Vorbereitung von gefrorenen Hautgewebeblöcken: Ein Protokoll zur Konservierung von kutanen Melanomproben aus der Rückenhaut von Mäusen

- Ruhende Melanozyten-Stammzellen werden als Reaktion auf UV-Strahlung oder Haarenthaarung aktiviert. Aktivierte Melanom-Stammzellen können zum kutanen Melanom führen - einer Form von Hautkrebs. Um das Melanom zu untersuchen, bereiten wir gefrorene Hautgewebeblöcke vor, um die nativen Strukturen der DNA und Proteine während des Fixierungsverfahrens zu erhalten.

Beginnen Sie damit, eine euthanasierte Melanommaus auf eine Operationsliege zu legen und Haare aus dem dorsalen Bereich der Haut über dem Schwanz zu entfernen. Schneiden Sie die Haut heraus und bedecken Sie sie mit einem Filterpapier. Tauchen Sie anschließend das Filterpapier mit dem Hautgewebe für die gewünschte Zeit in neutral gepuffertes Formalin. Formalin dringt in das Hautgewebe ein und bindet an die Aminosäuren, was die Vernetzung von Proteinen bewirkt und somit zu einer Gewebefixierung führt.

Entfernen Sie das Hauttuch vom Papier und schneiden Sie das Taschentuch ab, um Stücke in der gewünschten Größe zu erhalten. Betten Sie nun die Gewebestücke vertikal in einen mit OCT-Medium gefüllten Kryomould ein und legen Sie die Kryomoulds auf Trockeneis. OCT ist eine Probenmatrix, die sich beim Einfrieren verfestigt und eine gallertartige Schicht um die Gewebeprobe bildet, die sie an Ort und Stelle hält. Verwenden Sie die gefrorenen Blöcke für weitere histologische Untersuchungen. Im folgenden Protokoll werden wir gefrorene Hautgewebeblöcke aus der dorsalen Haut der Maus präparieren, um das kutane Melanom zu untersuchen.

- Um die Hautproben zu isolieren, verwenden Sie einen elektrischen Trimmer, um alle Haare aus dem dorsalen Hautbereich der euthanasierten bestrahlten Mäuse zu entfernen, und bürsten Sie die exponierte Haut leicht mit einem fusselfreien Tuch, um den Bereich zu reinigen. Machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer scharfen Schere direkt über dem Schwanzansatz und führen Sie eine große, stumpfe Schere in den Schnitt ein, um das subdermale Bindegewebe zu trennen. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere vorsichtig am Rand der interessierenden Hautregion entlang, um die Gewebeprobe zu isolieren, und legen Sie das herausgeschnittene Hautgewebe auf ein sauberes Papiertuch.

Dehnen Sie dann die Haut mit einer stumpfen Pinzette, so dass sie am Handtuch haftet und straff ist. Wenn alle Proben entnommen wurden, legen Sie die Hautprobe und das Papiertuch in ein Stück gefaltetes Filterpapier direkt neben der Falte und achten Sie darauf, dass die Probe glatt und nicht gefaltet oder zerknüllt ist. Schließen Sie die Seiten des Filterpapiers mit Heftklammern und schneiden Sie das Papier ab. Tauchen Sie die Proben dann 3 bis 5 Stunden lang vollständig in 10 % neutral gepuffertes Formalin bei Raumtemperatur, bevor Sie das Gewebe mit zwei 5-minütigen Wäschen in deionisiertem Wasser waschen.

Entfernen Sie nach dem zweiten Waschen vorsichtig alle Materialreste aus dem Hautgewebe und schneiden Sie die Ränder der Probe ab, damit sie nicht gezackt werden. Nehmen Sie als Nächstes drei sagittale Schnitte in jeder Probe vor, so dass die Breite der Streifen nicht mehr als 5 Millimeter beträgt, und machen Sie Querschnitte, so dass die Proben nicht mehr als 20 Millimeter breit sind. Positionieren Sie ein Kryowerkzeug mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Medium im Hochformat und legen Sie vier bis fünf Hautstücke auf das OCT.

Wenn alle Teile an Ort und Stelle sind, führen Sie mit zwei Paar feinen Pinzetten die lange Kante jedes Hautstücks an den Boden des Kryomolds, so dass die Proben innerhalb des OCT vertikal und senkrecht zum Boden der Form stehen. Füllen Sie dann die Form mit zusätzlichem OCT bis zur zweiten Lippe und legen Sie die Form auf eine ebene Fläche eines Stücks Trockeneis, indem Sie mit einer Pinzette alle Hautstücke anpassen, die sich während des Transfers verschoben haben könnten, wenn der Block bei Bedarf zu gefrieren beginnt.