機械的解離:組織から生存細胞を得る方法

まず、組織断片の重量を量り、その長さ、幅、および高さを測定する。培養培地を入した培養皿にティッシュを入れ、メスを使って小片にサイコロにします。パスツールピペットを使用して均質化のためのCチューブにすべてを転送します。

必要に応じて、チューブを機械的解離器に入れ、サイクルを実行します。装置は、表面タンパク質を含む細胞の完全性を維持しながら、組織サンプルから生存可能な単一細胞を抽出するために機械的な力を使用します。遠心分離管に固定された細胞のストレーナーを通してホモゲネートをデカントする。

残りの組織を再均質化し、細胞ストレーナーを通してホモゲン酸をチューブにひずみます。ホモゲネートを遠心分離し、上清を取り除く。次に、培養培地中の細胞ペレットを再懸濁し、少量の細胞懸濁液をトリパンブルー染色を含むチューブに移す。

染色後、細胞を血球計スライドに移します。透明な生存細胞をカウントします。死んだ細胞は、細胞膜がそのままではないため、汚れを取り上げる。以下のプロトコルでは、CD45+細胞の定量的・定性的解析のために、新鮮なヒト組織の非酵素的解離を行います。

- まず、組織サンプルの重量を量り、組織の長さ、幅、および高さを測定します。次に、適切な化学的に定義された1ミリリットルの小さなシャーレに組織断片を移し、無血清、造血細胞培地を、滅菌メスを使用してサンプルを小さな1〜2平方ミリメートルの部分にサイコロ化する。次に、皿の内容物を機械的解離器Cチューブに移し、2ミリリットルの培地で皿とメスを洗いすます。

洗浄をCチューブに加え、8.01機械解離プログラムを連続して2回実行し、組織断片を単一の細胞懸濁液に穏やかに均質化します。第2サイクル後、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通してホモゲネートを50ミリリットルの円錐形チューブにデカントする。次に、シャーレを洗浄したパスツールピペットを使用して、Cチューブに残っている液体を細胞ストレーナーに移します。

次に、1ミリリットルのマイクロピペットを使用して、濾過した液体を15ミリリットルの円錐チューブに移し、さらに3ミリリットルの培地でCチューブをすすいでください。この洗浄物を細胞ストレーナーを通して50ミリリットルチューブに移します。その後、清潔な1ミリリットルの先端でストレーナーの周りに不均質化した組織を静かに動かし、組織に閉じ込められた残留液の最大量を50ミリリットルチューブに絞ります。次に、細胞ストレーナーを元のCチューブの上に逆さまに置き、不均質化した組織がCチューブに戻るように、より3ミリリットルの培地でストレーナーをすすいでください。

ちょうど実証したように、さらに2サイクルの組織を再均質化し、次に再び細胞ストレーナーを通して2番目のホモゲン酸を注ぎます。Cチューブを別の3ミリリットルの培地でリンスします。次に、ストレーナーを通して上澄みをフィルタリングし、ちょうど実証したように、組織から残留液を絞り出します。この時点で、15ミリリットルのチューブに約2.5ミリリットルの単一細胞懸濁液の体積が存在し、50ミリリットルのチューブで約9ミリリットルが観察されるべきである。

組織上清を細胞から分離するために、最初の遠心分離術は、室温で600Gsで15分間ホモゲネートの両チューブを分離する。上清を15ミリリットルチューブから1.5ミリリットルチューブにデカントし、摂氏4度に置き、50ミリリットルチューブから上清を捨てます。その後、硬い表面上の各チューブを静かにタップして、各細胞ペレットを分割します。

500マイクロリットルの培地で50ミリリットルチューブの緩い細胞ペレットを再懸濁し、細胞を15ミリリットルチューブに移して2番目のペレットを再懸濁した。その後、50ミリリットルのチューブを別の500マイクロリットルの培地で洗い流し、最大の細胞回収のために洗浄を15ミリリットルチューブに移します。トリパンブルー排除により生存細胞数をカウントした後、細胞懸濁液をペレットとした。

最後に、予約された組織上清をスピンダウンします。その後、ペレットに触れたり邪魔したりすることなく、上澄み物を少なくとも1つのきれいなチューブに慎重に移し、将来の下流分析のためにマイナス80°Cで保存します。