Handy Bevölkerung Analysen Während Hautcarcinogenese

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zellpopulationsanalysen im Mausmodell von Hautkrebs-Basalzellkarzinomen durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Expression des Zielgens in Mäusen induziert wird. Im zweiten Schritt wird die Epidermis von der Haut der Maus isoliert.

Nach der Erzeugung einer Einzelzellsuspension werden die Epidermiszellen mit spezifischen Zellservice-Markern markiert. Letztendlich können Veränderungen der Zellpopulation während der Tumorentwicklung in der Haut durch durchflusszytometrische Analysen überwacht werden. Die Entstehung von Krebs ist ein Prozess, an dem viele Zelltypen beteiligt sind.

Ziel dieses Verfahrens ist es, den Forschern zu helfen, zu untersuchen, wie verschiedene Zellen zur Entstehung von Hautkrebs beitragen. Diese Methode kann Einblicke in zelluläre Wechselwirkungen während der Entstehung von Hautkrebs geben, kann aber auch auf andere Systeme wie Bauchspeicheldrüsenkrebs angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig ist zu bestimmen, wann das Experiment ohne visuelle Auswertung beendet werden sollte.

Zu Beginn wurden Ma-Keratin-14-Cree-ER-Mäuse, die als K-14-Mäuse bezeichnet wurden, mit Rosa-26-Mäusen, die das YFP-markierte mutierte geglättete Gen SMU M enthielten, das als SMU bezeichnet wurde. Mäuse. Tauchen Sie anschließend 0,5 Zentimeter lange Schwanzproben, die von drei bis sechs Wochen alten doppelt positiven Mäusen geerntet wurden, in eine direkte PCR-Schwanzlyselösung mit einem Milligramm pro Milliliter Proteinase K. Am nächsten Tag schleudern Sie das Gewebe mit Höchstgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge, um Ablagerungen zu entfernen.

Um dann jedes Tier zu genotypisieren, verwenden Sie einen Mikroliter des SNAT von jeder Probe in individuellen PCR-Reaktionen mit den Primern und Bedingungen, wie vom Anbieter empfohlen. Verwenden Sie eine gebogene 20-Gauge-Fütterungsnadel, um Tieren Tamoxifen zu verabreichen. Doppelt positiv für K 14 C er und ROSA 26 durch orale Sonde an fünf aufeinanderfolgenden Tagen, um die Expression von OO M zwei in den Keratinozyten zu induzieren.

Im Allgemeinen sind die Phänotypen am Ohr und am Schwanz von GFP-markierten K 14 OO-Mäusen schwerwiegender, um die Haut für die Zellanalyse zu gewinnen. Verwenden Sie zunächst einen Tremor, um das Fell des eingeschläferten Tieres zu entfernen. Entfernen Sie dann die Maushaut und tauchen Sie das Gewebe für ein bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in Disbe-Lösung.

Verwenden Sie nach der Dispa-Behandlung eine Pinzette, um die Epidermis von der Dermis zu trennen. Verwenden Sie nun eine Schere, um die Epidermis zu zerkleinern. Tauchen Sie dann das Gewebe für ein bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in ein 50-Milliliter-Röhrchen in Kollagenase-Vier-Lösung.

Schwenken Sie den Schlauch alle 20 Minuten vorsichtig, um die Zellen zu dissoziieren. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Zelldissoziation zu bestätigen, wenn einzelne Zellen im Kollagenasemedium nachgewiesen werden können. Inkubieren Sie die Probe weitere 30 Minuten, um die Zellausbeute zu erhöhen.

Filtrieren Sie dann die Gewebemischung durch ein 70-Mikron-Zellsieb und waschen Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 500-facher G- und Raumtemperatur, um die Zellen zu markieren, beginnen Sie mit der Wiederbelebung, wobei Sie das gerade gewaschene Pellet in PBS suspendieren, das mit 10 % FBS bei 2,5 mal 10 der sechs Zellen pro Milliliter ergänzt wird. Legen Sie dann die Zelllösung 30 Minuten lang auf Eis, um eine unspezifische Bindung zu blockieren. Als nächstes werden die Aliquote der Zellen für die spezifische Antikörpermarkierung in 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen überführt.

Zugabe der Antikörper zu jedem Röhrchen in einer Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter. Wirbeln Sie die Röhrchen einige Sekunden lang vorsichtig ein, um die Antikörper mit den Zellen zu vermischen, und legen Sie die Röhrchen dann für weitere 30 Minuten wieder auf Eis. Nachdem Sie die Röhrchen in einem Milliliter PBS gewaschen haben, resuspendieren Sie die Pellets in PBS und fügen Sie dann DPI in einer Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter hinzu.

Bei der Analyse der Daten wählen Sie zunächst einzelne Zellen basierend auf dem Streudiagramm "Vorwärtsstreuung versus Seite" aus, wobei die positiven toten Zellen von DABI ausgeschlossen werden. Mäuse entwickeln keine Basalzellkarzinome, es sei denn, die Igel-Signalgebung ist aktiviert, wie in diesen Bildern zu sehen ist. Die Tamoxifen-induzierte Expression des onkogenen, geglätteten glatten M zwei YFP führt zu einem Hautphänotyp, der auch auf der wachstumsanatomischen Ebene in den hautgefärbten Proben dieser Tiere sichtbar ist.

Hauttumoren können bei K 14 SMU-Mäusen beobachtet werden. Ohne SMU M zwei YFP-Induktion zeigte die Tierhaut keine abnormale Morphologie bei h und e. Die Färbung dieser Dot Plots zeigt eine repräsentative Analyse von myeloischen Zellen in normalen und tumortragenden Mäusen.

Die CD 11 B positiven GR one positiven Zellen stammen von myeloischen Zellen ab, von denen einige myeloische Suppressorzellen in normalen und nicht-smu M zwei YFP-induzierten Mäusen sind. Die CD 11 B positive GR one positive Zellpopulation ist kaum nachweisbar, nimmt aber als Reaktion auf Entzündungen oder Tumorentwicklung zu. In K 14 SMU-Mäusen.

Die induzierte Expression von smu M, zwei YFP und Keratinozyten in der Haut führt zu einer Zunahme der CD 11 B-positiven GR und einer positiven Zellpopulation. Diese Technik wird es Forschern auf dem Gebiet der Hautbiologie ermöglichen, molekulare Analysen von B-Zell-Karzinomen bei Mäusen durchzuführen.