Encyclopedia of Experiments: Biology
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-为了准备注射, 使用蠕虫采摘在糖垫上铺设卤烃油的轨迹。将蠕虫放在油中,轻轻将蠕虫推上护垫,使其固定。 确保油完全覆盖动物。 它允许氧气进入蠕虫,同时防止干燥。 接下来,将阿加罗斯垫放在注射显微镜上,将针头垂直于蠕虫,瞄准性腺手臂的末端。
轻轻将针头穿过角质层,用核酸或复合物注射性腺手臂。每个性腺手臂都含有一种生殖系同步物,这种同步物会发展成单个卵母细胞。注入腹膜性腺的材料将被纳入这些卵母细胞中,影响下一代。
注射蠕虫后,用M9缓冲器代替油。一旦蠕虫开始移动,将它们转移到含有细菌食物的NGM agar板。在下列协议中,性腺微注射法用于提供Cas9复合物,以瞄准和编辑dpy-10基因。
-从文本协议中描述的C. elegans 和 agarose 垫的准备开始。放置一个阿加罗斯注射垫, 盖滑到解剖范围。 使用蠕虫选择沿着垫子的一边铺设一小块卤素油轨道。 然后,使用涂有油的蠕虫采摘将几只蠕虫从NG agar板上提起并放入油轨中。细毛附着在移液器上,如睫毛或猫须,将蠕虫平行放置,轻轻地将蠕虫推入阿加罗斯垫。 直到舒适的微注射程序,只有一次安装并注射一个蠕虫。
一旦到位并连接到垫子上,用从蠕虫采摘尖上再滴几滴卤烃油覆盖蠕虫。将带安装的蠕虫的盖子滑移到注射显微镜上。在低放大倍度下,将蠕虫垂直于注射针,针头已充满 RNP解决方案,如文本协议所述。
切换到高放大倍数并重新定位与性腺手臂相邻的针头,对应于中后期核附近的区域。 使用微脉冲器,将针头移向蠕虫,稍微压碎角质层。 然后,用一只手轻点显微镜阶段的一侧,将针头击穿角质层。 打压注射踏板或按钮,慢慢填充到性腺手臂与注射混合,并删除针头。 用另一只性腺手臂重复步骤。
注入蠕虫后,取出结节垫中的盖片,放在解剖显微镜下。使用拉毛细管移液器,通过在蠕虫身上输送M9缓冲器来取代蠕虫的油。执行此处理以释放来自阿加的蠕虫。 10分钟后,当蠕虫在缓冲区中四处游荡时,使用拉毛细管移液器将它们移动到带有OP50细菌的NG agar板。将板放在摄氏20度的地方两到三个小时,直到蠕虫恢复并四处移动。一旦恢复,将蠕虫单独转移到NG然后,将板转移到25摄氏度的孵化器。