Name: Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-28T17:33:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Immunfluoreszenzmethode zur Quantifizierung von γH2AX-Foci in Mäusegeweben. Dieses Protokoll ermöglicht die sensitive Detektion von DNA-Doppelstrangbrüchen in vivo und die Bewertung von Strahlenschäden.

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Die Unterstützung des Australian Institute of Nuclear Science and Engineering anerkannt wird. TCK war der Empfänger der AINSE Auszeichnungen. Epigenomischen Medicine Lab wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (566559) unterstützt. LM wird von Melbourne Research (University of Melbourne) und Biomedical Imaging CRC zusätzliche Stipendien unterstützt. Die Unterstützung der Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody und Iska Carmichael) war von unschätzbarem Wert für diese Arbeit. MMT ist dankbar für die Unterstützung von Experten und Beratung von Dr. Olga Sedelnikova von den National Institutes of Health.

Gewebe <ol><li> Lungengewebe, in Formen im optimalen Schneid-Temperatur (OCT)-Verbindung 4583 eingebettet ist, wurde geschnitten (5 um) mit einem CM Leica 1950 Kryostat montiert und auf Poly-L-Lysin-Slides. </li></ol> Die eingefrorenen Proben wurden von Dr. Simon Royce an der Murdoch Children Research Institute erhalten. Lungengewebe wurde aus unbehandelten Balb / c Mäusen und von einem Mausmodell für chronische allergische Atemwegserkrankungen, die viele der pathologischen Merkmale der menschlichen Asthma 6 zeigt gewonnen. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Animal Ethics Committee der Murdoch Children Research Institute, die den Australian Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren zu wissenschaftlichen Zwecken haftet gesetzt durchgeführt. <ol start="2"><li> Die Schnitte wurden an der Luft getrocknet bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li></ol> Immunfluoreszenzfärbung <ol><li> Die Schnitte wurden mit 2% (w / v) Paraformaldehyd in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 20 Minuten fixiert. </li><li> Die Schnitte wurden äquilibriert mit zwei Waschungen in PBS für jeweils 15 Minuten. </li><li> Die Schnitte wurden mit 70% Ethanol (gekühlt auf -20 ° C) für 20 Minuten durch drei Waschungen in PBS für jeweils 10 Minuten behandelt, gefolgt. </li></ol> An dieser Stelle Dias können in verschlossenen Behältern bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen gelagert. <ol start="4"><li> Die Schnitte wurden dreimal mit PBS gewaschen für jeweils 10 Minuten und dann mit 100 &amp;mgr; l frisch in PBS hergestellt, die 8% BSA in PBS mit 0,5% Tween-20 und 0,1% blockiert Triton X-100 (PBS-TT) für 1 Stunde bei Raumtemperatur . Alle Inkubationen wurden in einem befeuchteten Färbetrog durchgeführt. </li><li> Die Schnitte wurden mit PBS-TT für 5 Minuten gewaschen und einem hydrophoben Umfang wurde um das Gewebe mit einem Pap-Stift markiert. </li><li> Überschüssige Puffer wurde gekippt off und 100 &amp;mgr; l der primären polyklonalen Kaninchen-anti-γH2AX Antikörper (1:500 verdünnt in 1% BSA in PBS; Millipore) wurde zu jedem Abschnitt, um eine 2-stündige Inkubation bei Raumtemperatur zugegeben. Inkubation mit Primär-Antikörper kann über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden Für weitere Hinweise, dass γH2AX Brennpunkte darstellen DSBs kann ein primärer Antikörper Erkennung eines DSB-Reparatur-Protein verwendet werden. Zum Beispiel ist Co-Lokalisation von γH2AX und phospho-ATM eine häufig verwendete Kombination. </li><li> Die Schnitte wurden zweimal in PBS-TT gewaschen für jeweils 5 Minuten inkubiert und mit 100 &amp;mgr; l des sekundären Antikörper (Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen IgG 1:500 verdünnt in 1% BSA; Invitrogen) für 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln . (Verwässert Antikörper wurde in der Dunkelheit während des gesamten Verfahrens aufbewahrt). </li><li> Die Schnitte wurden dreimal mit PBS-TT gewaschen für jeweils 5 Minuten inkubiert und mit 0,5-Promillegrenze RNAse A für 30 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Nuclear Gegenfärbung und Montage wurde mit Vectashield Medium mit Propidiumiodid durchgeführt. </li><li> Die Objektträger wurden mit Nagellack versiegelt und über Nacht bei 4 ° C in der Dunkelheit vor der Analyse gelagert. </li></ol> Mikroskopie / Analysis <ol><li> Ein Zeiss LSM510 Meta konfokale Mikroskop wurde verwendet, um Bilder mit dem Standard-GFP zu erwerben (für γH2AX - Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen-IgG) und PI (543 nm)-Laser. </li></ol> Die Bilder wurden in einer Z-Serie Muster mit einer Schrittweite von 0,5 mu m erworben. Bei der Analyse wurden die einzelnen Ebenen zerlegt und gestapelt, um eine maximale projizierte Bild zu erzeugen, um die Überlappung der Herde zu minimieren. Die Methode der Erstellung einer maximalen projizierten Bildes vor einer Partikelzahl sollte nur in Fällen, in denen ein dünner Schnitt (z. B. 5 um) verwendet wird und wo die Hintergrundfärbung ist unbedeutend verwendet werden. Wo dickeren Abschnitte mit einer bedeutenden Hintergrund analysiert werden müssen, sollte eine komplexere Analyse, wie 3D-Objekt Zähler wie Bolte und Cordelières (2006) beschriebenen 7 verwendet werden. <ol start="2"><li> Metamorph (Molecular Devices, USA) wurde verwendet, um verschmolzen (rot und grün) Bilder zu schaffen, die Zahl der Herden zu quantifizieren. </li></ol> Obwohl Metamorph kann verwendet werden, um Schwerpunkte Zahlen quantifizieren, typischerweise bei der Verwendung von Gewebeschnitten Schwerpunkte sind manuell (vom Auge) für eine höhere Genauigkeit gezählt werden. Spezifische Zelltypen von Interesse für die Quantifizierung gewählt werden, zum Beispiel Lungen-Epithelzellen. Dies kann auf der Grundlage der Histologie und mit Bezug auf Hämatoxylin und Eosin gefärbt Schnittserien durchgeführt werden.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+residual+gamma-H2AX+foci+in+murine+skin+are+dose+responsive+and+predict+radiosensitivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo.</a> Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+as+a+biomarker+of+DNA+damage+induced+by+ionizing+radiation+in+human+peripheral+blood+lymphocytes+and+artificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Space+Res%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin.</a> Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).</li>
<li>Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+airway+remodeling+in+acute%2C+subacute%2C+and+chronic+models+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).</li>
<li>Bolte, S. &amp, Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
</ol>

Für den Zweck dieser Demonstration haben wir genutzt Maus Lungengewebe aus unbehandelten Balb / c Mäusen und von einem Mausmodell einer chronischen, allergischen Atemwegserkrankungen. Wir quantifiziert Unterschiede in der Zahl der Herde pro Zelle mit leicht höheren Durchschnitt in der geschädigten Lunge im Vergleich zu unbehandelten Abschnitten beobachtet. Insbesondere angegeben Quantifizierung 6,5 Foci pro / Zelle und 9,4 Foci pro / Zelle (manuelle Zählung von 20 Zellen pro Abschnitt), in der unbehandelten Gewebe und c...

<table><tbody><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA (1 %) dient zur Blockierung unspezifischer Antikörperbindungen. Primäre und sekundäre Antikörper werden in BSA verdünnt.</td></tr><tr><td>PBS (ohne Ca)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; und Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT)-Verbindung 4583</td><td></td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Polysin-Slides</td><td>Menzel-Glaser</td><td>SF41296SP</td><td>Elektrostatisch anziehend für gefrorene Gewebeschnitte und verringert die Notwendigkeit zusätzlicher Beschichtungen und Klebstoffe.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Reagenz</td><td>Calbiochem</td><td>655205</td><td>Tween 20 (0,5 %) ist ein Detergens zur Permeabilisierung von Zellen</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0,1 %) zur Permeabilisierung von Zellen verwendet.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-&amp;#947;H2AX (Kaninchen polyklonaler Antikörper)</td><td>Primärantikörper</td><td>Upstate, Millipore</td><td>07-164</td><td>Verdünnung des Primärantikörpers (1:500) in 1% BSA.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)</td><td>Sekundärantikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>Verdünnung des sekundären Antikörpers (1:500) in 1 % BSA.</td></tr><tr><td>Ethanol (70 %)</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>BSPEL316</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Reagenz</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield PI</td><td>Reagenz</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1300</td><td>Ein auf Glycerin basierendes Eindeckmedium, das Propidiumiodid (eine rote Kernfärbung) enthält. Dieses Medium muss mit einer ölgetauchten Linse verwendet werden, deren Brechungsindex mit dem des Mediums übereinstimmt.&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Hinweis: Häufig verwendeter DNA-Farbstoff: 4,6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI). Kann nur mit Mikroskopen mit geeignetem Anregungslaser verwendet werden.</td></tr><tr><td>Mini PAP-Stift</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (22x50 mm)</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-Becher, Glas</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Färbebad</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Konfokalmikroskop</td><td></td><td>Konfokales Mikroskop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM Leica 1950 Kryostat</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Software zur Bildanalyse</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die quantifizierung der γh2ax foci in gewebeproben

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind besonders tödlich und gentoxische Läsionen, die entweder entstehen können durch endogene (physiologischen oder pathologischen) Prozesse oder durch exogene Faktoren, insbesondere ionisierender Strahlung und Radiomimetikums Verbindungen. Die Phosphorylierung der H2A Histon-Variante H2AX, bei der Serin-139-Rest, in der hoch konservierten C-terminalen SQEY Motiv bilden γH2AX, ist eine frühe Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche<sup&gt; 1</sup&gt;. Diese Phosphorylierung Veranstaltung wird von der Phosphatidyl-inosito-3-Kinase (PI3K)-Familie von Proteinen, Ataxie Teleangiektasien mutiert (ATM), DNA-Protein-Kinase-katalytischen Untereinheit und ATM und Rad3 Zusammenhang vermittelt (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Insgesamt DSB Induktion führt zur Bildung von diskreten nuklearen γH2AX Herde, die können leicht erkannt und quantifiziert durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie<sup&gt; 2</sup&gt;. Angesichts der einzigartigen Spezifität und Sensitivität dieses Markers, die Analyse der γH2AX Brennpunkte hat zu einer breiten Palette von Anwendungen in der biomedizinischen Forschung geführt, besonders in der Strahlenbiologie und Nuklearmedizin. Die Quantifizierung von γH2AX Foci wurde am häufigsten in der Zellkultur-Systeme im Rahmen der ionisierenden Strahlung induzierte DSBs untersucht. Abgesehen von zellulären Strahlenempfindlichkeit haben Immunfluoreszenz basierte Assays auch verwendet worden, um die Wirksamkeit von Strahlen-modifizierende Verbindungen zu bewerten. Darüber hinaus hat γH2AX als molekulare Marker eingesetzt, um die Wirksamkeit verschiedener DSB-induzierenden Verbindungen zu untersuchen und ist vor kurzem als wichtiger Marker des Alterns und der Krankheit angekündigt, insbesondere Krebs<sup&gt; 3</sup&gt;. Weitere, Immunfluoreszenz-basierten Methoden müssen angepasst Erkennung und Quantifizierung von γH2AX Schwerpunkte angepasst<em&gt; Ex vivo</em&gt; Und<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 4,5</sup&gt;. Hier zeigen wir ein typisches Immunfluoreszenz Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von γH2AX Herde im Maus-Gewebe.

Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrangbrüche auf der Grundlage γH2AX Brennpunkten hat sich zu einem wertvollen Werkzeug, vor allem in der Strahlenbiologie, für die Auswertung von Gewebe Strahlenempfindlichkeit und die Auswirkungen der Strahlung modifizierende Verbindungen. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Brennpunkte in Gewebeproben.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

DNA-Doppelstrandbrüche (DSBs) sind besonders letale und genotoxische Läsionen, die entweder durch endogene (physiologische oder pathologische) ...

Hallo, mein Name ist Michelle Tang aus den Laboren für Epigenomische Medizin und Humangenetik. Diese werden geleitet von Dr. Tom Carianne, einem außerordentlichen Professor am ASAM Holster des Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Heute werde ich einen Gamma-H2AX-Immunfluoreszenz-Assay zur Bestimmung der Menge an DNA-Schäden in erkranktem Gewebe in vivo demonstrieren.H2AX ist eine Histonvariante, die etwa zwei bis 10 % des gesamten Histon H2A im Zellkern ausmacht und schnell auf Serin 139 in Säugetierzellen phosphoryliert wird. Als Reaktion auf DNS-Schäden wird die phosphorylierte Form von H2AX auch als Gamma-H2AX bezeichnet. Es wurde nachgewiesen, dass eine direkte Korrelation zwischen der Anzahl von Doppelstrangbrüchen und Gamma-H2AX besteht. Gamma-H2AX ist ein empfindlicher molekularer Marker und hat sich als früher Indikator für Doppelstrangbrüche erwiesen. Daher ist es eine nützliche Methode, um DNS-Schäden nachzuweisen.Gamma H2AX kann unter der fluoreszierenden Mikroskopie als nukleäre Foci an den Stellen von DNA-Schäden sichtbar gemacht werden. Für die Zwecke dieses Experiments verwende ich Maus-Lungengewebe, das von Dr. Simon Royce vom Murdoch Children's Research Institute stammt. Ich werde DNA-Schäden in Lungengewebe aus einem Mausmodell einer chronischen allergischen Atemwegserkrankung untersuchen, das viele der pathologischen Merkmale des menschlichen Asthmas aufweist, einschließlich einer Hyperreagibilität der Atemwege, einer Umbildung der Atemwege und einer Entzündung der Atemwege.Beginnen wir also das Experiment. Zunächst geben wir die Proben für etwa 20 Minuten in den Kryostaten, um sie auf minus 20 Grad Celsius abzukühlen. Für optimale Schneidetemperaturen werden SRO-Mikroskopobjektträger verwendet, damit die Gewebeschnitte nicht von den Objektträgern abgelöst werden.Während der immunfluoreszenzfarblichen Färbung wird OCT verwendet, um die Proben am Spannfutter zu befestigen, und das Spannfutter auf den Schneidblock zu setzen, wobei sichergestellt werden muss, dass es sicher befestigt ist. Stellen Sie den Kryostaten so ein, dass er fünf Mikrometer dicke Gewebeschnitte schneidet, und beginnen Sie vorsichtig mit dem Schneiden, wobei Sie die Proben mit einem Pinsel zu sich heranziehen. Halten Sie den Objektträger über die Schnitte, die an der Glasoberfläche haften sollten. Lassen Sie die Schnitte eine Stunde lang bei Raumtemperatur trocknen, um sicherzustellen, dass vor dem Weiterarbeiten jegliche Feuchtigkeit entfernt ist.Zunächst fixieren wir die Gewebeschnitte mit 2 % Paraldehyd, das in PBS ohne Calcium und Magnesium hergestellt wurde, für 20 Minuten. Überschüssiges Paraldehyd abgießen und Objektträger in ein Copeland-Gefäß zur zweimaligen Wäsche in PBS je 15 Minuten geben. Zur Permeabilisierung werden die Zellmembranproben nach dem Permeabilisierungsschritt mit 70 % Ethanol bei minus 20 Grad Celsius für 20 Minuten behandelt. Die Proben werden dreimal in PBS je 10 Minuten gewaschen.Entfernen Sie jede Stelle einzeln, um zu verhindern, dass die Gewebeschnitte austrocknen. Entfernen Sie überschüssiges PBS von dem Objektträger und blockieren Sie dann die Schnitte mit 8 % BSA in PBS, das 0,5 % zwischen 20 und 0,1 % Triton X-100 enthält, auch bekannt als P-B-S-T-T. Diese Objektträger dürfen nach den Inkubationen, bei denen die Proben fünf Minuten lang mit P-B-S-T-T gewaschen werden, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.PBS-TT wird verwendet, um das Eindringen von Antikörpern in den Zellkern zu erleichtern. Die Objektträger werden anschließend abgetupft, um überschüssiges PBS-TT zu entfernen. Mit einem Pap-Pen wird ein Kreis um die Schnitte gezogen, um die Menge der benötigten Reagenzien zu reduzieren.Es wurde ein primärer Antikörper, ein anti-phospho-gamma-H-tox-schneller polyklonaler Antikörper, verwendet. Eine Verdünnung von 1:500 wurde in 1 % BSA in P-B-S-T-T hergestellt. Diese Schnitte wurden in die feuchte Kammer gegeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.Die Primärantikörperlösung abgießen, bevor zwei Fünf-Minuten-Spülungen in P-B-S-T-T durchgeführt werden, um überschüssigen Primärantikörper zu entfernen. Die Objektträger entfernen und überschüssiges P-B-S-T-T abtupfen. Der Boden 4 88 Ziegen-Anti-Reid-IJJ-Antikörper wurde verwendet.Eine 1:500-Verdünnung des sekundären Antikörpers, hergestellt in 1 % BSA in P-B-S-T-T, wurde den Proben zugegeben. Die Schnitte werden anschließend eine Stunde in einer feuchten Kammer inkubiert, der sekundäre Antikörper abgenommen und dreimal für jeweils fünf Minuten mit N-P-B-S-T-T gewaschen, um überschüssigen sekundären Antikörper zu entfernen.Decken Sie das Copeland-Gefäß mit Aluminiumfolie ab, um während jedes Waschschritts eine Belichtung durch Licht zu vermeiden. Entfernen Sie die Objektträger und tupfen Sie überschüssiges P-B-S-T-T ab. Die Zugabe von 0,5 Milligramm pro Milliliter RNase A in PBS diente dazu, eine eventuelle cytoplasmatische Färbung zu verringern.Die Proben werden anschließend 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Nach der Inkubation wird die RNAs A abgenommen und die Proben werden kurz in P-B-S-T-T gewaschen, um zu verhindern, dass die Schnitte austrocknen. Halten Sie die Proben vor der Zugabe des Eindeckmediums in Aluminiumfolie eingewickelt.Entfernen Sie jeweils einen Objektträger und tupfen Sie überschüssiges P-B-S-T-T ab. Geben Sie Vektor-Schild-Montagemedium, das Propidiumiodid, einen roten Kernfarbstoff, enthält, über jeden Schnitt. Senken Sie dann vorsichtig ein Deckglas ab, wobei Sie versuchen, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, und entfernen Sie überschüssiges Vektor-Schild-Medium auf saugfähigem Papier.Danach polieren Sie die Ränder des Deckgläschens, um eine Versiegelung zu erreichen und zu verhindern, dass die Proben austrocknen. Bewahren Sie die Proben schließlich an einem dunklen Ort bei vier Grad Celsius auf, bis die Präparate für die Mikroskopie benötigt werden. Zur Aufnahme digitaler Bilder wurde ein Zeiss LSM 510 Meta-Konfokalmikroskop mit einem 63-mal-Ölimmersionsobjektiv verwendet, wobei ein Argon- und ein Helium-Neon-Laser bei einer Wellenlänge von 488 Nanometern für Alexa Fluor 488 und 543 Nanometern für propidiumiodidgefärbte Proben eingesetzt wurden.Jedes Feld bestand aus acht bis 15 optischen Z-Serienschnitten mit einer Schrittgröße von 0,5 Mikrometern und einer einmaligen Vergrößerung. Die Bilder werden als einzelne TIF-Dateien exportiert und mithilfe von Metamorph analysiert. Bilder, die mit dem ZES-LSM-510-Meta-Fokalmikroskop aufgenommen wurden, werden im Metamorph-Programm zur Bildanalyse und zur ersten visuellen Zählung geöffnet. Fluoreszenzbilder, die als Z-Serie aufgenommen wurden, werden entfaltet und gestapelt, um mithilfe von Maximum-Projektionsfiltern ein 2D-Bild zu erzeugen.Dies geschah, um den Verlust schwächerer Foci zu minimieren. Die maximal projizierten Bilder werden in ein Binärbild umgewandelt, und morphologische Filter wie der Top-Hat-Filter werden angewendet, um den Hintergrund zu reduzieren und die Empfindlichkeit der Foci-Detektion zu verbessern. Entsprechende Propidiumiodid-Bilder werden geladen, und die nukleären Bereiche werden identifiziert.Diese Bereiche werden betont, indem manuell Regionen um die Kerne gezeichnet werden, um die Anzahl der Foci pro Feld zu zählen. Die Regionen werden auf die Top-Hat-Bilder übertragen und Licht-Schwellwertfilter werden angewendet. Der Schwellwert wurde sorgfältig anhand des visuellen Vergleichs mit den Foci gewählt, um Hintergrundstrukturen in jedem Feld auszuschließen.Die integrierte Morpho-Analyse für die IMA wurde verwendet, um die Foci zu zählen. Alternativ können manuelle Zählungen durchgeführt werden, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Damit ist das Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll in vivo abgeschlossen, mit dem die Menge an DNA-Schäden in erkranktem Gewebe bestimmt wird.Diese Technik eignet sich für den Nachweis von DNA-Schäden, die durch verschiedene Reize verursacht werden. Am besten geeignet ist sie jedoch zur Bewertung der Reaktionen auf ionisierende Strahlung und die Strahlenempfindlichkeit. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrang Streifen mit γH2AX Bildung als einen molekularen Marker hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Strahlenbiologie. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Foci nach Exposition von Zellen gegenüber Strahlung.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

Die mikroskopische Analyse von γH2AX Herde, die im Anschluss an die Phosphorylierung von H2AX an Ser-139 in Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche zu bilden, hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Strahlenbiologie. Hier haben wir ein Antikörper gegen mono-methylierte Histon H3 an Lysin 4 als epigenetische Marker aktiv Transkription Euchromatin, um die räumliche Verteilung der Strahlung induzierten γH2AX Bildung innerhalb des Zellkerns zu bewerten.

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik zum Nachweis spezifischer DNA-Schadensreaktionsproteine, die an den Stellen von DNA-Doppelstrangbrüchen in menschlichen mononukleären Zellen lokalisiert sind. Die Proteine werden von spezifischen Primärantikörpern erkannt, die wiederum an Fluorophor-markierte Sekundärantikörper binden, die während der mikroskopischen Visualisierung fluoreszieren, was die Visualisierung der Proteine als unterschiedliche Fluoreszenzherde...

Immunfluoreszenzmikroskopie zur Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen

Zelluläre Seneszenz, der irreversible Zustand der Zellzyklusarrest, kann durch verschiedene Zellspannungen induziert werden. Hier beschreiben wir Protokolle zelluläre Seneszenz und Methoden zu induzieren Marker für Seneszenz zu beurteilen.

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

Diese Handschrift enthält ein Protokoll für die Analyse von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Die vorgestellte Methode kombiniert die quantitative Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusverteilung und Apoptose, um eine zellzyklusspezifische Auswertung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers zu ermöglichen.

Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll präsentiert die Objektträgervorbereitung und das automatisierte Scoring des γ-H2AX-Foci-Assays an peripheren Blutlymphozyten. Um die Methode und Sensitivität des Assays zu veranschaulichen, wurden isolierte Lymphozyten in vitrobestrahlt. Diese automatisierte Methode des DNA-DSB-Nachweises ist nützlich für schnelle und biologische Dosimetrieanwendungen mit hohem Durchsatz.

Eine automatisierte mikroskopische Scoring-Methode für den γ-H2AX-Foci-Assay in humanen peripheren Blutlymphozyten

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch den gleichzeitigen Nachweis von γH2AX- und 53BP1-Foci in Interphasenkernen von Bleomycin-behandelten humanen peripheren Lymphozyten dar.

Duale Immunfluoreszenz von γH2AX und 53BP1 in humanen peripheren Lymphozyten

Hier stellen wir ein einfaches und schnelles Protokoll für den Nachweis von Proteininteraktionen an DNA-Schadensstellen vor.

Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

Erfahren Sie die Immunfluoreszenzmethode zur Quantifizierung von γH2AX-Foci in Mäusegeweben. Dieses Protokoll ermöglicht die sensitive Detektion von DNA-Doppelstrangbrüchen in vivo und die Bewertung von Strahlenschäden.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

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