PiggyBac Transposon-vermittelte Geneditierung in humanen iPSCs: Ein Verfahren zur Integration von Genen von Interesse in humanen iPSCs mit dem PiggyBac Transposon-System

Beginnen Sie mit einer Suspension von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen, hiPSCs, in geeignetem Elektroporationspuffer. Es wird eine Lösung hinzugefügt, die aus PiggyBac-Transposase-kodierenden Plasmiden und Donorplasmiden besteht. Elektroporate die Mischung.

Die elektrischen Pulse permeabilisieren die Zellmembranen vorübergehend und erleichtern so die zelluläre Aufnahme von Plasmiden. Die Donorplasmide bestehen aus transposonspezifischen invertierten terminalen Repeats, ITRs, die invertierte Komplemente voneinander sind, flankiert von TTAA-Repeats, die das Zielprotein und die Antibiotikaresistenzgene umklammern.

Exprimierte PiggyBac-Transposase-Proteine erzeugen Kerben an den 3'-Enden der ITRs, die innerhalb der TTAA-Wiederholungen liegen. Die freigelegten 3'-Hydroxylgruppen greifen das Nukleotid des komplementären Strangs in der flankierenden DNA an und bilden TTAA-Haarnadeln an den Transposonenden, wodurch das Transposonkonstrukt aus dem Plasmid freigesetzt wird.

Transposasen lösen die Haarnadeln auf, um TTAA-Überhänge an den 5'-Enden des Transposon-Konstrukts zu bilden. Transposasen erzeugen außerdem Doppelstrangbrüche an der TTAA-Sequenz im Wirtsgenom. Die freigesetzten 3'-Hydroxyl-Transposonenden greifen die TTAA-Sequenz an den versetzten Enden an, was zu einer kovalenten Bindung des Transposonkonstrukts an das Wirtsgenom führt und Einzelstranglücken hinterlässt, die das Transposonkonstrukt flankieren. Diese Lücken in der Wirts-DNA werden ligiert, was zu einer stabilen Integration des Transposon-Konstrukts führt.

Behandeln Sie die hiPSCs, die auf einer mit extrazellulären Matrixproteinen beschichteten Platte mit antibiotikahaltigen Medien ausgesät wurden. Das Antibiotikaresistenzgen, das vom vorgeschalteten Promotor gesteuert wird, ermöglicht die Selektion von geneditierten Zellen.