Modellierung der frühen Schritte der Eierstockkrebs Verbreitung in einer organotypischen Kultur der Menschen Peritonealhöhle

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Konstruktion eines dreidimensionalen in vitro Modells der Auskleidung der Bauchhöhle, bestehend aus primären menschlichen Mesothelzellen und Fibroblasten, die mit extrazellulärer Matrix überlagert sind, als Werkzeug zur Untersuchung der Adhäsion, Invasion und Proliferation von Eierstockkrebszellen.

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, ein organotypisches Modell zu erstellen, das die peritoneale Mikroumgebung nachahmt, um unser Verständnis der Biologie von Eierstockkrebs zu verbessern. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich des Eierstockkrebses zu beantworten, z. B. wie Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Mikroumgebung zur Krankheitsentstehung beitragen und wie potenzielle Inhibitoren dieser Wechselwirkungen getestet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass tatsächliche primäre menschliche Zellen, die die Mesothellinienoberflächen der Peralhöhle bilden, in der Co-Kultur der Eierstockkrebszellen verwendet werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in Eierstockkrebs geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung anderer Krebsarten angewendet werden, die sich in der gesamten Bauchhöhle ausbreiten, wie z. B. Magen-, Bauchspeicheldrüsen- und Dickdarmkrebs. Nach der Entnahme einer chirurgischen Probe des menschlichen Omentums tauchen Sie die Probe sofort in PBS bei Raumtemperatur. Übertragen Sie innerhalb von zwei Stunden nach dem Eintauchen das Omentum in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 20 Millilitern frischem PBS, übertragen Sie die verbleibende PBS-Wäsche mit den primären menschlichen mesothelialen Zellen oder HPMC und roten Blutkörperchen in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen nach unten.

Gießen Sie dann den Inhalt des Röhrchens in eine 10 Zentimeter große sterile Kulturschale und hacken Sie das Gewebe mit zwei Skalpellen in fünf Kubikmillimeter große Stücke. Um die primären menschlichen Mesothelzellen oder HPMC zu isolieren, geben Sie die Omentumstücke in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und warten Sie eine Minute. Damit die festen Stücke nach oben schwimmen können, setzt sich das HPMC mit den roten Blutkörperchen am Boden des Röhrchens ab.

Verwenden Sie eine Pipette, um die PBS-Waschung, die Mesothelzellen und rote Blutkörperchen enthält, in das Röhrchen mit den pelletierten Zellen zu übertragen und die Zellen nach unten zu schleudern. Geben Sie dann 20 Milliliter frisches PBS in das Omentum und sammeln Sie das PBS, das HPMC und RB C3 enthält, weitere Male, wie es gerade den ursprünglichen pelletierten Zellen vorgeführt wird. Nach der abschließenden Spinplatte werden die Zellen in einen 75 Quadratzentimeter großen Kolben in 15 Milliliter Vollwachstumsmedium gegeben.

Um zusätzliches HPMC aus der Omentumprobe zu isolieren, schütteln Sie das verbleibende feste Gewebe in 20 Millilitern PBS bei 200 U/min und 37 Grad Celsius. Lassen Sie die Probe nach 10 Minuten eine Minute ruhen, damit das feste Gewebe an die Oberseite des Röhrchens aufsteigen kann. Sammeln Sie dann die HPMC und RBC vom Boden des Röhrchens, wie gerade gezeigt.

Schleudern Sie nun die Zellen aus dieser Sekundärwäsche herunter und geben Sie sie in einen separaten 75-Quadratzentimeter-Kolben mit 15 Millilitern Vollwachstumsmedium. Um verbleibende HPMC zu isolieren, schütteln Sie das Gewebe weitere 10 Minuten lang, diesmal in einer Mischung aus PBS und 10 Millilitern Trips in EDTA und plattieren Sie diese HPMC und RBC in einem 75 Quadratzentimeter großen Kolben, inkubieren Sie dann die Kulturen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einer befeuchteten Umgebung, füttern Sie die plattierten Zellen mit 15 Millilitern frischen, volles Wachstumsmedium an den Tagen drei und fünf, ohne das verbrauchte Medium zu entfernen. Die HPMC sind an ihrer quaderförmigen Form und ihrer Expression von Cytokeratin, Acht und Menton zu erkennen.

Um die normalen Omentum-Fibroblasten zu isolieren, behandeln Sie das verbleibende gehackte Omentumgewebe mit 10 Millilitern frisch zubereiteter 10-fach-Kollagenase-Typ-3-Lösung, die sechs Stunden lang in serumfreiem Medium verdünnt ist, unter Schütteln am Ende der Inkubationszeit, das verdaute Gewebe ist mit der Lösung, die einige fibröse Trümmer enthält, undurchsichtig geworden, zentrifugieren Sie die normale Omentum-Fibroblasten-Suspension, Und dann Kultur. Die Zellen in 13 Milliliter Vollwachstumsmedium. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das alte Medium durch 15 Milliliter frisches Vollwachstumsmedium.

Die normalen Omentum-Fibroblasten sind an ihrer flachen, länglichen Form, ihrer Expression von Vimentin und ihrem Mangel an Cytokeratin-Unterstützung zu erkennen. Um die normalen Omentum-Fibroblasten aus der Kultur freizusetzen, spülen Sie den Kulturkolben mit 10 Millilitern PBS, gefolgt von drei Millilitern Trypsin für nicht länger als fünf Minuten. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit mindestens dem dreifachen Volumen des vollen Wachstumsmediums und geben Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Schleudern Sie die Zellen herunter und suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern vollem Wachstumsmedium. Zählen Sie dann die Zellen und verdünnen Sie sie auf zwei- bis viermal 10 bis zum dritten Fibroblasten pro 100 Mikroliter volles Wachstum, mittlere Konzentration. Fügen Sie als Nächstes 0,5 Mikrogramm pro 100 Mikroliter Rattenschwanzkollagen hinzu, eines zu den Zellen und geben Sie 100 Mikroliter Zellen pro Vertiefung in eine schwarze, durchsichtige 96-Well-Platte.

Dann überführen Sie die Platte für mindestens vier Stunden in einen Zellkultur-Inkubator oder bis die Zellen an der Plattenoberfläche haften, während sich die normalen Impulsfibroblasten absetzen. Nehmen Sie die HPMC aus ihren Kulturgefäßen und verdünnen Sie diese Zellen auf ein- bis zweimal 10 bis 4 HPMC pro 50 Mikroliter Vollwachstumsmedium. Geben Sie dann 50 Mikroliter HPMC pro Vertiefung zu den angehängten normalen Omentum-Fibroblasten und stellen Sie die Platte für mindestens 18 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück, bevor Sie experimentell durchgeführt werden.

Verwenden Sie am nächsten Tag das Saatgut, die 3D ORGANOTYPISCHEN Co-Kulturen mit GFP-exprimierenden Eierstockkrebszellen aus einer 80 bis 90%igen konfluenten Kultur in der entsprechenden Verdünnung für den gewünschten Downstream-Assay, das RGD-Peptid und blockierende Antikörper gegen Alpha Fünf, Beta Eins und Alpha Fünf. Beta drei. Integrine hemmen die Adhäsion von Eierstockkrebszellen an die organotypische Kultur, während dies bei RAD-Peptid und Kontroll- und Beta-4-Integrin-Antikörpern nicht der Fall ist.

Das RRG D-Peptid und die blockierenden Antikörper gegen Alpha-Fünf- und Beta-Eins-Integrin hemmen auch die Proliferation von Eierstockkrebszellen in der organotypischen Kultur, während das RAD-Peptid und die Kontroll-Alpha-Fünf-, Beta-3- und Beta-Vier-Integrin-Antikörper dies nicht tun. Darüber hinaus hemmen das RGD-Peptid und blockierende Antikörper gegen Alpha-Fünf- und Beta-1-Integrin die Invasion von Eierstockkrebszellen in 3D-ORGANOTYPIC-Kulturen. Während der Alpha-Fünf-Beta-Drei-Integrin-Antikörper diesen Prozess wie aus den Adhärenz- und Proliferationsassay-Daten erwartet verstärkt, zeigten das RAD-Peptid und die Kontroll- und Beta-4-Integrin-Antikörper ebenfalls keinen Einfluss auf die Invasion von Krebszellen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben bis 12 Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, immer daran zu denken, eine biologische Sicherheitswerkbank und die entsprechende Schutzausrüstung, einschließlich eines Laborkittels und Handschuhe, nach diesem Verfahren zu verwenden. Andere Methoden wie Adhäsions-, Invasions- und Proliferationsassays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Wechselwirkungen von Krebszellen mit der Mikroumgebung nach ihrer Entwicklung zu beantworten.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet des Eierstockkrebses den Weg, um zu untersuchen, wie die Mikroumgebung die Interaktionen von Krebszellen mit menschlichen Zellen der Bauchhöhle beeinflusst. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Primärzellen aus dem menschlichen Impuls isoliert und wie man eine organotypische Kultur der Peralauskleidung aufbaut.