Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Diese Methode soll Wissenschaftlern helfen, von Monozyten abgeleitete DCs aus dem Blut und Tumoren von tumortragenden Mäusen zu isolieren, um ihre immunstimulierenden Eigenschaften zu untersuchen. Ich denke, dass der Hauptvorteil dieses Verfahrens im Vergleich zu anderen Methoden darin besteht, dass die erhaltenen Monozyten-abgeleiteten DCs ihren Aktivierungszustand im Tumor und im Blut besser widerspiegeln. Das Schwierigste ist wahrscheinlich, sicherzustellen, dass alle Ihre Reagenzien und Werkzeuge steril sind und dass Sie während dieses Verfahrens keine Kontamination einführen.

Ich isoliere seit über 15 Jahren myeloische Zellen und dendritische Zellen aus Tumoren, und ich kam auf die Idee zu dieser Methode, als ich bemerkte, dass unterschiedliche Isolationsprotokolle zu unterschiedlichen Mustern der Zellaktivierung führten. Das Verfahren wird von Frau Santana-Magal demonstriert, die Doktorandin in meinem Labor ist.

Nachdem Sie die Mäuse mit Kohlendioxid in einer Laminar-Flow-Haube eingeschläfert haben, extrahieren Sie die Tumore und legen Sie sie in RPMI-Medium ohne fötales Rinderserum. Schneiden Sie dann den Tumor mit einer Operationsschere in kleine Stücke. Übertragen Sie alle Tumorstücke einer einzigen Maus in ein 30-Milliliter-Röhrchen mit flachem Boden, das HBSS-Puffer enthält, der mit Kollagenase IV und DNase I ergänzt ist, zusammen mit den magnetischen Rührstäbchen.

Inkubieren Sie das Röhrchen mit den Tumorstücken auf einem Shaker bei 37 Grad Celsius mit einem Magnetrührer im Inneren bei 200 bis 400 Umdrehungen pro Minute für 20 bis 30 Minuten. Als nächstes filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 mal g für fünf bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation 1,5 Milliliter Dichtegradienten-Stammlösung mit mittlerem Dichtegradienten zu 8,5 Millilitern HBSS hinzufügen. Mischen Sie dann den Dichtegradienten Medium kräftig an. Pipettieren Sie anschließend die Mischung auf das Pellet.

Die Zellsuspension wird bei 400-mal g 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Dekantieren Sie den Überstand nach Beendigung der Zentrifugation. Nach zweimaligem Waschen der pelletierten Zellen in einem Milliliter Isolationspuffer resuspendieren.

Geben Sie die Zellsuspension zu 30 Mikrolitern CD11b-konjugierten magnetischen Kügelchen. Als nächstes inkubierst du die Mischung 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt und das Pellet in einem Milliliter Isolationspuffer wieder suspendiert.

Tragen Sie die Zellsuspension auf eine vorgewaschene Magnetsäule auf. Verwenden Sie anschließend drei Milliliter Isolationspuffer, um die Säule zweimal zu waschen. Entfernen Sie dann die Säule vom Magneten.

Fügen Sie als Nächstes sechs Milliliter Isolationspuffer in der Spalte hinzu. Drücken Sie mit einem Kolben, um die magnetisch markierten Zellen in einem sterilen Sammelröhrchen auszuspülen. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 400 mal g für fünf bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach dem Resuspendieren und Färben der Zellen sortieren Sie die Zellen, indem Sie die kleinen Zellen mit kleiner Seiten- und kleiner Vorwärtsstreuung ansteuern. Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, sprühen Sie 70% Ethanol auf sie. Entfernen Sie dann mit einer chirurgischen Schere die Haut, die das Herz unter der laminaren Haube bedeckt.

Reinigen Sie anschließend die Schere mit Ethanol. Waschen Sie den Hohlraum mit 20-millimolaren EDTA HBSS und schneiden Sie mit der Schere den rechten Vorhof des Herzens durch. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel, um den rechten Ventrikel des Herzens langsam mit 20-Millimolar EDTA HBSS zu spülen.

Verwenden Sie dann eine sterile Spritze, um Blut aus der Pleurahöhle zu entnehmen. Übertragen Sie das Blut in ein Röhrchen, das Heparansulfat und EDTA enthält. Als nächstes pipettieren Sie das Blut auf dem Dichtegradientenmedium.

Zentrifugieren Sie die Blutzellen bei 400 mal g für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit niedriger Bremse. Nach der Zentrifugation werden die mononukleären Zellen in einem Röhrchen gesammelt. Lösen Sie die Zellen in 10 Millilitern Isolationspuffer auf, um die Zellen zu waschen.

Auch hier zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 mal g für fünf bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Um die CD11b-Zellen auszuwählen, resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Isolationspuffer. Inkubieren Sie 15 Minuten lang mit 50 Mikrolitern CD11b-konjugierten magnetischen Kügelchen bei vier Grad Celsius.

Bei 400 mal g für fünf bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius nachzentrifugieren. Entfernen Sie dann den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Isolationspuffer

Tragen Sie anschließend die Zellsuspension auf eine vorgewaschene Magnetsäule auf. Waschen Sie die Säule zweimal mit Isolationspuffer. Entfernen Sie die Säule aus dem Magneten und fügen Sie sechs Milliliter Isolationspuffer auf die Säule hinzu.

Spülen Sie anschließend die magnetisch markierten Zellen in einem sterilen Sammelröhrchen aus, indem Sie den Kolben drücken. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 mal g für fünf bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Isolationspuffer und färben Sie sie mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern.

Sortieren Sie die Zellen, indem Sie die kleinen Zellen mit Small Side und Small Forward Scatter angrenzen. Fixieren Sie zunächst die Zellen in 1,8% gepuffertem Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Aussaat der Zellsuspension in jeder Vertiefung einer U-förmigen 96-Well-Platte.

Fügen Sie anschließend unterschiedliche Verdünnungen von tumorbindenden Antikörpern in jede Vertiefung hinzu. Danach inkubieren Sie die Zellen 15 bis 20 Minuten lang auf Eis. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation mit 150 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Dann zentrifugieren Sie bei 400 mal g für fünf bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation den Überstand ausstoßen und die Zellen zweimal waschen. Die Zellen werden in 100 Mikrolitern FACS-Puffer aufgelöst, der einen Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper enthält.

Anschließend die Platte 15 bis 20 Minuten auf Eis inkubieren. Nach 15 bis 20 Minuten fügen Sie 200 Mikroliter FACS-Puffer hinzu, um die Zellen zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte fünf bis 10 Minuten lang bei 400 mal g.

Dekantieren Sie den Überstand. Führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um die Tumorbindung zu analysieren und die minimale Konzentration von Immunglobulin G zu bestimmen, die zur Beschichtung der Zellen erforderlich ist. Sobald die Zellen mit einer minimalen Immunglobulin-G-Konzentration beschichtet sind, fügen Sie den CFSE-markierten Tumorimmunkomplex zu den aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen im Verhältnis eins zu fünf hinzu.

Inkubieren Sie die Mischung dann 12 bis 16 Stunden über Nacht in vollem Medium. Durchführung einer FACS-Analyse der aus Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellaktivierung. Die mittlere Fluoreszenzintensität wird nach einer durchflusszytometrischen Analyse berechnet, um das Vorhandensein von IgG- und M-Antikörpern zu untersuchen, die LMP-Tumorzellen ex vivo binden.

Die Ergebnisse zeigen, dass die IgG-Antikörper von C57-Black/6 allogenen Mäusen die Tumorzellen viel stärker binden als die Antikörper von den 129S1 syngenen Mäusen. Anschließend wird die mittlere Fluoreszenzintensität der Bindungskapazität von B16F10-Tumorzellen an das IgG berechnet. IgG, das von 129S1 allogenen Mäusen gewonnen wurde, zeigt eine 10-fach höhere Färbeintensität mit B16F10-Tumoren im Vergleich zu syngenem IgG von C57-Black/6 Mäusen.

Als nächstes werden mikroskopische DIC-Bilder aufgenommen, um die tumorassoziierten, von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen aus den B16F10-Tumoren zu zeigen. Hier werden DIC-Bilder aufgenommen, um die entzündlichen und patrouillierenden Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen zu zeigen, die aus dem Blut von B16F10-tumortragenden Mäusen isoliert wurden. Eine durchflusszytometrische Analyse wird auch durchgeführt, um die Aktivierungsmuster von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen aus der Milz und dem Knochenmark mit denen des Tumors und des Blutes bei der Inkubation mit dem Immunkomplex zu vergleichen.

Das Ergebnis zeigt eine erhöhte CD86- und MHC II-Expression durch das Knochenmark und die Milz-dendritischen Zellen mit den Immunkomplexen. Dann wird eine konfokale Immunhistochemie durchgeführt, die die Tumoraufnahme und die MHC II-Expression zeigt, wenn die dendritischen Zellen mit dem CFSE-markierten Tumorimmunkomplex inkubiert werden. Sobald Sie dieses Verfahren beherrschen, kann es in wenigen Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Mäuse, die Sie verwenden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Ihre Reagenzien und Werkzeuge jederzeit steril zu halten. Mäusefell ist eine Hauptquelle für Kontaminationen. Stellen Sie sicher, dass keines der Haare Ihr Gewebe berührt.

Wir hoffen, dass Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie man von Monozyten abgeleitete DCs aus Mausblut und Tumoren isoliert und wie man sie anschließend mit Immunkomplexzellen aktiviert, ohne dass es zu einer vorzeitigen Aktivierung kommt.