Keratinozyten-Koloniebildungs-Assay: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Fähigkeit von Keratinozyten, zu Kolonien zu wachsen

- Der Assay zur Koloniebildung bestimmt die Fähigkeit einzelner Zellen, sich zu vermehren und Kolonien zu bilden. Beginnen Sie mit einer herausgeschnittenen Haut vom Rücken der Maus in einer Kulturplatte. Kratzen Sie das Unterhautgewebe und das Fett von der ventralen Seite der Haut ab. Behandeln Sie das Gewebe mit einer Verdauungslösung. Die proteolytischen Enzyme in der Lösung bauen die extrazelluläre Matrix ab und induzieren die Dissoziation der epidermalen Zellen.

Kratzen Sie vorsichtig die Epidermisschicht ab, um die dissoziierenden Zellen und Haare in ein Erntemedium freizusetzen. Filtern Sie die Suspension durch ein geeignetes Sieb, um Haare oder Ablagerungen einzufangen und erhalten Sie eine einzellige Suspension von Epidermiszellen. Übertragen Sie das gewünschte Volumen dieser Zellsuspension in eine kollagenbeschichtete Platte, die eine adhärente Schicht aus wachstumsgehemmten Feederzellen enthält. Ergänzen Sie mit einem geeigneten Medium, das das Überleben der Keratinozyten begünstigt.

Während der Kultur heften sich die Keratinozyten an die Feederschicht. Darüber hinaus sezernieren diese Feeder-Zellen Wachstumsfaktoren und synthetisieren extrazelluläre Matrixproteine, die das Wachstum von Keratinozyten unterstützen. Abhängig von der proliferativen Fähigkeit der einzelnen Keratinozyten beginnen sie, Kolonien zu bilden. Entfernen Sie das Medium und befestigen Sie die Kolonien. Färben Sie die Zellen mit einem geeigneten Farbstoff, um die Kolonien für die Zählung zu erkennen. Im folgenden Protokoll werden wir den klonogenen Assay von primären Keratinozyten durchführen, die nach der Behandlung mit Testsubstanzen von adulten Mäusen entnommen wurden.

- Nach der Entnahme von dorsalen Hautproben von euthanasierten adulten Mäusen legen Sie mit einer autoklavierten Pinzette und einem Skalpell jeweils eine dorsale Haut mit der behaarten Seite nach unten in eine dünne Petrischale und kratzen Sie das Unterhautgewebe, einschließlich des Fettes, von der ventralen Seite des Hautgewebes ab, bis das Gewebe halbdurchsichtig ist.

Legen Sie diese abgeschabte Haut in PBS, bis alle anderen verbleibenden Häute verarbeitet sind. Schneiden Sie dann die Hautproben mit einem Skalpell in 0,5 x 1 bis 1,5 Zentimeter große Streifen. Legen Sie die Streifen mit der haarigen Seite nach oben in eine sterile Petrischale, bevor Sie die Proben mit der haarigen Seite nach oben auf der Oberfläche eines 20 Milliliter PBS plus 2x Gentamicin-Lösung, ergänzt mit 0,25 % Trypsin, in einer 100 x 20 Millimeter großen Petrischale aus Kunststoff für 2 Stunden bei 32 Grad Celsius schwimmen lassen.

Stellen Sie am Ende der Inkubation eine sterile quadratische Petrischale aus Kunststoff mit 15 Millilitern Erntemedium in einer Neigung von 30 Grad auf und befördern Sie mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig einen schwimmenden Hautstreifen in die Schale. Halten Sie eine neue Skalpellklinge in einem senkrechten Winkel zur Haut und kratzen Sie mit ausreichender, aber nicht übermäßiger Kraft die Epidermis und die Haare von der Probe in das Medium ab.

Wenn alle Streifen abgekratzt wurden, dekantieren Sie den epidermiszellhaltigen Überstand vorsichtig in ein steriles 60-Milliliter-Gefäß mit einem 1,5-Zoll-Magnetrührstab und spülen Sie die Petrischale mit zusätzlichem Erntemedium aus, um alle verbleibenden Epidermiszellen zu sammeln.

Bringen Sie das endgültige Volumen im Glas mit frischem Medium auf 30 Milliliter und rühren Sie die epidermale Zelllösung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 100 Umdrehungen pro Minute um. Am Ende der Rührinkubation wird in einer Biosicherheitswerkbank der Rührstab entfernt und die Zelllösung durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen filtriert.

Verwenden Sie eine Pinzette und dann eine Pipette, um die Haare und das Stratum corneum-Material durch das Sieb zu drücken, um das Gewebe so zu manipulieren, dass die eingeschlossenen Haarzellen freigesetzt werden, und verwenden Sie weitere 5 Milliliter Entnahmemedium, um die verbleibenden eingeschlossenen Haarzellen in das Röhrchen freizusetzen.

- Es ist wichtig, dass die Epidermiszellen und Haare so manipuliert werden, dass die Zellen aus den Haarfollikeln freigesetzt werden.

- Bringen Sie das Gesamtvolumen im Röhrchen mit frischem Medium auf 50 Milliliter und sammeln Sie das Zellfiltrat durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 Millilitern frischem Erntemedium und etwa 20 Verreibungen mit einer 5-Milliliter-Pipette. Nehmen Sie 0,5 Milliliter der 1:20-Verdünnung und geben Sie sie in ein 2-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen.

Nach sorgfältigem Mischen der Probe werden 200 Mikroliter aus dem Mikrofugenröhrchen entnommen und vorsichtig mit einem gleichen Volumen von 0,4 % Trypanblau-Lösung gemischt. Mischen Sie diese Lösung vorsichtig dreimal und übertragen Sie die Zellen auf ein Hämazytometer zur Zählung kernhaltiger Keratinozyten.

Bewerten Sie alle dunkelblauen Zellen als nicht lebensfähige Zellen und kleine goldrosa Zellen als lebensfähige Zellen. Die Lebensfähigkeit liegt im Durchschnitt bei etwa 80 %, und die endgültige Keratinozytenausbeute pro Maus sollte etwa 30 Millionen lebensfähige Zellen betragen. Nach der Zählung werden die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation entnommen und für die Massenkultur 2 bis 4 mal 10 bis sechs lebensfähige Keratinozyten pro 35-Millimeter-Petrischale in 2 Millilitern Zellkulturmedium resuspendiert.

Für einen klonogenen Koloniebildungsassay resuspendieren Sie die Zellen bei einem 1 mal 10 bis zum dritten Keratinozyten pro 4 Milliliter modifiziertem William's E Medium mit Zusätzen und Serumkonzentration pro kollagenbeschichteter 60-Millimeter-Petrischale auf röntgenbestrahlten Schweizer Maus 3T3-Feeder-Schichten.

Für die Massenkultur züchten Sie die Kulturen bei 32 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid für den entsprechenden Zellkulturzeitraum und wechseln Sie das Medium 24 Stunden nach der ersten Aussaat für die Massenkultur und danach 3 Mal pro Woche.

Am Ende der klonalen Kultur aspirieren Sie das Medium und fixieren die Kolonien über Nacht bei Raumtemperatur in 10 % gepuffertem Formalin. Am nächsten Morgen färben Sie die Kolonien eine Stunde lang mit 0,5% Rhodamin B in autoklaviertem Wasser, bevor Sie das Geschirr mit kaltem autoklaviertem Wasser ausspülen, bis das Wasser klar ist. Kippen Sie dann die Schalen auf den Deckeln zum Trocknen, bevor Sie die Kolonien zählen.