Generierung dendritischer Zellen aus Knochenmark: Eine Methode zur Erzeugung dendritischer Zellen aus Knochenmark der Maus

- Dendritische Zellen oder DCs sind wichtige antigenpräsentierende Zellen, die T-Zellen aktivieren. Bei leukämischen Patienten exprimieren diese Zellen tumorassoziiertes Antigen schlecht und lösen keine antigenspezifische Immunantwort aus. Dendritische Zellen sind im Knochenmark reichlich vorhanden. Und daher ist das Knochenmark der bevorzugte Ort für ihre Isolierung, um ihre Rolle bei Krebs zu untersuchen.

Um dendritische Zellen zu gewinnen, extrahieren Sie das Knochenmark aus dem Oberschenkelknochen oder dem Schienbein einer euthanasierten Maus, indem Sie es mit einer mit Medien gefüllten Spritze ausspülen. Zentrifugieren Sie das Pellet und resuspendieren Sie es in Ammoniumchlorid-Kalium oder ACK-Puffer, um die Erythrozyten zu lysieren. Fügen Sie nun Nährmedien hinzu, um die Lyse zu stoppen und zu zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in den Nährmedien, die ein Antibiotikum enthalten. Fügen Sie Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor oder GM-CSF hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine Petriplatte.

Inkubieren Sie die Platte für die gewünschte Zeitdauer. GM-CSF hilft Vorläuferzellen, sich in dendritische Zellen zu differenzieren. Aktivieren Sie schließlich die Zellen mit Lipopolysacchariden oder LPS, die an den Oberflächenrezeptor der dendritischen Zellen binden, was zu voll ausgereiften und immunogenen dendritischen Knochenmarkzellen führt. In diesem Protokoll werden wir die Bildung von dendritischen Zellen aus dem Knochenmark der Maus demonstrieren.

- Um dendritische Zellen aus dem Knochenmark zu erzeugen, isolieren Sie das Knochenmark aus den Femuren von Wildtyp- oder Faktor-B-Knockout-Mäusen, wie gezeigt, und lysieren Sie die roten Blutkörperchen in 5 Millilitern ACK-Lysepuffer, wobei die Reaktion mit 10 Millilitern RPMI, ergänzt mit 1 % FBS, nach fünf Minuten gestoppt wird.

Nach der Entnahme der Vollblutzellen durch Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern Kulturmedium auf eine Konzentration von 2 mal 10 bis 6 Zellen pro Milliliter und fügen Sie den Zellen 20 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF hinzu, bevor Sie 10 Milliliter Zellen sechs Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf einzelne 100 x 15 Millimeter große Petrischalen aussäen. Aktivieren Sie am sechsten Tag die aus dem Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellkulturen mit 25 Mikrogramm pro Milliliter LPS pro Platte.