichgewebes entnommen, dieses gereinigt und fein zerkleinert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der enzymatischen Verdauung des Gewebes.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Stammzellen durch wiederholte Vorplattierungsschritte zu isolieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Identifizierung der isolierten Stammzellen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die das morphologische und zelluläre Verhalten der Zellen mittels Immunfluoreszenz, Mikroskopie und/oder Durchflusszytometrie zeigen.Hallo, ich bin y Lee vom Labor für Molekularpathologie der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Universität von Pittsburgh. Heute zeige ich Ihnen, wie man eine adulte Stammzelle aus den Weichgeweben des Muskel-Skelettsystems, wie beispielsweise dem Skelettmuskel, isoliert. Hallo, ich bin Dr. Johnny Ward.Ich bin Professor an der University of Pittsburgh School of Medicine im Fachbereich Orthopädische Chirurgie. Ich arbeite eng mit Dr. Young Lee zusammen und beschäftige mich mit diesen Verfahren zur Isolierung verschiedener Arten von Stammzellen aus Skelettmuskel- und anderen Geweben wie beispielsweise Standardgewebe. In unserem Labor verwenden wir diese Verfahren zur Isolierung von Stammzellen für grundlegende Forschungsstudien zu Anwendungen in der translationalen Medizin.Beginnen wir mit der Untersuchung. Zu den Geweben, aus denen Stammzellen isoliert werden können, gehören Sehnen und Skelettmuskeln, die aus der Tibia oder den Soleusmuskeln der Hintergliedmaßen von Wildtyp-Mäusen gewonnen wurden. Nach Entfernung von Haut- und Knochenresten werden die Gewebe in eine Schale mit kaltem HBSS, ergänzt mit 5 % FBS, gegeben.Als Nächstes geben Sie das Gewebe getrennt auf mit Kollagen beschichtete Schalen, die kalte HBSS enthalten. Wir verwenden Skelettmuskelgewebe, um die grundlegenden Verfahren für die Gewebe-Dissociation und -Verdauung zu demonstrieren. Verwenden Sie Mikroscheren und/oder Skalpellklingen, um das Skelettgewebe zu einem groben Brei zu zerkleinern, der der enzymatischen Verdauung unterzogen wird.Überführen Sie zunächst die MIT-Gewebesuspensionen in separate 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie diese bei etwa 3.500 U/min bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie die SANE-Waschlösung, indem Sie das Pellet in HBSS resuspendieren, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Nach dem Absaugen des Überstandes verdauen Sie die Suspensionen durch Zugabe von 10 Milliliter vorgewärmter 0,2 %iger Kollagenase.Typ 11 für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, dabei die Röhrchen alle 10 Minuten von Hand schütteln. Nach Ablauf der 60-minütigen Inkubation zentrifugieren und die Suspensionen in 10 Milliliter DYS-Lösung resuspendieren. 45 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, dabei alle 10 Minuten von Hand schütteln. Nach der 45-minütigen Inkubation zentrifugieren und die Suspensionen in 10 Milliliter 0,2 % Trips in HBSS-Lösung resuspendieren.Wir inkubieren normalerweise 15 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius, wobei die Röhrchen alle 10 Minuten invertiert werden; die Inkubation ist dann abgeschlossen. Wenn genügend Einzelzellen aus dem Gewebe freigesetzt wurden, wie hier dargestellt, zentrifugieren Sie die resultierenden Zellen und resuspendieren das Zellpellet in fünf Milliliter Proliferationsmedium PM. Dissoziiere die Zellsuspension, indem du das Extrakt zweimal durch eine 18-Gauge-Nadel, dann einmal durch eine 23-Gauge-Nadel und schließlich einmal durch eine 27-Gauge-Nadel leitest.Zuletzt wird der Zellextrakt durch einen 70-Mikron-Zellsieb geleitet, um die PräPL-Technik zu beginnen. Zentrifugieren Sie den gerade hergestellten Zellextrakt und resuspendieren Sie die Pellets in Proliferationsmedium. Geben Sie fünf Milliliter der Zellsuspension auf einen mit Kollagen beschichteten T-25-Flasche und kennzeichnen Sie diese als PP1; inkubieren Sie sie 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5-%-CO₂-Inkubator für zwei Stunden.Nach zwei Stunden werden die nicht-anklebenden Zellen in einen neuen, mit Kollagen beschichteten T25-Flasche überführt und als PP zwei bezeichnet. Fügen Sie fünf Milliliter PM in die vorherige T25-Flasche, die als PP eins gekennzeichnet ist.Stellen Sie beide Kolben für 24 Stunden zurück in den Inkubator. Nach 24 Stunden überführen Sie die nicht-angewachsenen Zellen von PP zwei in einen neuen, mit kollagenem ENC beschichteten T-25-Kolben, und kennzeichnen Sie diesen als PP drei. Geben Sie fünf Milliliter Proliferationsmedium in den als PP zwei gekennzeichneten Kolben. Stellen Sie die Kolben zurück in den Inkubator. Wiederholen Sie den Vorgang alle 24 Stunden, bis zur Population PP sechs. Die Stammzellpopulation wird erzeugt.Die isolierten PP6-Zellen sind zahlenmäßig sehr gering und müssen in einem FBS-reichen Proliferationsmedium gehalten werden, das täglich gewechselt wird. Obwohl die meisten Zellen in der PP6-Kultur während der folgenden ein bis zwei Wochen Kultivierung absterben werden.Eine große, gesunde PP-sechs-Bevölkerung wird normalerweise nach einer zusätzlichen ein- bis zweiwöchigen Expansion erzeugt. Pflegen Sie alle anderen Gruppen suspendierter Zellen ebenso, indem Sie sie proliferieren lassen und sie regelmäßig mit einem umgekehrten Mikroskop untersuchen. Die früh anhaftenden Zellen, die sich an den PP-eins- und PP-zwei-Flaschen anlagern, sind hauptsächlich fibrotische Zellen.Zellen, die an kollagenbeschichteten Kolben haften, nach einem längeren Zeitraum innerhalb von 48 bis 96 Stunden. PP drei und PP vier bestehen hauptsächlich aus Myoblasten. Während Muskel-Satellitenzellen häufig vor allem in PP fünf zu finden sind, gelten die späteren Vorläuferzellen nach 96 Stunden oder später, PP sechs, als adulte Stammzellen und erscheinen klein, rund und durchscheinend.Zu Beginn ihrer Isolierung können sie durch Immunhistochemie näher charakterisiert werden, um ihre Expression von Stammzellmarkern wie Stammzelle, Antigen eins und CDC 34 nachzuweisen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Stammzellen aus einer zweiten Masse der Maus isoliert. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, Steroide während aller Schritte beizubehalten.Nachdem die Stammzelle isoliert wurde, sollten diese Zellen in geringer Dichte kultiviert werden, um die Stammzell-Eigenschaften der Zellen zu erhalten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment. Ich wünsche Ihnen viel Glück, dies in Ihrem Experiment anzuwenden.Vielen Dank.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt, wie Mikro-sezieren den Dottersack und Aorta-Gonaden-Mesonephros Region aus Embryonen und die Verwendung der Durchflusszytometrie, um hämatopoetische Stammzellen zu sortieren.

Isolierung von Anfang hämatopoetischen Stammzellen aus Murine Dottersack und AGM

Die Mikro-seziert Explantate Technik ist eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung proliferative Skelettmuskelzellen von Jugendkriminalität, adulte oder embryonale Muskeln als eine Quelle der Skelettmuskulatur Stammzellen. Einzigartig sind diese Zellen klonal abgeleitet, um Skelettmuskulatur Stammzelllinien für in vivo-Transplantation verwendet produzieren.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Die Isolierung und Kultur einer reinen Population von ruhenden Satellitenzellen, eine Muskelstammzellpopulation, ist wesentlich für das Verständnis der Muskelstammzelle Biologie und Regeneration sowie Stammzelltransplantation bei Therapien Muskeldystrophie und anderen degenerativen Erkrankungen.

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Blutgefäße innerhalb der menschlichen Skelettmuskulatur Hafen mehrere Multi-Linie Vorläuferpopulationen, die sich ideal für die regenerative Anwendungen sind. Dieses Isolierungsverfahren ermöglicht die gleichzeitige Reinigung von drei multiVorläuferZellPopulationen jeweils drei Strukturschichten der Blutgefäße: myogenen Endothelzellen aus Intima, Perizyten von Medien und Adventitia-Zellen von Adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Isolierung lebender Zellen und zur Primärkultur von myogenen und Fibroblasten-Zelllinien aus Muskel- oder Hautgewebe.  Auch eine Technik zur Immortalisierung dieser Zelllinien wird beschrieben.  Insgesamt bieten diese Protokolle ein zuverlässiges Werkzeug zur Erzeugung und Konservierung von patienteneigenen Zellen für nachgelagerte Anwendungen.

Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

Die genaue Identifizierung von fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) und Muskelstammzellen (MuSCs) ist entscheidend für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Isolierung, Reinigung und Kultur von FAPs und MuSCs aus erwachsenen Mausmuskeln.

FACS-Isolierung und Kultur von fibro-adipogene Vorläuferzellen und Muskelstammzellen aus ungestörten und verletzten Maus-Skelettmuskeln

Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von langfristigen hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSCs) und Kurzzeit-HSCs (ST-HSCs) mit dem Hoxb5-Reportersystem vor.

Isolationsmethode für lang- und kurzfristige hämatopoetische Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Muskelstammzellen und fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus einzelnen Skelettmuskeln bei Mäusen. Das Protokoll umfasst die Dissektion einzelner Muskeln, die Isolierung von Stammzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, die Reinheitsbewertung durch Immunfluoreszenzfärbung und die quantitative Messung des S-Phaseneintritts mittels 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin-Inkorporationsassay.

Isolierung ruhender Stammzellpopulationen aus einzelnen Skelettmuskeln

Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Isolierung und Anreicherung primärer Myoblasten aus adulten und neonatalen Mausskelettmuskeln durch Gewebedissoziation, sequentielle Filtration, Präplattierung und definierte Kulturbedingungen, wodurch die Etablierung und Pflege von satellitenzellbasierten Myoblastkulturen für nachgelagerte experimentelle Anwendungen ermöglicht wird.

Isolierung von Skelettmuskel-Satellitenzellen für In-vitro-Myogenese-Studien

Erfahren Sie die Isolierung adulter Stammzellen aus Skelettmuskelgewebe durch Biopsie, enzymatische Verdauung und wiederholtes Pre-Plating. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Verhaltensweisen mittels Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie.

Isolating Stammzellen aus Soft-Gewebe des Bewegungsapparates

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