Name: Handy Bevölkerung Analysen Während Hautcarcinogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Analyse von Zellpopulationen während der Hautcarcinogenese im Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Interaktionen bei der Entwicklung von Basalzellkarzinomen mittels Durchflusszytometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Studie wurde vom NCI (R01-R01-94160 und 155086), IU Simon Cancer Center und Wells Center for Pediatric Research unterstützt.

Diese Studie wurde von der IACUC Ausschuss an der Indiana University School of Medicine genehmigt. 1. Generieren Mäuse mit den richtigen Genotypen <ol><li> Stellen Sie eine Maus-Modell der BCC. Mate-K14-Creer Mäuse (Jackson Labor stock Nummer 005107) mit R26-SmoM2 YFP Mäusen (Jackson Labor stock Nummer 005130) (18) zu erzeugen, K14-Creer + und R26-SmoM2 YFP + Mäusen. </li><li> Führen Genotypisierung. Tauchen Schwanz Proben (0,5 cm lang) in DirectPCR Schwanz Lyse-Lösung mit 1 mg / ml Proteinase K bei 55 ° C über Nacht unter Schütteln. Am nächsten Tag entfernen Gewebedebris durch Zentrifugation bei Höchstgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge (um den Überstand für die Genotypisierung zu halten). Verwenden Sie 1 ul der Überstand für jede PCR-Reaktion mit den Primern und Bedingungen vom Verkäufer empfohlen. Wählen Sie die Mäuse mit den richtigen Genotypen (im Alter von 3-6 Wochen, Buprenorphin bei 0,05-0,1 mg / kg wird über jeden SQ 8-12 h für 2-3 Tage nach Schwanz snip angewendet werden) for Schritt 2. </li></ol> 2. Induce Expression von SmoM2 in Hautkeratinozyten Induce SmoM2 Expression in Keratinozyten durch orale Gabe von Tamoxifen (5 ug / kg Körpergewicht in 50 ml Pflanzenöl in jeder Fütterung) an 5 aufeinander folgenden Tagen per Magensonde mit einer Fütterung Nadel (20 Gauge gekrümmt). 3. Vorbereiten Hautproben Im Allgemeinen sind die Phänotypen schwereren am Ohr und Schwanz in K14creER/R26SmoM2 GFP-Mäusen. Um für die Zell-Analysen vorzubereiten, haben wir zunächst ernten die Maus Haut nach Tieropfer mit einem institutionellen genehmigten Verfahren (CO 2 plus Genickbruch). 4. Isolieren Epidermis <ol><li> Nach der Tötung Mäuse mit einem genehmigten Verfahren (siehe Schritt 3), zu entfernen Fell mit einem Trimmer. Tauchen Hautproben in Dispase-Lösung (5 mg / ml in DMEM mit 10% FBS) bei 37 ° C für 1-2 h (1 h bei Mäusen weniger als 8 Wochen alt und 2 hfür Mäuse alt als 8 Wochen). </li><li> Nach Dispase Behandlung, separate Epidermis Dermis von Pinzette. </li></ol> 5. Generieren Einzelzellen <ol><li> Um einzelne Zell-Population zu erhalten, Hackfleisch Epidermis durch Schere und dann eintauchen in Collagenase IV-Lösung (1 mg / ml in DMEM mit 10% FBS) für 1-2 Stunden bei 37 ° C in einer 50 ml Tube. Versuchen Sie, schwenken Sie die Rohre alle 20 min zu Zelle Dissoziation helfen. </li><li> Untersuchen Zelle Dissoziation unter dem Mikroskop. Wenn einzelne Zellen in der Kollagenase Medium detektiert werden kann, Inkubieren der Probe für weitere 30 min, um die Zellausbeute zu erhöhen. Im Allgemeinen kann die Epidermis von einer Maus Ausbeute bis zu 10 7-Zellen. </li><li> Filtern Sie die Mischung durch Gewebe Zellsieb (Porengröße 70 um), Spin-Zellen nach unten bei 1500 rpm über Tischgerät Zentrifugation und waschen einmal Zeit mit PBS. </li></ol> 6. Label-Cells und Führen Durchflusszytometrie Analysen <ol><li> Die Zellen in 10% FBSin PBS mit 2,5 × 10 6 Zellen / ml, um die unspezifische Bindung zu blockieren (auf Eis für 30 min) </li><li> Nehmen Sie ein Aliquot der Zellen zu je 1,5 ml Reaktionsgefäße für bestimmte Antikörpermarkierung. In verschiedenen Antikörpern in jedes Röhrchen in einer Endkonzentration von 2 ug / ml. Mix Antikörper mit Zellen über eine sanfte Vertex für einige Sekunden und lassen Sie sie auf Eis für 30 min, dann waschen mit 1 ml PBS. Für BCC Proben verwendeten wir die Antikörper für folgenden Biomarker: CD11b-PE sowie GR1-APC (myeloischen Zellen oder myeloiden abgeleitete Suppressor-Zellen); Vimentin-FITC (Fibroblasten) (siehe Reagenzien für Details). </li><li> Zur intrazellulären Färbung, verwenden wir ein Kit und folgen Sie der Hersteller-Handbuches (siehe Reagenzien für Details). Wir verwenden frische Zellen Zelloberflächenmarker analysieren. Nach Oberfläche Marker Färbung, waschen Sie die Zellen, und resuspendieren sie in PBS. In DAPI dem Zellgemisch in einer Endkonzentration von 1 ug / ml. DAPI färbt tote Zellen, die ausgeblendet sein wird von der weiteren Analysen. </li><li> Analysieren Sie die Daten mit speziellc Software. Wir wählen Sie zunächst einzelne Zellen auf der Basis der FSC gegen SSC Plot, und verwenden DAPI negativen Population (live-Zellen) zur weiteren Analyse. </li></ol>

<ol><li>Rogers, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+estimate+of+nonmelanoma+skin+cancer+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States.</a> Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).</li>
<li>Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinomas%3A+attack+of+the+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).</li>
<li>Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hedgehog-signaling+pathway+in+human+cancer+and+the+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications.</a> Oncogene. 29, 469-481 (2010).</li>
<li>Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+homolog+of+patched%2C+a+candidate+gene+for+the+basal+cell+nevus+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome.</a> Science. 272, 1668-1671 (1996).</li>
<li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+patched+homolog+is+expressed+in+target+tissues+of+sonic+hedgehog+and+maps+to+a+region+associated+with+developmental+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities.</a> J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).</li>
<li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+human+homolog+of+Drosophila+patched+in+the+nevoid+basal+cell+carcinoma+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.</a> Cell. 85, 841-851 (1996).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+Smoothened+mutations+in+sporadic+basal-cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma.</a> Nature. 391, 90-92 (1998).</li>
<li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+SMOH+in+sporadic+basal+cell+carcinomas+of+the+skin+and+primitive+neuroectodermal+tumors+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system.</a> Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).</li>
<li>Lam, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+frequent+activated+smoothened+mutation+in+sporadic+basal+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas.</a> Oncogene. 18, 833-836 (1999).</li>
<li>Nilsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+basal+cell+carcinomas+and+trichoepitheliomas+in+mice+overexpressing+GLI-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).</li>
<li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+oncogenic+potential+of+Gli2%3A+deletion+of+an+NH%282%29-terminal+fragment+alters+skin+tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype.</a> Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).</li>
<li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+in+the+PTCH%2C+SMOH%2C+SUFUH+and+TP53+genes+in+sporadic+basal+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas.</a> Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).</li>
<li>Guha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+inhibitor+gets+landmark+skin+cancer+approval%2C+but+questions+remain+for+wider+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).</li>
<li>Sekulic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+vismodegib+in+advanced+basal-cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).</li>
<li>Tang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+the+hedgehog+pathway+in+patients+with+the+basal-cell+nevus+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).</li>
<li>Aszterbaum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+and+ionizing+radiation+enhance+the+growth+of+BCCs+and+trichoblastomas+in+patched+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice.</a> Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).</li>
<li>Pazzaglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+patched-associated+susceptibility+to+radiation+induced+tumorigenesis+by+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background.</a> Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).</li>
<li>Athar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+smoothened+signaling+prevents+ultraviolet+B-induced+basal+cell+carcinomas+through+regulation+of+Fas+expression+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis.</a> Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).</li>
<li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinoma+and+its+development%3A+insights+from+radiation-induced+tumors+in+Ptch1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice.</a> Cancer Res. 64, 934-941 (2004).</li>
<li>Ellis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patched+1+conditional+null+allele+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Patched 1 conditional null allele in mice.</a> Genesis. 36, 158-161 (2003).</li>
<li>Mao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+somatic+mouse+model+to+survey+tumorigenic+potential+applied+to+the+Hedgehog+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway.</a> Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).</li>
<li>Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinomas+arise+from+hair+follicle+stem+cells+in+Ptch1%28%2B%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice.</a> Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).</li>
<li>Grachtchouk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinomas+in+mice+arise+from+hair+follicle+stem+cells+and+multiple+epithelial+progenitor+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations.</a> J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).</li>
<li>Kasper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+enhances+epidermal+tumorigenesis+by+recruiting+hair+follicle+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).</li>
<li>Youssef, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cell+lineage+at+the+origin+of+basal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma.</a> Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).</li>
<li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li>
<li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70(2010).</li>
<li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li>
<li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. (49), e2561(2011).</li>
<li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+human+skin+reconstruct+model%3A+a+tool+to+study+normal+skin+and+melanoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression.</a> J. Vis. Exp. (54), e2937(2011).</li>
<li>Anacker, D., Moody, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+organotypic+raft+cultures+from+primary+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes.</a> J. Vis. Exp. (60), e3668(2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wir haben ein Verfahren zur Analyse Zellpopulation in BCCs beschrieben. Tumorgewebe sind konsistent vieler Zelltypen und jeder Zelltyp verhält sich anders zu einem bestimmten Zeitpunkt der Krebsentstehung, das ist sehr schwer, selbst zurückzuerobern unter den besten Bedingungen in vitro. Über dieses Protokoll haben wir gezeigt, dass die Entwicklung von Basalzellkarzinom durch Expansion der epidermalen Stammzellen sowie Rekrutierung von myeloischen Zellen begleitet wird. Im Vergleich mit Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz Analysen geben Zellpopulation Analysen eine quantitative Beurteilung der Zellpopulation Änderungen seit spezifischen Antikörpern zu einer Vielzahl von Zelltypen sind jetzt verfügbar. Aus diesem Protokoll werden 10 Wochen benötigt, um die Studie abzuschließen, weil phänotypische Veränderung von Geninduktion erfordert Zeit. Es ist daher wichtig, um das Experiment im Voraus planen. Für Zellisolation und Analysen können zwei ganze Tage benötigt werden. Da lebende Zellen sind für analys verwendetes, ist es wichtig, eine FACSCalibur vor der Zeit zu reservieren. Wir haben auch bekannte Probleme bei der Arbeit mit diesem Protokoll (siehe unten). Nach unserer Erfahrung sind unten gemeinsamen Probleme, die wir angetroffen: <ol><li> Schlechte Trennung der Epidermis: Dies kann durch unvollständige Dispase Behandlung (Bitte erhöhen Sie die Zeit von diapase Behandlung) oder unzureichende Dispase Lösung (Die Haut braucht, um völlig in Dispase getaucht werden) verursacht werden. Wir benutzen mindestens 5 ml Dispase Lösung für eine Maus. Das Volumen kann auf der Basis der Größe der Haut variieren. </li><li> Geringe Ausbeute von Zellzahl: Dies kann aufgrund unvollständiger Verdauung mit Kollagenase IV. Prüfen Sie bitte zuerst Kollagenasekonzentration oder Ablaufdatum. Dies kann auch durch unzureichende Menge Epidermis zurückzuführen sein. Darüber hinaus sollte Enzymverdau bei 37 ° C unter Schütteln (justieren Sie bitte Temperatur vor durchführen Verdauung) durchgeführt. </li><li> Zellklumpen: Dies ist sehr häufig für die Hautzellen (Pipette Zellenein paar Mal, nachdem sie durch Sieb (vor Zentrifugation), oder die Existenz von Mg 2 + und Ca 2 + in der Lösung (bitte verwenden Mg 2 + und Ca 2 +-freiem PBS für Zelle wash). </li><li> Zu viele tote Zellen: Dies kann eine Folge der verschlechterten Gewebe sein (bitte verwenden frische Gewebe) oder über-Verdauung (vermeiden Sie längere Inkubation mit Dispase und Collagenase IV). </li></ol> Dieses Protokoll kann mit Knochenmarktransplantation oder Gewebetransplantation, um die Zelle Herkunft zu prüfen kombiniert werden. Beispielsweise nach Transplantation von GFP-exprimierenden Knochenmarkzellen zu letal bestrahlten Mäusen ermöglicht es uns, den Beitrag von Knochenmarkzellen an Tumor-assoziierte Fibroblasten und myeloiden Zellen zu untersuchen. Ebenso können Hauttumoren in eine neue Mäusewirt an Tumor-Wirt-Interaktionen untersuchen transplantiert werden. Neben Zellpopulation Veränderungen während der Krebsentstehung zu untersuchen, wird dieses Protokoll auch den Forschern ermöglichen, zu prüfen,Effekte der medikamentösen Therapie der Zellen im Tumor Umgebung. Obwohl dieses Protokoll wurde entwickelt, um für Zellpopulation Analysen während Haut verwenden Krebsentstehung, leichten Modifikationen auch für andere Krebsarten gemacht werden. Zusammenfassend kann Zellpopulation Analysen in Mausmodellen von Hautkrebs geben uns die dynamischen zellulären Veränderungen während der Krebsentstehung, was zu einem besseren Verständnis der Zellbiologie in neoplastischen Transformation und verschiedenen zellulären Ereignissen im Transformationsprozess.

Als häufigste Form von Krebs beim Menschen wirkt Basalzellkarzinom (BCC) über 2 Millionen Amerikaner pro Jahr 1. Es gibt zunehmend Hinweise zeigen, dass abnorme Aktivierung von Hedgehog (Hh)-Signalisierung ist die treibende Kraft zugrunde BCC Entwicklung (Bewertet in 2,3). Veränderungen der Hh-Signalgebung in BCCs gehören inaktivierende Mutationen des PTCH1 4-6, gain-of-function Mutationen SMO 7-9 und aberrante Expression von Hh Weg Transkriptionsfaktoren GLI1 10 und 11 GLI2 oder seltene Mutationen inaktiviert negativer Regulator von Su (Fu ) 12. Durch all diese und andere Studien, hat Federal Drug Administration (FDA) hat vor kurzem die Verwendung von Hh-Signal-Inhibitor zur Behandlung von metastasierendem Vismodegib und lokal fortgeschrittenem BCCs 13-15 zugelassen. Trotz all dieser Erfolge 16, haben wir noch nicht verstehen, die molekularen und zellulären Mechanismen, durch die das Hh-Signal treibt carcinogenesis. Etablierung von Tiermodellen mit Gewebe-spezifische Aktivierung des Hh-Signal ist immer noch für diese Studien und für unser Verständnis von Resistenzen wichtig. Bei Mäusen weiß Wildtyp-Mäusen nicht entwickeln BCCs, auch unter hoher Dosen von Karzinogene, UV oder ionisierende Strahlung. Im Gegensatz dazu Ptch1 + / - Mäuse sind anfällig für BCC Entwicklung 17,18. Die Penetranz der BCC Entwicklung in Ptch1 + / - Mäusen über 50%, obwohl Ptch1 18,19 + / - Mäuse selten entwickeln ausgewachsenen BCCs wenn unter normalen Bedingungen gehalten. Aufgrund der embryonalen Letalität Ptch1 - / - wird gewebespezifischen Knockout von PTCH1 allgemein zur Untersuchung 20 verwendet. Darüber hinaus bedingten Haut-spezifische Expression der onkogenen SmoM2 YFP (KRT14-Creer: R26-SmoM2 YFP: R26-SmoM2 YFP oder KRT14-cre) führt zur Bildung von mehreren mikroskopischen BCCs in einem sehr frühen Alter, das einen einfachen genetischen Test für Hh-Signal zu tunwnstream von SMO 21. Es gibt drei wichtige Fragen in unserem Wissen über BCC Biologie. Erstens ist die zelluläre Herkunft des BCCs nicht ganz klar. Während einige Studien unterstützen die von Haarfollikel rühren als Stammzell-Website 22-24, Youssef et al. Den 25 lokalisiert Mäusezelllinie der Herkunft der kutanen Hh-driven Tumoren in der inter-follikulären Epidermis Region sein, nicht in den Haarfollikel , mit zellspezifischen Cre die Expression eines ROSA26 angetriebenen transgene mutante SMO zu aktivieren. Zweitens zellulären Interaktionen während BCC Entwicklung sind nicht gut verstanden. Es ist bekannt, dass Keratinozyten mit aktiviertem Hh-Signal kann zur Bildung von BCCs führen, aber auch andere zelluläre Veränderungen sind nicht gut verstanden. Darüber hinaus kann die Behandlung von Smo-Antagonisten bei Mäusen zu Resistenzen führen 26-28. So neue Targets für BCC werden dringend benötigt. Das Verständnis dieser drei Fragen erfordert Analysen der zellulären Veränderungen in Mäusen während carcinogenesis. Während mehrere Methoden zur Keratinocytenkultur, Durchflusszytometrie und Haut Stammzellisolation 29-31 veröffentlicht wurden, gibt es noch keine umfassenden Verfahren für Zellanalysen in Maus BCCs. Durch die Kombination von Methoden für die Maus-Modell der BCCs, Trennung der Epidermis, die Erzeugung von einzelnen Zellen aus Geweben und Zellen analysiert, werden wir Leser mit einer Reihe von Verfahren bereitzustellen, um Zellkommunikation, zellulären und molekularen Interaktionen während BCC Entwicklung zu studieren. Wir glauben, dass dieses Protokoll wird dem Leser, um zu sehen, wie die einzelnen Verfahren erreicht wird. Darüber hinaus stellten wir einige Daten zu veranschaulichen, was die Ergebnisse aussehen sollte und Fehlerbehebung, um den Lesern zu Schwierigkeiten bei der Durchführung dieser Verfahren zu überwinden.

<table><tbody><tr><td>DirectPCR-Lysereagenz (Schwanz) </td><td>Viagen Biotech</td><td>102-T</td><td>Store @ 4 &deg; </td></tr><tr><td>C-Proteinase K </td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td>speichern @ -20 &deg; C</td></tr><tr><td>ApliTag 360 taq Polymerase </td><td>Angewandte Biosysteme</td><td></td><td> N8080155 Lager @ -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Tamoxifen </td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td> store @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Fütterungsnadel (20 Gauge) </td><td>Fisher scientific</td><td>01-290-9B</td><td></td></tr><tr><td>Dispase </td><td>Roche Diagnostic</td><td>04942078001</td><td>aufbewahren @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Kollagenase IV </td><td>Worthington</td><td>LS004189</td><td>Lager @ -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Cell Sieb </td><td>Fisher scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b-PE </td><td>eBioscience</td><td>12-0112-81</td><td>store @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Anti-Gr1-APC </td><td>eBioscience</td><td>17-5931-81</td><td>Store @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Anti-vimentin-FITC </td><td>eBioscience</td><td>11-9897-80</td><td>store @ 4 &deg; C</td></tr></tbody></table>

handy bevölkerung analysen während hautcarcinogenese

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Krebs ist eine Entwicklung mehrstufigen Prozess mit vielen Zelltypen, einschließlich Krebs-Vorläuferzellen, Immunzellen, Fibroblasten und Endothelzellen. Jede Art von Zellen erfährt Signalisierung und funktionelle Veränderungen bei der Krebsentstehung. Die aktuelle Herausforderung für viele Krebs-Forscher ist es, diese Änderungen in jeden Zelltyp während des mehrstufigen Prozess in vivo zu sezieren. In den letzten Jahren haben die Autoren eine Reihe von Verfahren, um unterschiedliche Zellpopulationen während Hautkrebs Entwicklung mit K14creER/R26-SmoM2 YFP Mäusen isolieren entwickelt. Das Verfahren wird in 6 Teile aufgeteilt: 1) Erzeugen geeigneter Mäusen der Studie (K14creER + und R26-SmoM2 YFP + Mäusen in diesem Protokoll), 2) Induzieren SmoM2 YFP-Expression in der Haut von Mäusen, 3) Herstellung von Maus Hautbiopsie, 4) Isolieren Epidermis der Haut; 5) Herstellen einzelner Zellen aus Epidermis, 6) Kennzeichnung einzelne Zellpopulationen für die Durchflusszytometrie-Analyse.Erzeugung ausreichender Anzahl der Mäuse mit der rechten Genotyp ist der limitierende Schritt in diesem Protokoll, das kann bis zu zwei Monaten. Der Rest der Schritte zu unternehmen, ein paar Stunden bis zu einigen Tagen. In diesem Protokoll haben wir auch einen Abschnitt zur Fehlerbehebung. Obwohl wir uns auf Hautkrebs, kann dieses Protokoll modifiziert, um für andere Tiermodelle menschlicher Krankheiten anzuwenden.

Es ist bekannt, dass Mäuse nicht entwickeln Basalzellkarzinomen außer mit Hh Signal-Aktivierung. Abbildung 1 zeigt die Haut nach Phänotyp induziert die Expression der onkogenen geglättet, SmoM2 YFP. Abbildung 2 Analyse von myeloischen Zellen in normalen und Tumor-tragenden Mäusen zeigt. CD11b + Gr1 + Zellen aus Knochenmarkszellen stammen, und einige von ihnen abgeleitet Suppressorzellen myeloischen. In der normalen Situation, die CD11b + + Gr1 Zellpopulation kaum nachweisbar, wird aber in Reaktion auf eine Entzündung oder Tumor-Entwicklung zu erhöhen. Wir zeigten, dass die induzierte Expression von SmoM2YFP in Haut führt zu einer Erhöhung der CD11b + Gr1 + Zellen. Derzeit sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen diese Änderung in BCCs nicht klar. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" /> Abbildung 1. Morphological Änderungen nach SmoM2YFP Induktion in der Haut von Mäusen. Die obere zeigt ein Diagramm der Maus Genotypen. Das mittlere Feld: die K14creER + und R26-SmoM2 YFP + Maus mit Tamoxifen behandelt wurden, zeigten grob Anomalie in der Haut (rechts) sowie Haut-Tumoren in der H &amp; E Bereich (links). Die untere Platte: die Maus ohne SmoM2YFP Induktion zeigten normale aussehende Haut (rechts) und keine abnorme Morphologie in der H &amp; E Bereich (links). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" /> Abbildung 2. Flow-Analyse der CD11b + Gr1 + Zellen. Um die Änderung von CD11b + Gr1 + Zellen während der Entwicklung von Hautkrebs untersuchen, isolierten wir Einzelzellen und gefärbt mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen CD11b und Gr1. Nach der Analyse mit FlowJo, bemerkten wir einen Anstieg dieser Zellpopulation in Hautgewebe von Tamoxifen-behandelten Mäusen.

Die Karzinogenese ist ein Prozess, der Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Krebs Mikroumgebung. Um die molekularen Ereignisse sezieren, muss man verschiedenen Zellpopulationen in verschiedenen Stadien während der Entwicklung von Krebs zu isolieren. Mit einem Maus-Modell für Basalzellkarzinom, beschreiben wir ein Protokoll für die Zell-Analysen bei der Krebsentstehung.

Handy Bevölkerung Analysen Während Hautcarcinogenese

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellpopulationen im Mausmodell für das basale Hautkarzinom zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Expression des Zielgens in Mäusen induziert wird. Im zweiten Schritt wird die Epidermis aus der Mäusehaut isoliert.Nach der Erzeugung einer Einzelzell-Suspension werden die epidermalen Zellen mit spezifischen Zelloberflächenmarkern markiert. Letztendlich können Zellpopulationveränderungen während der Tumorentwicklung in der Haut mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Die Krebsentwicklung ist ein Prozess, an dem viele Zelltypen beteiligt sind.Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Forschern zu helfen zu untersuchen, wie verschiedene Zellen zur Entstehung von Hautkrebs beitragen. Diese Methode kann Einblicke in zelluläre Wechselwirkungen während der Entwicklung von Hautkrebs liefern, kann aber auch auf andere Systeme wie beispielsweise Bauchspeicheldrüsenkrebs angewendet werden. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da es ohne visuelle Beurteilung schwer ist festzustellen, wann das Experiment beendet werden sollte.Zunächst kreuzen Sie Keratin 14-CreER-Mäuse, die als K14-Mäuse bezeichnet werden, mit Rosa26-Mäusen, die das mit YFP markierte mutierte Smoothened-Gen SmoM2 enthalten und als Smo-Mäuse bezeichnet werden. Anschließend geben Sie 0,5 cm lange Schwanzproben, die von drei bis sechs Wochen alten doppelt positiven Mäusen gewonnen wurden, in eine direkte PCR-Schwanzlyselösung mit einem Milligramm pro Milliliter Proteinase K. Inkubieren Sie die Proben danach über Nacht bei 55 Grad Celsius unter Schütteln. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie das Gewebe mit maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge, um Rückstände zu entfernen.Verwenden Sie anschließend zur Genotypisierung jedes Tieres ein Mikroliter des SNAT von jeder Probe in individuellen PCR-Reaktionen mit den von dem Hersteller empfohlenen Primern und Bedingungen. Verabreichen Sie Tamoxifen mit einer gebogenen Fütterungsnadel (20 gauge) an die Tiere. Doppelt positiv für K 14 C er und ROSA 26 durch orale Gavage an fünf aufeinanderfolgenden Tagen, um die Expression von OO M zwei in den Keratinozyten zu induzieren.Im Allgemeinen sind die Phänotypen am Ohr und am Schwanz von GFP-markierten K 14 OO-Mäusen stärker ausgeprägt, um die Haut zur Zellanalyse zu gewinnen. Entfernen Sie zunächst mit einem Rasierer das Fell vom euthanasierten Tier. Anschließend wird die Mäusehaut entfernt und das Gewebe für eine bis zwei Stunden in Disbe-Lösung bei 37 Grad Celsius eingetaucht.Nach der Dispa-Behandlung verwenden Sie eine Pinzette, um die Epidermis von der Dermis zu trennen. Zerhacken Sie die Epidermis anschließend mit einer Schere. Tauchen Sie das Gewebe dann für eine bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in einer 50-Milliliter-Röhrchen in Kollagenase-Vier-Lösung ein.Vorsichtiges Schwenken des Reagenzglases alle 20 Minuten, um die Zellen zu dissoziieren. Überprüfen Sie mithilfe eines Mikroskops die Zelldissoziation, sobald einzelne Zellen im Kollagenase-Medium nachweisbar sind. Inkubieren Sie die Probe weitere 30 Minuten, um die Zellausbeute zu erhöhen.Filtern Sie die Gewebemischung anschließend durch einen 70-Mikron-Zellfilter und waschen Sie die Zellen 10 Minuten bei 500 × g und Raumtemperatur. Um die Zellen zu markieren, resuspendieren Sie das frisch gewaschene Pellet in PBS, ergänzt mit 10 % FBS, bei einer Konzentration von 2,5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Stellen Sie die Zellsuspension dann 30 Minuten auf Eis, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Danach überführen Sie Aliquots der Zellen in 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen für die spezifische Antikörperfärbung.Die Antikörper zu jedem Röhrchen in einer Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen. Die Röhrchen mehrere Sekunden vorsichtig verwirbeln, um die Antikörper mit den Zellen zu mischen, und anschließend die Röhrchen weitere 30 Minuten auf Eis stellen. Nach dem Waschen der Röhrchen mit einem Milliliter PBS die Pellets in PBS resuspendieren und dann DPI in einer Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter hinzufügen.Bei der Analyse der Daten zunächst Einzelzellen basierend auf dem Vorwärtsstreuung-gegen-Seitwärtsstreuung-Diagramm auswählen und die DAPI-positiven toten Zellen ausschließen. Mäuse entwickeln keine Basalzellkarzinome, es sei denn, die Hedgehog-Signaltransduktion wird aktiviert, wie in diesen Bildern zu sehen. Die durch Tamoxifen induzierte Expression des onkogenen Smoothened-SmM2-YFP führt zu einem Hautphänotyp, der bereits auf anatomischer Ebene bei den mit H&E gefärbten Hautpräparaten dieser Tiere erkennbar ist.Hauttumore können bei K 14 SMU-Mäusen beobachtet werden. Ohne SMU M zwei YFP-Induktion zeigte die Tierhaut durch H&E keine abnormale Morphologie. Diese Dotplots zeigen eine repräsentative Analyse myeloischer Zellen in gesunden und tumortragenden Mäusen.Die CD11b-positiven GR1-positiven Zellen stammen von myeloischen Zellen ab, von denen einige myeloide supprimierende Zellen in normalen und nicht-smuM2-YFP-induzierten Mäusen sind. Die Population der CD11b-positiven GR1-positiven Zellen ist kaum nachweisbar, nimmt jedoch als Reaktion auf Entzündung oder Tumorentwicklung zu. In K14-smuM2-Mäusen.Die induzierte Expression von smu M zwei YFP und Keratinozyten in der Haut führt zu einer Zunahme der CD 11 B positiven GR 1 positiven Zellpopulation. Diese Technik ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der Hautbiologie, eine molekulare Analyse des B-Zell-Karzinoms bei Mäusen durchzuführen.

cell-population-analyses-during-skin-carcinogenesis

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von frisch gewonnenen Melanomgewebe in primären Zellkulturen und wie Kontaminationen von Erythrozyten und Fibroblasten von den Tumorzellen zu entfernen. Schließlich beschreiben wir, wie...

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Wir beschreiben ein Protokoll zur effizienten Isolierung von hautresidenten T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien. Dieses Protokoll liefert eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Lymphozyten in der menschlichen Haut für die durchflusszytometrische Analyse und die Ex-vivo-Kultur.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Ein ideales Modell für das Studium der adulten Stammzellbiologie ist der Haarfollikel der Maus. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung verschiedener Populationen von Haarfollikeln, Stammzellen und epidermalen Keratinozyten vor, wobei die enzymatische Verdauung der Rückenhaut von Mäusen mit anschließender FACS-Analyse zum Einsatz kommt.

Isolieren von Haarfollikelstammzellen und epidermalen Keratinozyten von Dorsal Mäusehaut

Dieser Bericht beschreibt ein kubischer Protokoll voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und Proteinexpressionsmuster, wuchernden Zellen und Sebozyten auf Einzelzell Auflösung in 3D visualisieren. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien.

CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut

Ziel dieses Protokolls ist es, epidermale Keratinozyten aus der dorsalen Haut erwachsener Mäuse für eine Vielzahl nachgelagerter Anwendungen wie Molekularbiologie, Biochemie, Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und primäre In-vitro-Anwendungen (z. B. clonogene Keratinozyten).

Isolierung von Maus epidermalen Keratinozyten und ihrer In-Vitro-Clonogenen Kultur

Dieses Protokoll beschreibt, wie Hautkeratinozyten von Mausmodellen isoliert werden, mit metallmarkierten Antikörpern gefärbt werden und wie man gefärbte Zellen durch Massenzytometrie analysiert, um das Expressionsmuster von Proteinen zu profilieren, die in den verschiedenen Zellzyklusphasen von Interesse sind.

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

Das folgende Verfahren beschreibt eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der melanozytischen Tumorinitiation in der Murin-Sdorsal-Haut mit Hilfe eines gentechnisch veränderten Mausmodells. Dieses Protokoll beschreibt sowohl die makroskopische als auch die mikroskopische kutane Melanom-Annenentzündung.

Räumliche und zeitweilige Kontrolle der Murine Melanom-Initiation aus Mutant Melanocyte Stammzellen

Die zweistufige Hautkarzinogenese wird durch zwei topisch aufgetragene Chemikalien induziert. Ein Mutagen7,12-Dimethylbenz[a]anthracen) verursacht Mutationen in den epidermalen Zellen und eine kontinuierliche Anwendung des allgemeinen Wachstumsstimulators 12-O-Tetradecanoyl phorbol-13-Acetat beschleunigt die Bildung von Hautpapilloma.

Chemisch-induzierte Hautkarzinogenese Modell mit Dimethylbenz[a]Anthracen und 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetat (DMBA-TPA)

Die Kombination aus iterativem Bleaching-Extends-Multiplexity (IBEX) und einem kommerziellen Nukleotidmarkierungsassay (Click-iT EdU) ermöglicht den Nachweis und die Kategorisierung von sich teilenden Zelltypen in hochdynamischen Prozessen in fixierten gefrorenen murinen Gewebeschnitten. Darüber hinaus ermöglicht eine neuartige Open-Source-Bildverarbeitungspipeline eine Bilderfassung und -analyse mit hohem Durchsatz.

Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analyse-Workflow zur Bewertung von Hautzell-Phänotypen und Proliferationszuständen in Gewebeproben

Hier stellen wir eine Methode zur Bildgebung lebender Zellen zur Verfügung, mit der die Abstammungslinien von Keratinozyten der Passage 0 manuell verfolgt werden können und die die Erfassung von Proliferationsmetriken ermöglicht, einschließlich des Verschicksals der Zellteilung und der Zellzyklusdauer.

Live-Zell-Imaging mit Zeitrafferfotografie zur Untersuchung der Proliferationskinetik der epidermalen Keratinozyten

Hier stellen wir ein halbautomatisches Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung von Immun- und Nicht-Immunzellen in Hautschnitten unter Verwendung von SCAnED vor, einem kostenlosen ImageJ-basierten Makro zur Hautsegmentierung.

SCAnED - Ein Open-Source-Hautsegmentierungsmakro für die halbautomatische Zell- und Zellkerndetektion in epidermalen und dermalen Hautkompartimenten

Erfahren Sie die Analyse von Zellpopulationen während der Hautcarcinogenese im Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Interaktionen bei der Entwicklung von Basalzellkarzinomen mittels Durchflusszytometrie.

Handy Bevölkerung Analysen Während Hautcarcinogenese

Weitere Videos entdecken