Mechanische Dissoziation: Eine Methode, um lebensfähige Zellen aus einem Gewebe zu gewinnen

Wiegen Sie zunächst ein Gewebefragment und messen Sie dessen Länge, Breite und Höhe. Legen Sie das Gewebe in eine Kulturschale mit einem Nährmedium und zerkleinern Sie es mit einem Skalpell in kleine Stücke. Übertragen Sie alles zur Homogenisierung mit einer Pasteurpipette in ein C-Röhrchen.

Legen Sie das Rohr in einen mechanischen Dissoziator und führen Sie die Zyklen nach Bedarf durch. Die Apparatur nutzt mechanische Kräfte, um lebensfähige Einzelzellen aus der Gewebeprobe zu extrahieren und gleichzeitig die zelluläre Integrität, einschließlich der Oberflächenproteine, zu erhalten. Dekantieren Sie das Homogenat durch ein Zellsieb, das auf einem Zentrifugenröhrchen befestigt ist.

Rehomogenisieren Sie das restliche Gewebe und seihen Sie das Homogenat durch das Zellsieb in das Röhrchen ab. Das Homogenat zentrifugieren und den Überstand entfernen. Suspendieren Sie nun das Zellpellet wieder im Kulturmedium und geben Sie eine kleine Menge der Zellsuspension in ein Röhrchen mit Trypanblau-Färbung

Nach der Färbung werden die Zellen auf einen Objektträger für das Hämozytometer übertragen. Zählen Sie die transparenten lebensfähigen Zellen. Die abgestorbenen Zellen nehmen den Fleck auf, da ihre Zellmembran nicht intakt ist. Im folgenden Protokoll führen wir eine nicht-enzymatische Dissoziation von frischem humanem Gewebe für die quantitative und qualitative Analyse von CD45+-Zellen durch.

- Beginnen Sie mit dem Wiegen der Gewebeprobe und messen Sie dann die Länge, Breite und Höhe des Gewebes. Dann überführen Sie das Gewebefragment in eine kleine Petrischale, die 1 Milliliter des entsprechenden chemisch definierten, serumfreien, hämatopoetischen Zellmediums enthält, und zerkleinern die Proben mit einem sterilen Skalpell in kleine 1 bis 2 Quadratmillimeter große Stücke. Übertragen Sie dann den Schaleninhalt in ein mechanisches Dissoziator-C-Rohr und spülen Sie die Schale und das Skalpell mit 2 Millilitern Medium aus.

Geben Sie die Wäsche in das C-Röhrchen und führen Sie dann das mechanische Dissoziatorprogramm 8.01 zweimal hintereinander aus, um die Gewebefragmente sanft in eine Einzelzellsuspension zu homogenisieren. Nach dem zweiten Zyklus wird das Homogenat durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen umgefüllt. Verwenden Sie dann dieselbe Pasteur-Pipette aus dem Waschen der Petrischale, um die im C-Rohr verbleibende Flüssigkeit in das Zellsieb zu überführen.

Füllen Sie anschließend die gefilterte Flüssigkeit mit einer 1-Milliliter-Mikropipette in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen um und spülen Sie das C-Rohr mit weiteren 3 Millilitern Medium aus. Übertragen Sie diese Wäsche durch das Zellsieb in das 50-Milliliter-Röhrchen. Bewegen Sie dann das nicht homogenisierte Gewebe vorsichtig mit einer sauberen 1-Milliliter-Spitze um das Sieb herum, um die maximale Menge an im Gewebe eingeschlossener Restflüssigkeit in das 50-Milliliter-Röhrchen zu drücken. Stellen Sie nun das Zellsieb kopfüber auf das originale C-Rohr und spülen Sie das Sieb mit weiteren 3 Millilitern Medium aus, so dass das nicht homogenisierte Gewebe wieder in das C-Rohr tropft.

Homogenisieren Sie das Gewebe für zwei weitere Zyklen, wie gerade gezeigt, und gießen Sie dann das zweite Homogenat erneut durch das Zellsieb. Spülen Sie das C-Rohr mit weiteren 3 Millilitern Medium aus. Filtrieren Sie dann den Überstand durch das Sieb und drücken Sie die Restflüssigkeit aus dem Gewebe, wie gerade gezeigt. Zu diesem Zeitpunkt sollte ein Volumen von etwa 2,5 Millilitern Einzelzellsuspension in dem 15-Milliliter-Röhrchen vorhanden sein, und ungefähr 9 Milliliter sollten in dem 50-Milliliter-Röhrchen beobachtet werden.

Um den Gewebeüberstand von den Zellen zu trennen, zentrifugieren Sie zunächst beide Homogenatröhrchen 15 Minuten lang bei 600 g bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie den Überstand aus dem 15-Milliliter-Röhrchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, stellen Sie es auf 4 Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand aus dem 50-Milliliter-Röhrchen. Klopfen Sie dann vorsichtig auf jedes Röhrchen auf eine harte Oberfläche, um jedes der Zellpellets aufzubrechen.

Suspendieren Sie das lose Zellpellet in dem 50-Milliliter-Röhrchen mit 500 Mikrolitern Medium und übertragen Sie die Zellen in das 15-Milliliter-Röhrchen, um das zweite Pellet wieder aufzuwirbeln. Spülen Sie dann das 50-Milliliter-Röhrchen mit weiteren 500 Mikrolitern Medium und übertragen Sie die Wäsche auf das 15-Milliliter-Röhrchen, um eine maximale Zellrückgewinnung zu erzielen. Nachdem Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trypanblau-Ausschluss gezählt haben, pelletieren Sie die Zellsuspension.

Zum Schluss schleudern Sie den reservierten Gewebeüberstand herunter. Übertragen Sie dann den Überstand vorsichtig in mindestens ein sauberes Röhrchen, ohne das Pellet zu berühren oder zu stören, und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige nachgelagerte Analysen.