Generierung organotypischer Vollhautrekonstruktionen: Ein Verfahren zur Erstellung eines 3D-Hautmodells anhand menschlicher Hautproben

Die Haut besteht hauptsächlich aus einer oberen Epidermisschicht und einer unteren Hautschicht. Die Epidermiszellen sind in mehrere Schichten geschichtet, die von den am wenigsten differenzierten Zellen an der Basis bis zu den hochdifferenzierten Zellen an der Peripherie reichen. Um ein Hautgewebe zu züchten, das die morphologischen und biochemischen Aspekte normaler Haut nachahmt, können wir ein organotypisches Hautmodell erstellen.

Nehmen Sie zunächst eine Multi-Well-Platte mit membranösem Einsatz. Fügen Sie dem Einsatz mit Kollagen gemischte dermale Fibroblasten hinzu. Inkubieren, um die Verfestigung der Kollagenmatrix zu erleichtern, die Fibroblasten einzubetten und das Hautkompartiment der Haut nachzuahmen.

Geben Sie anschließend eine Keratinozyten-Zellsuspension über die Hautschicht. Inkubieren Sie die Platte, damit die Keratinozyten am Hautkompartiment haften können. Ergänzen Sie die Kultur mit einem Epidermalisierungsmedium, um die Keratinozytenproliferation und die Bildung einer Epidermisschicht zu initiieren.

Übertragen Sie abschließend die Einsätze auf eine frische Multi-Well-Platte. Fügen Sie ein Schichtungsmedium hinzu, so dass es nur die Basis des Konstrukts bedeckt, wodurch eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche entsteht. Bei der Inkubation erleichtert die Luft-Flüssig-Grenzfläche die Differenzierung der Keratinozyten in eine geschichtete, mehrschichtige Epidermis.

Im folgenden Protokoll werden wir organotypische 3D-Hautrekonstruktionen mit dermalen und epidermalen Gegenstücken aus isolierten menschlichen Hautzellen generieren.

Um das dermale Gegenstück der Hautrekonstruktionen zu erzeugen, platzieren Sie 8 Mikrometer porengroße Membraneinsätze in einer 24-Well-Zellkulturplatte. Für jeden Einsatz resuspendieren Sie 100.000 Fibroblasten in Gel-Neutralisationslösung. Mischen Sie anschließend die Fibroblastensuspension schnell mit Kollagen Typ 1 im Verhältnis 1:3 in einem Endvolumen von 500 Mikrolitern, ohne Blasen zu bilden.

Verwenden Sie dann eine Pipette, um die Suspension zu jedem Einsatz hinzuzufügen. Legen Sie die Einsätze in einer sterilen Haube 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Medium, damit sich die Hautgele absetzen können. Als nächstes bedecken Sie die Gele mit DMEM und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation über Nacht entfernen Sie das DMEM aus den Hautgelen und äquilibrieren sie 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit EGM, um das epidermale Gegenstück der Hautrekonstruktionen zu erzeugen. Verwenden Sie anschließend eine Pipette, um das EGM von den Gelen zu entfernen.

Versiegeln Sie dann vorsichtig 100.000 Keratinozyten, die in 100 Mikrolitern EGM resuspendiert sind, auf jedem Gel. Inkubieren Sie die Rekonstruktionen 1,5 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die Keratinozyten am Hautgel haften können. Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig das restliche Gel von der Einsatzwand.

Als nächstes bedecken Sie jede Rekonstruktion mit 800 Mikrolitern EGM und kultivieren sie 7 Tage lang bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.

Entfernen Sie vorsichtig mit einer kleinen weißen Pipettenspitze Gelreste von der Einlegewand.

Legen Sie die Einsätze am 8. Tag in separate Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Geben Sie anschließend 1,2 bis 1,4 Milliliter metastasierendes Melanommedium in jede Vertiefung, um nur die Basis der Hautrekonstruktion zu bedecken. Dann 10 bis 17 Tage bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid inkubieren.

• 3D Skin Models - Three-dimensional constructs mimicking natural skin structures
• Human Skin Samples - Biopsy samples of human skin used for scientific study.
• Epidermalization - The process of keratinocyte proliferation and formation of an epidermal layer.
• Organotypic Skin Culture - A method to grow skin tissues that mimic normal skin.
• Reconstructs - 3D skin models created from isolated human skin cells.

• Introduce 3D Skin Models: These are laboratory-grown structures that mimic the natural layers of skin (e.g., human skin samples).
• Key Concepts: They involve processes like epidermalization, that replicate skin cell behaviour (e.g., epidermalization).
• Underlying Mechanisms: The constructs are created by embedding cells in collagen and refining them in different stages.
• Connect to Experiment: The experiment involves creating an organotypic skin culture using a multi-well plate and cell substances.

• What are 3D Skin Models and how are they established (including organotypic skin culture)?
• What does the process of epidermalization entail?
• What are the mechanisms used in creating skin reconstructs?

• Describe Practical Applications: 3D skin models are vital in dermatological research and skincare product testing (e.g., 3D skin models).
• Industry Impact: They greatly influence sectors like healthcare and cosmetology (e.g., human skin samples).
• Societal Importance: Advancements in skin models can benefit personalized medicine and reduce animal testing (e.g., reconstructs).
• Link to Scientific Advancements: They enable understanding of skin diseases and testing of potential treatments.