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- Das Melanom beherbergt eine kleine Subpopulation von Krebsstammzellen, die sowohl die Fähigkeit zur Selbsterneuerung als auch zur Tumorinitiierung besitzen. CD133 oder Prominin-1, ein Pentaspin-Transmembran-Glykoprotein, ist einer der Schlüsselmarker, die von metastasierten Melanom-Krebsstammzellen exprimiert werden. Um CD133-positive Zellen zu isolieren, beginnen Sie mit einer Suspension der primären Melanomzellen in einem geeigneten Puffer.
Inkubieren Sie mit einem Blockierungsreagenz, das Proteine enthält, die unspezifische Bindungsstellen auf der Zelloberfläche blockieren. Behandeln Sie die Zellen mit biotinylierten CD133-Primärantikörpern. Diese Antikörper binden an CD133-Antigene, die auf CD133-positiven Zellen exprimiert werden. Fügen Sie nun der Suspension magnetische Anti-Biotin-Mikrokügelchen hinzu. Inkubieren Sie, damit die Mikrokügelchen an die Biotin-markierten Zellen binden können.
Führen Sie schließlich die inkubierte Suspension durch eine Säule, die in einem Magnetfeld platziert ist. Unter magnetischer Beeinflussung bleiben alle CD133-positiven Zellen, die mit den Mikrokügelchen markiert sind, an der Säule haften, während die unmarkierten Zellen die Säule passieren. Sammeln Sie diese unmarkierten CD133-negativen Zellen. Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld. Spülen Sie den Inhalt mit einem geeigneten Puffer, um CD133-positive Zellen zu eluieren und zu sammeln.
Im folgenden Protokoll zeigen wir die Isolierung von CD133-positiven und -negativen Krebsstammzellen aus einer Kultur des primären Melanoms, die aus Tumorgewebe gewonnen wurde. Waschen Sie 80 % konfluente Zellen mit vorgewärmtem PBS. Fügen Sie eine angemessene Menge Accutase hinzu und inkubieren Sie, bis sich die Zellen von der Kulturoberfläche lösen. Ernten Sie die Zellen im Medium Quantum 263 und geben Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen.
Listen Sie die Zellen auf. Zentrifugieren Sie dann die erforderliche Anzahl von Zellen 5 Minuten lang bei 300 x g und 4 bis 8 Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie bis zu 1 mal 10 bis zu den achten Zellen in 350 Mikrolitern MACS-Puffer. Fügen Sie 100 Mikroliter FcR Blocking Reagenz und 50 Mikroliter CD133/1-Biotin hinzu. Gut mischen und bei 4 Grad Celsius 10 Minuten inkubieren.
Waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern MACS-Puffer, gefolgt von einer 5-minütigen Zentrifugation bei 300 x g und 4 bis 8 Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand vollständig an. Nach einer zweiten Wäsche resuspendieren Sie das Zellpellet in 400 Mikrolitern MACS-Puffer. 100 Mikroliter Anti-Biotin-Mikrokügelchen hinzufügen und gut vermischen. Inkubieren Sie bei 4 bis 8 Grad Celsius für 15 Minuten.
Um den MACS-Separator für die magnetische Trennung vorzubereiten, befestigen Sie den QuadroMACS an den MACS Separator Multi Stand. Setzen Sie die benötigte Anzahl an LS-Säulen mit den Säulenflügeln nach vorne in das Magnetfeld des QuadroMACS ein. Setzen Sie in jede LS-Säule einen Vorabscheidefilter und unter jeder Säule ein entsprechendes Auffangröhrchen ein.
Spülen Sie den Filter und die Säule mit 3 Millilitern MACS-Puffer und verwerfen Sie den Durchfluss. Nachdem Sie die Zellen wie zuvor beschrieben in MACS-Puffer gewaschen haben, resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern MACS-Puffer und tragen Sie die Zellsuspension auf die vorbereitete LS-Säule auf. Dreimal mit 3 Millilitern MACS-Puffer pro Säule waschen. Sammeln Sie den Gesamtabfluss der unmarkierten CD133-negativen Zellfraktion.
Entsorgen Sie anschließend den Vorabscheidefilter, nehmen Sie die Säule aus dem Abscheider und legen Sie sie auf ein geeignetes Auffangröhrchen. Tragen Sie 5 Milliliter MACS-Puffer auf. Spülen Sie die markierten CD133-positiven Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken. Um die Reinheit der negativen Fraktion zu erhöhen, tragen Sie die Zellsuspension auf eine neue äquilibrierte LS-Säule auf und sammeln Sie die abfließende CD133-negative Fraktion.
