Generierung organotypischer Vollhautrekonstruktionen: Ein Verfahren zur Erstellung eines 3D-Hautmodells anhand menschlicher Hautproben
JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 4:07 Min. • April 30th, 2023
Die Haut besteht hauptsächlich aus einer oberen Epidermisschicht und einer unteren Hautschicht. Die Epidermiszellen sind in mehrere Schichten geschichtet, die von den am wenigsten differenzierten Zellen an der Basis bis zu den hochdifferenzierten Zellen an der Peripherie reichen. Um ein Hautgewebe zu züchten, das die morphologischen und biochemischen Aspekte normaler Haut nachahmt, können wir ein organotypisches Hautmodell erstellen.
Nehmen Sie zunächst eine Multi-Well-Platte mit membranösem Einsatz. Fügen Sie dem Einsatz mit Kollagen gemischte dermale Fibroblasten hinzu. Inkubieren, um die Verfestigung der Kollagenmatrix zu erleichtern, die Fibroblasten einzubetten und das Hautkompartiment der Haut nachzuahmen.
Geben Sie anschließend eine Keratinozyten-Zellsuspension über die Hautschicht. Inkubieren Sie die Platte, damit die Keratinozyten am Hautkompartiment haften können. Ergänzen Sie die Kultur mit einem Epidermalisierungsmedium, um die Keratinozytenproliferation und die Bildung einer Epidermisschicht zu initiieren.
Übertragen Sie abschließend die Einsätze auf eine frische Multi-Well-Platte. Fügen Sie ein Schichtungsmedium hinzu, so dass es nur die Basis des Konstrukts bedeckt, wodurch eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche entsteht. Bei der Inkubation erleichtert die Luft-Flüssig-Grenzfläche die Differenzierung der Keratinozyten in eine geschichtete, mehrschichtige Epidermis.
Im folgenden Protokoll werden wir organotypische 3D-Hautrekonstruktionen mit dermalen und epidermalen Gegenstücken aus isolierten menschlichen Hautzellen generieren.
Um das dermale Gegenstück der Hautrekonstruktionen zu erzeugen, platzieren Sie 8 Mikrometer porengroße Membraneinsätze in einer 24-Well-Zellkulturplatte. Für jeden Einsatz resuspendieren Sie 100.000 Fibroblasten in Gel-Neutralisationslösung. Mischen Sie anschließend die Fibroblastensuspension schnell mit Kollagen Typ 1 im Verhältnis 1:3 in einem Endvolumen von 500 Mikrolitern, ohne Blasen zu bilden.
Verwenden Sie dann eine Pipette, um die Suspension zu jedem Einsatz hinzuzufügen. Legen Sie die Einsätze in einer sterilen Haube 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Medium, damit sich die Hautgele absetzen können. Als nächstes bedecken Sie die Gele mit DMEM und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Nach der Inkubation über Nacht entfernen Sie das DMEM aus den Hautgelen und äquilibrieren sie 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit EGM, um das epidermale Gegenstück der Hautrekonstruktionen zu erzeugen. Verwenden Sie anschließend eine Pipette, um das EGM von den Gelen zu entfernen.
Versiegeln Sie dann vorsichtig 100.000 Keratinozyten, die in 100 Mikrolitern EGM resuspendiert sind, auf jedem Gel. Inkubieren Sie die Rekonstruktionen 1,5 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die Keratinozyten am Hautgel haften können. Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig das restliche Gel von der Einsatzwand.
Als nächstes bedecken Sie jede Rekonstruktion mit 800 Mikrolitern EGM und kultivieren sie 7 Tage lang bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.
Entfernen Sie vorsichtig mit einer kleinen weißen Pipettenspitze Gelreste von der Einlegewand.
Legen Sie die Einsätze am 8. Tag in separate Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Geben Sie anschließend 1,2 bis 1,4 Milliliter metastasierendes Melanommedium in jede Vertiefung, um nur die Basis der Hautrekonstruktion zu bedecken. Dann 10 bis 17 Tage bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid inkubieren.
Übersicht
In diesem Artikel wird das Verfahren zur Erstellung eines dreidimensionalen organotypischen Hautmodells beschrieben, das Struktur und Funktion der menschlichen Haut nachahmt. Das Modell umfasst sowohl die Dermis- als auch die Epidermisschicht und ermöglicht die Untersuchung der Hautbiologie und -pathologie.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Gewebetechnik
Hintergrund
- Die Haut besteht aus einer oberen epidermalen Schicht und einer unteren dermalen Schicht.
- Epidermale Zellen sind in mehrere Schichten stratifiziert, die unterschiedliche Differenzierungsgrade aufweisen.
- Organotypische Modelle sind unerlässlich, um die Hautbiologie zu untersuchen.
- Die Erstellung eines Hautmodells umfasst das Schichten von dermalen Fibroblasten und Keratinozyten.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen organotypischen Hautmodells.
- Erleichterung der Untersuchung von Hauterkrankungen und deren Behandlungen.
- Nachahmung der morphologischen und biochemischen Eigenschaften normaler Haut.
Verwendete Methoden
- Verwendung von Mehrfach-Well-Platten mit membranösen Einsätzen.
- Einbetten von Fibroblasten in eine Kollagenmatrix.
- Zugabe von Keratinozyten zur Bildung der epidermalen Schicht.
- Nutzung von Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen-Kulturbedingungen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung dreidimensionaler organotypischer Hautkonstrukte.
- Entwicklung einer stratifizierten, mehrschichtigen Epidermis.
- Nachweis der Keratinozytendifferenzierung in der Kultur.
- Mögliche Anwendungen bei der Erforschung hautbezogener Erkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Das organspezifische Hautmodell imitiert die menschliche Haut effektiv.
- Dieses Modell kann für verschiedene Forschungsanwendungen verwendet werden.
- Zukünftige Studien könnten therapeutische Interventionen unter Verwendung dieses Modells untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Etablierung physiologisch relevanter 3D-Hautmodelle ermöglicht eine mechanismenbasierte Entgiftung bei der Zielvalidierung in Dermatologie und Onkologie, indem die Architektur und multizelluläre Komplexität der menschlichen Haut nachgebildet wird. Dies erhöht die Vorhersagekraft bei der präklinischen Bewertung von therapeutischen Kandidaten, die die epidermale Differenzierung, dermo-epidermale Wechselwirkungen oder die Invasion von Melanomen beeinflussen. Das Modell stellt ein krankheitsrelevantes System bereit, um die Zielinteraktion und Modulation von Signalwegen in einem aus menschlichem Gewebe stammenden Kontext zu untersuchen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in einem stratifizierten humanen Epidermis- und dermalen Fibroblasten-Kokultursystem.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch Modellierung der epidermalen Differenzierung und dermal-epidermaler Signalübertragung.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die biologische Entschärfung von Zielstrukturen, die an der Haut-Homöostase, Barrierefunktion oder Melanomprogression beteiligt sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare humane Hautmodelle zur quantitativen Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf die epidermale Schichtung.
- Operativer Wert: Bietet eine skalierbare Plattform für die Assay-Entwicklung mit definierten dermalen und epidermalen Kompartimenten.
- Operativer Wert: Unterstützt Screening-Verfahren mit mittlerer Durchsatzleistung unter Verwendung membranöser Inserts in Mehrfachbrunnenformaten.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System, um die Invasion und metastatische Potenz von Melanomen in einer rekonstruierten menschlichen Hautmikroumgebung zu untersuchen.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Bewertung translationaler Biomarker, die mit epidermaler Differenzierung, Invasion oder stromalen Wechselwirkungen assoziiert sind.
- Operationaler Wert: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Arbeitsabläufe, indem ein humanbasiertes Modell für die Optimierung von Wirkstoffkandidaten und die mechanistische Charakterisierung bereitgestellt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode der organotypischen Hautrekonstruktion integriert sich in die Entdeckungsbiologie und präklinische Forschungsabläufe, indem sie ein humanes Hautmodell für die Zielvalidierung, die Assay-Entwicklung und Untersuchungen zur Melanominvasion bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung der epidermalen Differenzierung und der Wechselwirkung zwischen Dermis und Epidermis in einem geschichteten humanen Gewebemodell.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Erzeugung der dermalen und epidermalen Schichten mit quantitativen Messgrößen zur Schichtung und Barrierefunktion.
- Analytik: Erleichtert die vergleichende Analyse der Wirkung von Substanzen auf die epidermale Dicke, die Keratinozyten-Differenzierung oder die Invasionstiefe anhand histologischer oder bildgebender Endpunkte.
- Translationale Forschung: Unterstützt die präklinische Kontinuität durch Modellierung der Invasion von humanem Melanom in einer rekonstruierten Hautmikroumgebung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Kapazität für Dermatologie- und Onkologieprogramme, die Modelle der humanen Hautpathophysiologie benötigen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert die Vorhersagesicherheit, indem die Architektur der menschlichen Haut und deren multizelluläre Komplexität modelliert werden.
- Operationaler Wert: Fördert Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Zellsämergehalte, Kollagenmatrixpräparation und Kultur an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem mechanistische Unklarheiten bei der Validierung hautbezogener Zielstrukturen reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf deren Auswirkungen auf epidermale Differenzierung, Dermis-Integrität oder Melanom-Invasion.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Primärkultur menschlicher Zellen, der Herstellung von Kollagengelen sowie in epithelial-stromalen Kokultivierungstechniken.
- Setzt eine sterile Zellkulturausstattung, Mehrlochplatten mit porösen Einsätzen und kontrollierte Inkubationsbedingungen (37 °C, 5 % CO₂) voraus.
- Benötigt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Zellisolierung, der Neutralisation des Gels und den Protokollen zum Mediumwechsel, um eine Vergleichbarkeit zwischen Laboren zu gewährleisten.
- Erfordert Anpassungen bei der Modellierung unterschiedlicher Hautphänotypen oder Krankheitszustände (z. B. Psoriasis, Melanom) durch veränderte Zellquellen oder Mediumzusammensetzungen.
- Ist durch die Spendervariabilität primärer menschlicher Hautzellen begrenzt, die die Kinetik der epidermalen Schichtung und die Aktivität der dermalen Fibroblasten beeinflussen kann.
Biopharma-Häufige Fragen
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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026